Yöntem makalesi

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 Kasım 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfekte hücre protein herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) 0 (ICP0), bir halka tipi E3 Ubikuitin ligaz içeren acil bir erken proteindir. Ana bilgisayar kısıtlayıcı faktörler ve sonraki viral gen harekete geçirmek proteasomal bozulması için sorumludur. ICP0 bir kanonik nükleer yerelleştirme sıra (NLS) içerir. Hemen de novo sentezi sonra çekirdek girer ve anti-konak savunma fonksiyonları çekirdeğinde esas olarak yürütür. Ancak, daha sonra enfeksiyon, sitoplazma içinde yalnızca, HSV-1 enfeksiyonu sırasında bir nükleer-için-sitoplazmik translocation geçtiği öne ICP0 bulunur. Muhtemelen ICP0 translocation fonksiyonları hücre altı onun konumları göre farklı enfeksiyon aşamaları modüle ICP0 sağlar. Biyolojik işlev ve ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation düzenleyici mekanizma betimlemek için ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında kaçakçılığı izlemek için bir immünfloresan mikroskopi yöntemi değiştirildi. Bu iletişim kuralı immünfloresan boyama, confocal mikroskop düşsel ve nükleer vs. sitoplazmik dağıtım analiz içerir. Bu iletişim kuralı bir saat ders boyunca litik enfeksiyon ICP0 hareketinin niceliksel bir dokümantasyon içine çekilen kararlı duruma confocal görüntüler adapte hedeftir. Önerdiğimiz bu yöntem canlı görüntüleme teknolojisi içeren olmadan nükleer vs diğer viral veya hücresel proteinler sitoplazmik yerelleştirilmesini kantitatif analiz etmek için genelleştirilmiş.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) hafif ağır herpetik hastalığa herpes labialis, genital herpes, stromal keratit ve ensefalit gibi geniş bir dizi neden olur. Enfekte sonra Virüs sinir gangliyon hücreleri bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Zaman zaman, virüs gibi ateş, stres ve bağışıklık suppression1tekrarlayan herpes enfeksiyonu için önde gelen, çeşitli nedenlerle tarafından etkinleştirilebilir. Enfekte hücre proteindir 0 (ICP0) bir anahtar viral regülatörü litik ve gizli HSV-1 enfeksiyonu için çok önemli. Ana bilgisayar içsel/doğuştan gelen antiviral savunma2,3mücadele aşağı akım virüs genleri ile transactivates. ICP0 proteasome bağlı bozulma3için çeşitli hücre faktörler hedefleyen bir E3 Ubikuitin ligaz etkinlik vardır. Ayrıca çeşitli hücre yolları faaliyetlerini düzenleyen ve daha sonra ana bilgisayar antiviral kısıtlamaları3dengelemek için etkileşim kurar. ICP03,4,5enfeksiyon devam ederken farklı hücre altı bölmeleri bulmak için bilinir. Protein artıkları 500-5066' bulunan bir lisin/arginin-zengin nükleer yerelleştirme Uyarısı (NLS) vardır. Erken HSV-1 enfeksiyonu, de novo sentezi ICP0 hemen çekirdek alınır. Bu ilk yapısı olarak adlandırılan nükleer etki alanı 10 (ND10) bir dinamik nükleer tespit7. ICP0 E3 Ubikuitin ligaz etkinliği ND10 düzenleyici proteinler, promyelötik lösemi (PML) protein ve benekli protein 100 kDa (Sp100)8,9,10bozulması tetikler. Organizatör protein kaybı sonra ND10 nükleer ceset dağınık ve ICP0 tüm çekirdek4,11doldurmak için yayılmış.

