Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Özet

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Özet

Hedeflenen periferik dokulara kan üzerinden monosit alımı, doku hasarı, tümör gelişimi ve otoimmün hastalıklar sırasında enflamatuar süreç önemlidir. Bu onların yapışma ve transendothelial göç (hicret) temel etkilenen doku takip aktive endotel hücrelerinin luminal yüzeyine serbest akışı yakalama sürecinde kolaylaştırılmıştır. Ancak, monosit altgrupları Tercihli ve içerik bağımlı alımı destek mekanizmaları hala tam anlaşılır. Bu nedenle, aynı anda görüntülenir ve akış altında ölçülen için farklı monosit altgrupları alımı sağlayan bir yöntem geliştirdik. Hızlandırılmış confocal görüntüleme üzerinde dayalı bu yöntemi yapışık ve transmigrated monosit arasında kesin ayrım olanak sağlar. Burada, bu yöntem aynı anda pro-anjiogenik ve sigara anjiogenik monosit tüp bebek işe alım çağlayan eğitim için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem en çok üç monosit nüfus alımı farklı adımları incelemek için uzun olabilir.

Giriş

Hasarlı doku, anjiogenez ve kanser^{1,2,3 de dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi temizlik patojenler, kavga ettiği için esastır doğuştan gelen bağışıklık fagositik bileşeni monosit teşkil} . Monosit, kanda dolaşan, ancak periferik doku iltihabı site için belirli moleküler mekanizmalar aracılığıyla işe heterojen altgrupları oluşur ve kemik iliği türevi hücrelerdir. Monosit, lökosit gelince işe alım cascades genel olarak, yakalama, inişli çıkışlı, tarama, tutuklama, transendothelial geçiş (hicret) ve geçiş damar duvarı (membran ve duvar resmi de dahil olmak üzere farklı adımları implicates hücreleri)⁴. Bu adımlar, esas olarak iltihap kaynaklı moleküller üzerinde endotel luminal yüzeyinde selectins, glikoprotein ligandlar, kemokinler, hücreler arası ve bileske adezyon molekülleri ve onların reseptörleri gibi ligandlar selektin gibi lökosit içerir ve integrinler. Ticaret yolları endotel hücre kavşak (paracellular) veya endotel hücre vücut (transcellular) aracılığıyla endotel bariyer⁵geçmeye lökositler tarafından kullanılabilir. Monosit tarihsel transcellular yönlendirme yolu transmigrate için dokümante edilmiş iken, monosit artık homojen hücre nüfus kabul edilir gibi onların göç yolu içinde olası farklılıkları gidermek önerilmiştir. Şimdi monosit çeşitlilik her onların farklılıklar ve ortak tarafından tanımlanabilir,^3,6ile ilgili olarak kendi kendine özgü ekstravazasyonu basamaklandırır açık hale geliyor. Bu nedenle, belirsizliğe yer bırakmadan monosit altgrupları arasında ayırımcılık için görselleştirmek önemlidir ve fenotip her işe alım sırasında farklı bu altgrupları davranışını işlemek.

Monosit gelen insan, domuz, fare ve fare ile belirli görev atfedilen ve özel göçmen davranış^7,8,9fenotipik altgrupları içine kentler. Örneğin, insanlarda, monosit CD14, bakteriyel lipopolysaccharide için bir coreceptor ve CD16, Fc-gama reseptör III onların yüzey ifadeye dayalı üç alt kümeleri ayrılabilir. İnsan monosit altgrupları dahil klasik CD14⁺CD16^-, orta CD14⁺CD16⁺ ve klasik olmayan CD14^dimCD16⁺ hücreleri^6,9. Klasik CD14⁺CD16^- monosit esas olarak iltihaplı olmak gösterildi ise CD16 havuzu⁺ monosit topluca TIE2 ifade ve proangiogenic işlev¹⁰sunmak için bulunmuştur. Sürekli olarak, endotel hücre stimülasyon ile inflamatuar sitokinlerin gibi insan tümör nekroz faktör (TNF) α veya interlökin (IL-1) beta (geleneksel iltihabı) klasik CD14 tam istihdamı tetiklemek yeterli⁺CD16 ^- monosit. Ancak, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) A ve TNFα (anjiogenik faktörler tahrik iltihabı) eş zamanlı eylemleri CD16 hicret kışkırtmak için gerekli olan⁺ proangiogenic havuzu monosit³. Tarihsel olarak, statik koşulları, paralel plaka akışı odası ve μ-slayt akışı odaları geleneksel Transwell sisteminde kullanılan kantitatif analiz bir lökosit nüfus bir zaman vitro^{11, işe alım ,12,13}. Bu protokoller doğrulandıktan iken, aynı anda birden fazla monosit altgrupları analizine izin daha sağlam bir yöntem daha anlayışlı olarak değerlendirilir. Böyle metodolojisi birden çok etkileşimler ve her ilgili nüfus farklı frekansları için hesap ve ayrıca her monosit tanımlamak işe alım cascades için benzerlikler ve özelliklerine mekanik bir anlayış sağlamak alt küme küme.

