Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay

9.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58507

⸱

24 Haziran 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Critical Care, Niguarda Hospital, 2University of Milan-Bicocca Medical School

Bu makalede

Özet

Bu konuda, insan bütün kan örneklerinin endotoksin aktivitesinin başında ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Endotoksin aktivite tahlil gerçekleştirmek için basit bir test ve sepsis ile eleştirel hasta hastalarda yararlı bir biyomarker olabilir.

Özet

Endotoksin olarak da bilinen lipopolysaccharide, gram-negatif bakterilerin temel bir bileşenidir ve sepsis ve septik şok gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır. Kritik bir hastalığa hızla gelişen bulaşıcı bir sürecin erken tanımlanması, daha hızlı ve daha yoğun bir tedavi isteyebilir, böylece potansiyel olarak daha iyi hasta sonuçlarına yol açın. Endotoksin aktivitesi (EA) assay, sistemik endotoksemi güvenilir bir biyomarker olarak başucunda kullanılabilir. Yüksek endotoksin aktivite düzeylerinin tespiti, sepsis ve septik şok hastalarında artan bir hastalık şiddetiyle ilişkili olarak tekrar tekrar gösterildi. Tahlil hızlı ve kolay gerçekleştirmek için. Kısaca, örnekleme sonra, tam kan bir kısım bir anti-endotoksin antikor ile karıştırılır ve eklenen LPS ile. Endotoksin aktivitesi, kemioluminesans ile algılandığı gibi, astar nötrofiller bağıl oksidatif patlaması olarak ölçülür. Testin çıkışı 0 ' dan (bulunmayan) 1 ' e (maksimal) ve "düşük" (< 0.4 ünite), "Orta" (0.4 – 0.59 birimler) veya "yüksek" (≥ 0,6 birimler) olarak sınıflandırılmış bir ölçekte ifade edilir. Bu yazıda EA testin uygulanması için ayrıntılı metodoloji ve mantık bildirilmektedir.

Giriş

Endotoksin olarak da bilinen Lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif (GN) bakterilerin membran yapısının önemli bir bileşenidir. Hücre duvarının yaklaşık% 10 ' unda, dış membran bütünlüğü ve homeostaz için hayati önem taşımaktadır. Dahası, bu ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık sistemi güçlü bir aktivatörü1,2.

LPS için doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin in vitro pozlama çoklu genler ifadesinde değişikliklere yol açar3. Sağlıklı insan Gönüllüleri çok küçük miktarlarda LPS yönetimi Akut sistemik inflamasyon Cascade tetikler, sepsis ve septik şok yüksek endotoksin konsantrasyonları ile ortaya çıkabilir4,5.

Sepsis hayat tehdit edici bir durumdur, Eğer hemen tanınmazsa, çoklu organ yetmezliği ve ölüme yol açabilir. Septik hastalar zamanında tedavi edilmelidir, agresif resüsitasyon ile, yeterli antibiyotik tedavisi, optimum kaynak kontrolü, ve hızlı organ destek stratejileri. Sepsis etiyolojisinin tanısı öncelikle klinik tanıma ve kültür bazlı patojen algılama6' ya dayanır. Bununla birlikte, mikrobiyal kültürlerin sonuçları 48 h 'ye kadar sürebilir ve7' ye kadar% 30 ' a kadar sonuçsuz olabilir. Erken teşhis ve müdahale daha iyi hasta sonuçlarına yol açabilir. Sepsis şüphelenilen hastalarda, kararlar genellikle fizyolojik ve biyokimyasal parametreler temelinde yapılır, endotoksemi net bir işareti olmadan.

