Method Article

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

DOI:

10.3791/58506

⸱

October 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Embryology, School of Medicine, Fukushima Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hızlandırılmış görüntüleme geçirme hücre davranış analiz etmek için güçlü bir yöntemdir. Etiketleme floresan hücre sonra etiketli hücre kültüründe hareket video mikroskobu altında kaydedilir. Gelişmekte olan beyin hücre göç analiz için dilim kültür, hücre göç radyal hücre geçiş gibi dilim bölümüne paralel gözlemlemek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, sınırlı bilgi hücre göç teğet hücre geçiş gibi dilim bölümüne dikey analiz etmek için dilim kültür yönteminden elde edilebilir. Burada, gelişmekte olan piliç optik tectum geçişinde teğet hücre görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme iletişim kurallarını mevcut. Hücre çoğalmasıyla ovo içinde ve bir sonraki düz-mount kültür üzerine hücre kültür yerleştirin etiketleme bir arada yatay düzlemde geçirme hücre hareketinde tespiti sağlar. Ayrıca, bizim Yöntem, tek tek hücre davranış ve bir grup hücreyi toplu eylem uzun vadede kolaylaştırır. Bu yöntem yapının floresan etiketli mikro-aksonal uzama olmayan sinir dokusu sinir doku veya hücre deplasman dahil olmak üzere sıralı değişikliği algılamak için potansiyel olarak uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre göç çalışmanın ilerleyen canlı görüntüleme tekniği ile ilerleme. Etiketleme floresan hücre sonra etiketli hücre kültür çanak veya vivo içinde geçici hareket video mikroskobu altında kaydedilir. Sinirsel gelişim çalışmada, hücreleri geçiş veya aksonlar elongating morfolojik değişiklikleri analiz edilmiştir hızlandırılmış Imaging'i kullanma. Etkin görüntüleme için deney ve analiz amacına bağlı floresan hücre ve doku etiketleme hazırlık için uygun bir yöntem uygulamak esastır. Gelişmekte olan beyin hücre göç analiz için dilim kültür hücre göç gibi radyal hücre geçiş1,2,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Elektroporasyon Ovo içinde

  1. İfade plazmid DNA floresan yüksek konsantrasyon etiketleme için hazırlayın. DNA 200 mL bakteriyel kültürünün üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre anyon-Satım sütunları kullanarak alkalin lizis yöntemi tarafından izole et. PCAGGS-EGFP ve pCAGGS-mCherryNuc 4 µg/µL her son bir konsantrasyon, karıştırın.
    Not: Plazmid DNA arıtma endotoksin-Alerjik Elektroporasyon için tercih edilebilir.
  2. Yatay olarak 38 ° C'de % 70 bağıl nem içinde verimli tavuk yumurtası kuluçkaya.
  3. 2.5 gün sonra 18 gauge iğne ile 20 mL şırınga kullanarak yumurta sivri tarafındaki Album (yumurta akı) 5 mL or....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 kayıt başlangıcından sonra bir süre (0, 9, 18, 27 h) adlı bir düz-mount kültür görüntülenmeyecektir yüzeysel teğet geçiş gösterir. Film 1 bir 28 saat 50 dk boyunca 10 dk aralıklarının hızlandırılmış bir filmdir. Çerçeve etiketlenmemiş alanı (Şekil 3A) geçirme hücrelere çerçevenin etiketli sol alt köşesinden odaklanan için seçilir. Geçirme hücre (GFP; üst sol kapı aynası, film

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokol yüzeysel katmanları6,8' hücre göç algılamak için optimize edilmiştir. Sadece değişen Elektroporasyon (E4.5 E5.5) zamanlaması ve kültür başlangıcı ve (E6.0 E7.0) görüntüleme tarafından orta tabaka göç akışları (film 5)6,7, algılamak için geçerlidir.

Sunulan yordamı etiketleme Hücre çoğalmasıyla ovo içindedüz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser JSP'ler KAKENHI Grant numarası tarafından desteklenen 15K 06740 Y.W. için

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Malzemeler< / güçlü >
NucleoBond Xtra Midi Plus EFMACHEREY-NAGEL740422.5endotoksin içermeyen plazmid DNA saflaştırma kiti
20 ml şırıngaTERUMOSS-20ESZ
18 gauge iğneTERUMONN-1838R
Hızlı YeşilWako061-00031
100x penisilin ve streptomisinGibco15140-122
cam kılcal tüpNarishigeG-1
hücre kültürü ekiMillipore MillicellCM-ORG
LamininSIGMAL2020kültür ekinin kaplanması
poli-L-LizinPeptit Enstitüsü3075kültür ekinin kaplanması
cam alt tabakMatsunamiD11130H
Opti-MEMGibco31985-070kültür ortamı
F12Gibco11765-054kültür ortamı
fetal sığır serumuGibco12483kültür ortamı
civciv serumuGibco16110082kültür ortamı
10xHBSSGibco14065-056
mikrocerrahi bıçakCerrahi uzmanlık işbirliği72-1501
İsim<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar
Equipment
kavisli makasBİR ŞEKİLDENo.11
mikropipet işlemcisiSUTTER INSTRUMENTP97/IVF
forseps tipi elektrotBEXLF646P3x3
darbe üreteciBEXCUY21EXelektroporatör
floresan stereoskopik mikroskopLeicaMZ16F
ters floresan mikroskobuOlympusIX81
gaz kontrolörüTokkenMIGM/OL-2
sıcaklık kontrol cihazıTokai HitMI-IBC
lazer konfokal üniteOlympusFV300

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time ima....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tangential Cell MigrationChick Optic TectumTime lapse ImagingIn Ovo ElectroporationFlat mount CultureConfocal MicroscopyCell Culture InsertFluorescent LabelingNeuronal Cell MigrationParticle Tracking

Related Articles