Burada, aynı anda confocal mikroskobu kullanılarak belirlenmesi için farklı monosit altgrupları göçmen cascades sağlayan akış altında monosit alımı zaman hata görüntüleme dayalı bir yöntem mevcut. Bu yöntem endotel hücre iltihabı, hem de sonrası kapiller venüller, monosit dolaşan hemodinami lökosit işe alım içinde vivo ana konumunu taklit bazı kritik özellikleri entegre. İnsan göbek bağları izolasyonu iyi kurulmuş bir protokol aracılığıyla oluşturulan insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), önerilen yöntem kullanır. Bu klinik kaynağın ederken aynı zamanda umbilikal ven ayrılmış olabilir endotel hücrelerinin makul bir verim sağlayan biyolojik bir yan ürün kolayca kullanılabilir olmanın avantajı var. Biz de floresan boyalar ve ayirt farklı hücresel bileşenleri ve belirsizliğe yer bırakmadan monosit (abluminal vs. luminal) konumlandırma tanımlamak için confocal mikroskobu arasında ayırt etmek için kullanılan zaman içinde. Burada sunulan Protokolü monosit altgrupları hicret düzeyde aynı anda ölçmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu yöntem diğer lökositler altgrupları ve işe alım süreçleri çalışmaya farklı biyolojik ve etiketleme kullanımı ile uzatılabilir olduğunu belirtmek gerekir.

Protokol

İnsan malzemeler ile aydınlatılmış onam gönüllü bağış ve İsviçre etik komiteler klinik araştırma uygun olarak kullanılmıştır.

1. izolasyon ve insan göbek dondurulması damar endotel hücreleri (HUVEC)

1. 5 mL kaplama çözeltisi (0.1 mg/mL kollajen G ve fosfat tamponlu tuz PBS pH %7,4 0,2 jelatin) T75 şişesi için 37 ° C'de 30 dk HUVEC yalıtım işlemini başlatmadan önce ekleyin.
2. PBS sahip kablo temiz, steril kompres ile silin ve bir steril 20 cm Petri kabına yerleştirin. Kablonun ucu steril makasla kesme.
3. Tek büyük damar ve iki küçük arterlerin tanımlar. Yavaşça bir kanül kendisine ven ekstremitelerde kordon ucunda içine iliştirilmiş bir üçlü stopcock yerleştirin.
4. Kablo ve tel uzunluğu ile sıkıca kanül bağlantı sıkın.
5. İki kez 20 mL ile kordon RPMI orta 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve 250 ng/mL kordon 's damarlar yıkamayı Amfoterisin B içeren sıvı. Bu işlem daha beyaz ve daha net kablosunu görünümünü sağlar. Ven collagenase ek Önce bir ucunda bir şırınga RPMI toplayarak boş.
6. Ven ile 1 mg/mL collagenase türü 12 mL sıvı ben (0,22 µm filtre).
7. Yakın stopcock, göbek bağını sona erer ve kordon 12 dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
8. Yavaşça endotel hücrelerinden damar lümen ayırmak için kordon masaj.
9. 30 mL % 10 fetal buzağı serum 50 mL şırınga içeren RPMI almak ve göbek kordonu bir ucunu bağlayın.
10. Bir boş 50 mL şırınga göbek kordonu diğer ucunu takın
11. Stopcock açın ve damar bir ucundan diğer ucundan karşılıklı toplama iken sıvı.
    Not: Toplanan süspansiyon endotel hücreleri içerir.
12. Bu hücre süspansiyon 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
13. Süpernatant atmak ve hücre Pelet tam M199 Orta (M199 içeren % 20 FCS, 15 µg/mL endotel hücre büyümesini takviyeleri, 100 µg/mL heparin sodyum, 0.5 µM hidrokortizon, 10 µg/mL L-askorbik asit, 100 U/mL penisilin, 100 U/mL 10 mL ile resuspend streptomisin ve 250 ng/mL Amfoterisin B).
14. Kaplama çözüm T75 balonun kaldırmak ve bir kez PBS ile durulayın.
15. Tohum hücreleri T75 şişesi adım 1,13 toplanan ve % 5 CO₂37 ° C'de kuluçka yerleştirin.
16. Ertesi gün, şişeye kalan kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve sonra Orta 2 günde izdiham kadar değiştirmek için 3 kez tam M199 orta ile yıkayın.
17. % 80-90 izdiham, HUVEC monolayer kez 5 mL de PBS ile durulayın ve 5 mL 1 mM EDTA M199 5 dk. eklemek 4 mL ve 1 mL tripsin eylemi durdurmak için FCS için 37 ° C'de % 0.05 tripsin de hücrelerle bağlantısını kesin. Tüm HUVEC ayırmak için şişeye boşalt.
18. Bir aliquot VE-cadherin, PECAM-1 ve gp38 boyama için kullanılan ve HUVEC saflık kontrol etmek için akış sitometresi tarafından çözümlemek için 50 µL toplamak.
19. HUVEC kalan 200 x g oda sıcaklığında 5 min için adımda 1,18 15 mL tüp ve santrifüj toplamak.
20. Adım 1.19 süpernatant atmak, 5 x 10⁵ hücre/mL cryotubes yoğunluğu, çözüm (FCS % 10 DMSO içeren) dondurma hücre Pelet resuspend ve-80 ° C'de veya sıvı azot kullanımı kadar dondurmak.
21. HUVEC saflık denetlemek için:
    1. Anti-insan VE-cadherin-FITC antikor 1 µL, Anti-insan PECAM1-PE antikor 1 µL ve anti-insan Podoplanin-APC antikor 1 µL 1,18 adımda toplanan HUVEC 50 µL aliquot ekleyin.
    2. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. PBS ve santrifüj 100 µL 400 x g 30 eklemek s.
    4. Süpernatant atın ve PBS 100 µL içinde resuspend. Veri akış sitometresi teknikleri tarafından şimdi elde edilebilir.
       Not: HUVEC VE-cadherin ve PECAM-1 için pozitif ve negatif Podoplanin için.