Endotoksin aktivitesi (EA) ölçümü, tüm kandaki ticari bir tahlil ( malzeme tablosunabakın) yoluyla elde edilebilir. Hastalığın şiddetinin erken katmanlaştırılması için sistemik endotoksemi biyomarker olarak kullanılabilir, özellikle septik şok geliştirme riski olan hastalarda8. Tahlil, septik şok9olan hastalarda son zamanlarda yayınlanan çift kör randomize kontrollü klinik denemlerde Polymyxin B hemoperfüzyon tedavisine rehberlik etmek için kullanılmıştır. Kritik hasta hastalarda, MEDIC çalışması, birden fazla organ fonksiyon bozukluğu, yoğun bakım ünitesi (ıCU) konaklama süresi ve mortalite10ile ILIŞKILENDIRILECEK EA düzeylerini artırdı.

Endotoksini tespit etmek için farklı YAZIS geliştirilmiştir. Limulus Amoebocyte lysate (LAL) assay, bir jel-pıhtısı olarak, turbidimetrik, veya kromojenik test, şimdiye kadar en sık serum endotoksin tahmini için benimsenen olmuştur. Bu endotoksin, at nalı yengeç, Limulus Polyphemushemolymph koagülasyon neden yeteneği dayanmaktadır. Ancak, bu tahlil özgüllük açısından bazı sınırlamalar vardır. Özellikle, ayrıca endotoksin dışında Mikrobiyal Ürünler tarafından aktive edilebilir, mantar hücre duvar bileşenleri gibi, ve çeşitli insan Plazma proteinleri tarafından engellenmiş olabilir11.

Son on yıl içinde EA ölçümü gelişen endotoksemi biyomarker olarak geliştirilmiştir ve doğrulandı. LAL testi ile karşılaştırıldığında, EA daha hızlı ve klinik ortamda uygulanması daha kolaydır. Dahası, her ikisi de in vitro ve in vivo12, artan duyarlılık ve özgüllük ile, tüm kanda Lal daha doğru olduğu gösterilmiştir.

GN bakterilerinin sepsis nedensel ajanlar olarak hızlı tanımlanması için erken teşhis aracı olarak ilk uygulanmasına rağmen, EA seviyesi de hastalık şiddetinin biyomarker olarak incelenmiştir. Bu bağlamda, septik şok veya kardiyo sonrası tutuklanma sendromu13gibi devam eden kritik hastalık nedeniyle hipoperfüzyon durumunu değerlendirmek için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. Daha yakın zamanda, hemofurasyon sistemlerinin gelişimi nedeniyle, olumlu bir EA sonucu da bu tür terapi için potansiyel adaylar doğru belirlemek için bir tarama aracı olarak önerilmiştir14. Son zamanlarda 107 yılında septik şok olan hastalarda EA 'nın erken yüksek düzeylerinin prevalansı ve klinik önemi hakkında gözlemsel retrospektif bir çalışma gerçekleştirdik. Diğer son sonuçlara göre, EA 'nın septik şok olan hastalarda hastalığın şiddetinin umut verici bir belirteci olduğunu bulduk15.

Bu yazının amacı, EA tahlil işlemini, baş ucunda ya da laboratuarda gerçekleştirme yöntemini tarif etmek ve septik şok temsili senaryosunda potansiyel kullanımını açıklamak. Bu teknik, bir anti-endotoksin antikor ve LPS kompleksler tarafından kendi astar aşağıdaki nötrofiller gelişmiş oksidatif patlama ölçerek LPS etkinliğini algılayabilir. Artmış solunum patlaması bir kemiluminometre ile tespit edilir ve yayılan ışık miktarı kan örneğinde endotoksin miktarına orantılı olarak kabul edilir. Tahlil birkaç reaktifler gerektirir, yaklaşık 30 dakika gerçekleştirmek için alır ve tüm kan 40 μL kadar az kullanır12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol, insan biyoörneklerinin işlenmesi ile ilgili kurumsal yönergelere göre ve klinik laboratuvarımızın mevcut standart operatif prosedürlerini takiben gerçekleştirilir. Test edilen hastaların EA verilerinin ve klinik bilgilerinin kullanımı, kurumunuzun insan Araştırma Etik Komitesinin yönergelerini takip eder.