İlginçtir, viral DNA ikileşmesi başlangıcı sonra ICP0 çekirdek kaybolur. Bu sadece bir nükleer-için-sitoplazmik translocation HSV-1 enfeksiyonu4,12içinde geçtiği öne sitoplazmada bulunur. DNA ikileşmesi şartı HSV-1 ICP04,12sitoplazmik translocation kolaylaştıran bir geç viral protein(s) potansiyel katılımı anlamına gelir. Görünüşe göre ICP0 farklı bölmeler arasında enfeksiyon sırasında kaçakçılığı ICP0 onun etkileşimlerine uzamsal-zamansal bir biçimde çeşitli hücresel yolları modüle güçlendirir ve bu nedenle koordinat ince ayar yapmak için birden fazla işlevleri arasındaki dengeyi ayarlama litik gizli HSV-1 enfeksiyonu ve13. ICP0 Çokişlevlilik ve ICP0 işlevsel etki alanları boyunca litik enfeksiyon koordinasyonu daha iyi anlamak için dikkatli bir şekilde dinamik ICP0 translocation12moleküler temeli kesmiştim. Mekanik çalışmaları daha önce bildirilen12yapmak için farklı enfeksiyon durumu confocal mikroskop altında ICP0 hücre altı yerelleştirme görselleştirmek için immünfloresan boyama yöntemi uyguladım. Ayrıca confocal yazılımını kullanarak nükleer vs. sitoplazmik dağıtımını ICP0 analiz için nicel bir protokol geliştirdik. HSV-1 enfekte hücreleri nüfusu enfeksiyon aşamaları sekmeli ve farklı biyokimyasal tedavilerin12altında ICP0 hareketinin eğilimleri analiz edildi. Burada detaylı iletişim kuralı bu belgeleri ICP0 translocation HSV-1 enfeksiyonu içinde açıklayın. Önerdiğimiz bu yöntem nükleer vs. sitoplazmik translocation canlı görüntüleme tekniği nedeniyle uygulanamaz olduğunu ne zaman canlı görüntüleme alternatif olarak hizmet verebilir diğer viral veya hücresel proteinler için eğitim için genel bir yöntem olarak kabul edilmesi yöntemi, sinyal şiddeti veya protein bereket etiketleme gibi sorunları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre tohum ve virüs enfeksiyonu

  1. Virüs enfeksiyonu önce 20-24 h 5 x 104 insan embriyonik akciğer (HEL) fibroblast hücreleri veya diğer hücreler büyüme orta (Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 ile fetal sığır takıma DMEM) 4-şey 11 mm sendeleyerek slayttaki incelenmesine tohum Serum (FBS)). %5 karbondioksit (CO2) ile 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    Not: Her şey enfeksiyon anda % 70-80 cep confluency olmalıdır.
  2. Ertesi gün, büyüme orta kaldırmak ve orta-199 virüsleri 4 – 10 pfu/hücre bir mesafeden hücrelerle bulaştırmak. Virüs bulaşan hücreleri 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Slayt kuluçka döneminde sallayarak tutun.
  3. 1 h kuluçka sonra orta-199 kaldırmak ve büyüme orta ile ek.
    Not: Bu adımda veya viral emme öncesinde farklı enfeksiyon aşamaları ile müdahale ilaç eklenebilir.
  4. Virüs bulaşan hücreleri ile çeşitli uzunluklarda enfeksiyon dönemi için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.

2. fiksasyon ve Permeabilization

  1. Uygun enfeksiyon zaman, hızlı bir şekilde enfekte hücreleri fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile 3 kez yıkayın ve taze PBS içinde hazırlanan %4 paraformaldehyde 200 μL ekleyin. Paraformaldehyde 8-10 dakika oda sıcaklığında hücreleri her kuyuya düzeltmek için hücrelerle kuluçkaya.
  2. Paraformaldehyde Aspire edin ve PBS 200 μL Wells'le için 3 kere yıkayın. Tamamen PBS 3rd yıkama sonra Aspire edin.
  3. Hücreler için 5-10 dk permeabilize için her şey için % 0,2 iyonik olmayan yüzey aktif 100 μL ekleyin.
  4. İyonik olmayan yüzey aktif Aspire edin ve PBS 200 μL Wells'le için 3 kere yıkayın.