2. HUVEC buz çözme

Not: HUVEC düşük geçiş deneyler için (en fazla 5 pasajlar) kullanın.

1. Bir T75 şişesi 1 mL 30 dk 37 ° C'de kaplama çözeltisi ile kat.
2. Hızla 2 min için 37 ° C'de HUVEC defreeze ve tam M199 10 mL hücrelerde resuspend.
3. Hücreleri 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
4. Hücre Pelet tam M199 10 mL resuspend.
5. Önceden kaplanmış şişeye hücre süspansiyon aktarın. Kuluçka %5 CO₂37 ° C'de şişeye koyun. Hücre kültür orta 2 günde değiştirin.

3. HUVEC kültür 0.4 µ-slayt odasında

1. Akış deney başlamadan önce beş gün önceden 0.4 µ-slayt chambers ile 0.1 mg/mL kollajen G, 30 dk 37 ° C'de % 0,2 jelatin içeren PBS 30 µL kat.
2. Chambers PBS 100 µL ile yıkayın.
3. Bir T75 şişesi bir % 80 – 90 konfluent HUVEC hücrelerden bağlantısını kesin.
4. PBS ile 5 mL HUVEC durulama ve onları 5 mL 5 min için 37 ° C'de % 0.05 tripsin ile bağlantısını kesin.
5. Temizleme ve tam M199 hücre süspansiyon toplamak ve en uygun yöntemi tarafından hücreleri saymak. 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
6. Hücre Pelet 10⁶ hücre/mL resuspend ve oda başına 30 µL (30.000 hücreleri) dağıtın.
7. 1s için % 5 CO₂ 37 ° C'de bir kuluçka hücrelerde kuluçkaya.
8. Tam M199 150 µL her odasına ekleyin ve kuluçka CO₂37 ° C ve % 5, 5 gün boyunca hücreler kültür. Orta 2 günde değiştirin.

4. HUVEC monosit işe alım tahlil akış altında için boyama

1. M199 ve CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) 1 µM etiketleme orta hazırlamak ve 5 min için 37 ° C'de hücre etiketleme önce sıcak.
2. 37 ° C'de yıkama HUVEC M199 orta ile iki kez ısındı
3. Orta CMFDA 1 µM içeren ısıtılan etiketleme orta 30 µL ile değiştirin ve 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçka makinesi 10 dakika yerleştirin.
4. Bir kez yıkama ile tam M199 ve 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçka 30 dk için tam M199 hücrelerle kuluçkaya.
   Not: Serum etiketleme çözüm eklenmesi önce tüm izlerini silmek önemlidir, aksi takdirde HUVEC boyama değiştirebilir.
5. Her iki insan TNFα içeren orta tam M199 ile değiştirin (500 U/mL) veya insan TNFα karışımı (500 U/mL) insan VEGFA ile (1 µg/mL) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂6 h için.