1. laboratuar ekipmanları ve tahlil kiti Içeriği

  1. EA setini kullanımda değilken 2 – 8 °C ' de saklayın.
  2. Her EA testi 5 farklı çeşit tüpten oluşur; her birini testin farklı bir bölümü için kullanın (bkz. Bölüm 2).
    1. Belirli bir antikor yokluğunda hastanın nötrofiller non-spesifik oksidatif patlama bazal etkinliğini ölçmek için tüp #1 ("kontrol" tüp) kullanın.
    2. LPS-Antibody kompleksine yanıt olarak oksidatif patlaması ölçmek için tüp #2 ("örnek" tüp) kullanın.
    3. Endotoksinin fazlasına yanıt olarak hastanın nötrofiller maksimal oksidatif patlaması ölçmek için tüp #3 ("Max" tüp) kullanın.
    4. Eksojen endotoksin kaynağı olarak tüp #4 ("LPS" tüpü) kullanın.
    5. Kan depolama için tüp #5 ("aliquot" tüp) kullanın.
      Not: Tüpler #1, #2 ve #3 kopyaları, test edilen her kan örneği için kullanılmak üzere toplam 8 tüp için sağlanır (EA reaktif şişesi ve kalite kontrol testi bir poşetin içerdiği tüm testler için kullanılabilir).
  3. EDTA antikoagülan içeren steril tüplerde hasta kan örneklerini toplayın. EA testini çalıştırmadan önce kan örneklerini oda sıcaklığında saklayın.
  4. Test başlamadan önce, kemiluminometre ve kuluçagör Shaker açın. 37 ° c sıcaklığına kadar ısıtıcıyı ısınır.
  5. İdeal olarak, kan koleksiyonundan 30 dakika içinde numuneyi işlemeye başlayın.

2. endotoksin aktivite tahlil

  1. Test etmeniz gereken her hastanın kan örneği için EA test tüplerini hazırlayın. Tüpleri tüp rafları içine koyun. Sonra kapakları çıkarın.
  2. Bir combipipette kullanarak, bir 1 mL hacim EA reaktiği şişe tüpler içine #1 (kontrol tüpü), #2 (örnek tüp) ve #3 (Max tüp), her biri yinelenen.
    Not: Çözeltinin geri sıçramasını önlemek için tüpün yan tarafındaki pipet.
  3. Hasta kan örneğini hafifçe 20 kez kan toplama tüpünün tersine çevirerek karıştırın. Sonra, pipet 0,5 mL hasta kanı tüp #4 (LPS maks tüp) ve tüp #5 (aliquot tüp). Vortex tüp 10 s için #4.
  4. Tüp rafları tüm EA test tüpleri ile inküvatör Shaker koyun. Kapağı kapatın ve 37 °C sıcaklıkta 10 dakika boyunca inküye yapın.
  5. Kapağı açın ve boru rafları kuluçlağının çalkalayıcı çıkarın. Vortex tüp #5 (aliquot tüp). Steril bir uç kullanarak, pipet 40 #1 ve #2, çoğaltır.
  6. Vortex tüp #4 (LPS tüp). Aynı Pipet ucunu kullanarak, boru #4 boru #3 (maks tüp), çoğaltır, pipet 40 μL kan.
  7. Altı final test tüpü Vortex (#1, #2, #3 ve ilgili kopyaları), sonra onları geri onların raflar içine yerleştirin.
    Not: Tüm tüpler aynı miktarda zaman için vortekslenir emin olun.
  8. Tüp raflar geri inkükülasyon shaker içine koymak ve kapağı kapatın. 100 RPM 'de inküden çalkalayıcı ayarlayın, sonra 14 dakika hareket başlatın.
  9. EA etiketli çip kartını kemiluminometreye takın ve Başlat 'a basın. 14 dakika kuluçdak sonra, doğru sırada EA tüpleri okumak için kemiluminometre görüntülenen talimatları izleyin.
  10. Her tüpü, kemiluminometrenin örnek tutucusuna yerleştirmeden önce 10 s için hafifçe yerleştirin. Örnek çekmeceyi açın ve örnek tutucuya tüp #1 yerleştirin. Ardından, örnek çekmeceyi kapatın ve bağıl ışık ünitesi (RLU) okuması için bekleyin.
  11. Tüp 2 ve Tüp 3 için 2,10 adımı yineleyin.
  12. Yinelenen Tüpler 1, 2 ve 3 için 2,10 adım yineleyin.
    Not: Adım 2.10 – 2.12 sırasında aynı miktarda zaman için tüm tüpler Vortex deneyin.
  13. Tüm tüpler işlendikten sonra, EA sonuçlarının otomatik olarak hesaplanacağını ve yazdırıldığını unutmayın. Seviyeleri EA birimleri olarak ifade edilir ve aynı örneklerden yinelenen belirleyici ortalama temsil eder.
  14. Test edilmesi gereken her kan örneği için 2,13 2,2 adımları yineleyin.
  15. Tahlil tamamlandıktan sonra, kalan test tüplerini ve EA reaktiflerini 30 güne kadar 2 – 8 °C ' de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