3. immünfloresan boyama

  1. Tamamen PBS Aspire edin ve engelleme arabelleği (%1 sığır serum albumin (BSA) ve % 5 at serum PBS) 200 μL her kuyuya ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
  2. Deneysel olarak belirlenen birincil antikor (tavşan anti-ICP0 poliklonal antikor12) konsantrasyon engelleme arabellekte ekleyin ve birincil antikor 2s için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
  3. 3 kez ile 10 dk kuluçka engelleme tampon ile yıkayın. Alexa 594 Birleşik keçi Anti-tavşan ikincil antikor (engelleme arabellekte seyreltilmiş 1: 400) ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında slaytlar kuluçkaya. Sonra 10 dk aralıklarla 3 kez ile engelleme arabellek slaytlar yıkayın.
  4. Son olarak bir kez PBS kalan BSA ve at serum kaldırmak için slaytla yıkayın.
  5. Antifade montaj orta ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI slayt monte ve şeffaf oje kullanarak coverslip ile mühür için) bir damla ekleyin.

4. confocal görüntüleme

  1. Confocal mikroskopla, dalga boyu 590-650 nm Alexa 594 ve 410-520 nm DAPI için ayarlayın. Resim biçimi 1024 x 1024 ve satır ortalama 8 yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için seçin.
  2. Her şey confocal mikroskop altında 4-şey slaytta analiz. 100 X amaç altında temsilcisi hücre görüntü resim 1 ve Şekil 2gösterildiği gibi kazanmak.
  3. Çok sayıda hücre sayım için ardışık alanlar'ın altında 40 X amaç görüntülerini alın.
    Not: Her enfeksiyon her zaman noktasından 200'den fazla enfekte hücreleri birikir için 5-10 görüntüleri gerekir.
  4. Her denemede karşılaştırılmak üzere tüm örnekleri ihtiyacı için sürekli confocal parametreleri ile fotoğraf çekmek.