72 yaşındaki bir adam, akademik bir kentsel hastanenin acil servise (ED) kabul edildi. Birkaç gün önce onun birincil bakım Doktoru idrar üzerine yanma şikayet sundu. Oral fosfomiyisin kısa kurs tedavisi tavsiye edildi. Onun tıbbi geçmişi hipertansiyon, karmaşık olmayan tip-2 diyabet ve benign prostat hiperplazisi dahil. İlaçları enalapril, atorvastatin, tamsulosin ve metformin dahil.

ED 'de, uyanmış olduğunda karıştı. Sıcaklık 3...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Septik şok halen günümüzde% 40 kadar yüksek bir mortalite ile ilişkilidir, ancak bu oran kabul edilen raporlara göre değişir16. Yeni ve daha iyi biyomarkerlere olan ihtiyaç, klinisyenler erken teşhis, daha iyi yönetim ve septik şok6olan hastaların prognostikasyonunda yardımcı olmak amacıyla alanlarda çoğu uzman tarafından savunulmuş.

Bir EA testi yapmak, önceki teknik bilgi veya sofistike laboratuvar ekipmanlarını gerektirmez ve herhangi bir sağl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Estor SpA, derginin yayın ve video üretim ücretinin maliyetini ele aldı. Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.

Teşekkürler

Biz Paolo Braganò ve Lisa Mathiasen, Ph.D. tahlil protokol metodolojisi gözden geçirilmesi için teşekkür ederiz. Dario Winterton, MD Ingilizce dil yeterlilik için el yazması gözden önemli yardım sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EAA kitiSpektral Medikal A.Ş.EAAST-20Paketi, 20 test + 1 kalite kontrol
Akıllı Hat TLBertholdEAASLLuminometre
İnkübatör çalkalayıcıGRANTES-20Mini inkübatör çalkalayıcı
VortexerVWR444-2790Vorteks aleti

Kaynaklar

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).
  3. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  4. Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).
  5. Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).
  6. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
  7. Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).
  8. Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).
  9. Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).
  10. Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).
  11. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).
  12. Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).
  13. Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).
  14. Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218(2014).
  15. Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
  16. Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).
  17. Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).
  18. Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).
  19. Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).
  20. Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10 (7), (2015).
  21. Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).
  22. Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).
  23. Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).
  24. Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42 (3), 521-528 (2014).
  25. Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28 (5), 524-529 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Endotoksemi TespitiTam Kan AnaliziKemil minesans l mN trofil Oksidatif PatlamasSepsis BiyobelirteciSeptik ok RiskiLPS Antikor KompleksiKritik Bak m TestleriHasta Ba Tan Testleri
Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.