5. analiz nükleer vs. sitoplazmik dağıtım

  1. Açık proje confocal uygulama yazılımı ile. Hücreleri nükleer vs. sitoplazmik dağıtımı ICP0 için sekmeli gereken bir görüntü seçin.
  2. Üst menüden "Miktar" sekmesini tıklatın ve "ROIs sıralamak" Araçlar menüsünden seçin.
  3. Üst menüden "çizgi çizmek" seçerek analiz edilecek hücre arasında boyuna bir çizgi çizin.
    Not: Hem ICP0 hem de DAPI için hattı boyunca floresan yoğunluğu gösteren çubuk grafik görüntülenir. Histogram, mavi çizgili DAPI pikselleri temsil eder ve kırmızı çizgi ICP0 piksel ise çekirdek sınırı işaretler.
  4. Arka plan boyama dayanarak, ICP0 yoğunluğu her denemede ICP0 hücre altı dağıtım analiz etmek için sürekli bir eşik ayarlayın.
    1. İçinde olarak ortalama kırmızı işaret edersem Şekil 2, nükleer bölgedeki eşiğin ama mavi sınır ötesinde eşiğin, kırmızı bir işaret olarak ağırlıklı olarak sitoplazmada bulunan kategorize.
    2. Kırmızı sinyal eşiğin çekirdeği ve mavi sinyal sınır ötesinde ise, kırmızı bir işaret olarak çekirdek artı sitoplazmik yerelleştirme grubu.
    3. Kırmızı sinyal çekirdeği eşiğin ama ortalama olarak mavi sinyal sınır dışında kırmızı sinyal nükleer yerelleştirme grubu.
  5. 200'den fazla enfekte hücreleri her örnekten farklı enfeksiyon zaman ve zaman (Şekil 3) göre ICP0 hareket göstermek için çubuk grafik mezarlığına çizelgeye geçirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler temeli ve ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında ticareti Biyolojik işlevleri anlamak için biz bir immünfloresan mikroskopi yöntemi farklı enfeksiyon aşamaları, ICP0 hücre altı dağılım çözümlemek için kullanın. Şekil 1 enfeksiyon ilerledikçe farklı ICP0 yerelleştirme temsilcisi bulunduğu hücreleri gösterir. ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation ölçmek, ICP0 dağıtım çekirdeği göre üç gruba enfekte hücreleri kategorize tarafından analiz için: nükleer ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı HSV-1 ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation çalışma kullanılmaya başlanmıştır. ICP0 hücre altı HSV-1 enfeksiyonu (Şekil 1) sırasında kaçakçılığı uğrar. Büyük olasılıkla, ICP0 farklı yerlerde farklı işlevleri gerçekleştirmek için çeşitli hücre yolları ile etkileşim kurar. Bu ICP0 birden çok fonksiyonları halat çekme insan konak13ile ince ayar sağlar. Ancak, ne kadar ICP0 birden fazla işlevi uzamsal-zamansal bir şekilde koordine eder iyi araştır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz mali desteği Haidong Gu için layık bir NIH hibe (RO1AI118992) teşekkür ederim. Wayne State Üniversitesi'nde mikroskobu, görüntüleme ve sitometresi kaynakları (MICR) çekirdek tesis teknik destek için teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücreler ve virüsler
İnsan Embriyonik Akciğer fibroblastları (HEL Hücreleri)Dr. Thomas E. Shenk (Princeton Üniversitesi)ile desteklenmiş DMEM'de büyütüldüDr
. Bernard Roizman Lab
Orta
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Canlandırıcıve nbsp; 11965-092
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaF0926-500ml
Orta-199 (10x)Gibco11825-015
< güçlü > Reaktifler< / güçlü >
4 - kuyu 11 mm kademeli slaytCel-Line / Thermofisher Scientific  30-149H-SİYAH
%16 Paraformaldehit çözeltisi(w/h) Metanol içermeyenThermo Scientific28908
Triton X-100Fisher reaktifleriBP151-1C0
Sığır Serumu Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
At SerumuSigmaH1270
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)Dr. Haidong Gu lab
NaCl           Fisher BiyoreaktifBP358-212
KH2PO4                       Fisher BiyoreaktifBP362-500
KCl                         Fisher Bilimsel BP366-500
Na2HPO4                         Fisher BioreagentBP332-500
Bloke edici tampon (% 1 BSA ve% 5 At serumu ile PBS)Dr. Haidong Gu laboratuvarı
Rabiit Anti-ICP0 antikoruDr. Haidong Gu laboratuvarı
PML (PG-M3) -Fare monoklonal IgGsanta Cruz BiyoteknolojiSC-966
Alexa Fluor 594-keçi anti-tavşan IgGinvitrojenA11012
Alexa Fluor 488-keçi anti-fare IgGinvitrogenA11001
Vectashield DAPI Vektör laboratuvarları ile Mouting ortamıH-1200
Pasteur pipetFisher Marka13-678-20D
OjeSally Hansen
Ekipman< / güçlü>
Konfokal MikroskopLeica SP8
Konfokal YazılımLeica LAS X Uygulama paketi
Excel yazılımıMicrosoft Excel
HERAcell 150i CO2 inkübatörThermo ScientificSipariş kodu 51026282
HEL hücreleri, %10 FBS HSV-1 viral Stok (Suş F)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378(2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N kleer Sitoplazmik TranslokasyonHSV 1 ICP0 ProteiniProtein Trafi i AnaliziH cre Alt LokalizasyonKonfokal G r nt leme ProtokolFloresan iddeti l mDAPI N kleer BoyamaZaman Serili EnfeksiyonViral Gen Aktivasyonu

İlgili makaleler