5. yalıtım insan Pan monosit ve altgrupları boyama

1. Yoğun insan kanı buffy bir kat veya 20 mL EDTA Tüp tüpler deneyde gününde toplanan taze izole insan kanı kullanın.
2. PBS-1 mM EDTA (1:1) kanda sulandırmak ve yavaşça seyreltilmiş kan yoğunluk gradient medya 20 mL üstüne 20 mL pipet. Vasıl 400 x g oda sıcaklığında yavaş hızlanma ve fren olmadan 30 dk santrifüj kapasitesi.
3. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) toplamak-(arasında yoğunluk gradient medya ve plazma katmanları) trombosit katmanına 40 mL PBS - 1 mm EDTA içeren yeni bir 50 mL tüp. 50 mL PBS - 1 mM EDTA ile top.
4. 5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak.
5. Hücre Pelet boyama arabellek (1 mM % 0.5 Sığır serum albümin BSA içeren PBS - EDTA) 10 mL ile resuspend.
6. 5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak.
7. 5.5 ve 5.6 adımları yineleyin.
8. Hücre Pelet arabellek boyama 10 mL ile resuspend. 10 µL hücre sayısı için bir aliquot almak.
9. PBMC nüfus kontrol edin ve hızla bir akış sitometresi içeren hücreleri saymak.
   Not: Karakteristik lenfosit ve monosit nüfusu (Şekil 1A) görülebilir. Hakkında taze insan kanı 50 mL bekliyoruz 50-100 10 x⁶ PBMC.
10. CD14 + karşı CD14-PBMC akış altında alımı için:
    1. Üç kez ile akış arabellek Pelet yıkayın (M199% 0.5 BSA içeren) ve akış arabellek, 6 x 10 mL başına⁶ hücre mononükleer hücrelerde resuspend.
    2. Her tahlil için 200 µL aliquots olun. Önce tahlil 20 dk kadar 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. 5 µL anti-CD14-PE ve Höchst 33342 2 µM son bir konsantrasyon, her aliquot için ekleyin. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s.
    5. Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 200 µL ile resuspend.
11. Monosit altgrupları akış altında alımı için:
    1. Monosit üretici yönergelerine uygun bir pan monosit izolasyon kiti ile izole et.
       Not: Aşağıdaki yalıtım 50 x 10⁶ hücreler için protokolüdür. Üreticinin önerilerini içinde olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.
    2. PBMC süspansiyon 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant atın ve Pelet arabellek boyama 400 µL ile resuspend.
    4. 50 µL Fc reseptör engelleme reaktif ve Pan monosit antikor kokteyl 50 µL ekleyin.
    5. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    6. Tampon ve manyetik boncuklar konjuge anti-biotin antikor 100 µL boyama 400 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Boyama arabellek 2 mL ekleyin ve bir mıknatıs ile birleştiğinde bir MAC'ler LS sütun kullanın.
    8. LS sütun üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve tampon boyama 1 mL ekleyin. Akışı aracılığıyla atın.
    9. PBMC süspansiyon sütunda geçmek ve yeni 15 mL tüp içinde pan monosit içeren rağmen açık akış toplamak.
    10. 5 mL top için boyama tampon ekleyin.
    11. Bir aliquot alın ve monosit yalıtım akış sitometresi ile kalitesini kontrol edin.
    12. Pan monosit sayısı belirler.
        Not: Sadece monosit nüfus (Şekil 1B)görülebilir.
    13. Monosit adım 5.11.11 200 x g 5 min için de geri kalanı santrifüj kapasitesi.
    14. Süpernatant atmak.
    15. Hücre Pelet akış arabellek 5 mL resuspend (M199% 0.5 BSA içeren).
    16. 5.11.13-5.11.14 iki kez EDTA herhangi bir iz ortadan kaldırmak için yineleyin.
12. Monosit süspansiyon akışında olun 6 x 10⁶ hücre/mL tampon (M199% 0.5 BSA ile).
13. Monosit her işe alım tahlil için 200 µL aliquots olun.
14. Enjeksiyon önce 20 dk kadar kuluçka 37 ° C'de aliquot devam et.
15. Anti-CD16-PE antikor ve Höchst 33342 (son 2 µM) 5 µL her aliquot için ekleyin.
16. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
17. Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s.
18. Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 250 µL ile resuspend.
19. 30 µL monosit süspansiyon confocal mikroskobunun edinme parametreleri ayarlamak için kullanılmak üzere slaytı bir odası ekleyin.
20. Adım 5,18 37 ° C'de monosit süspansiyon aliquots engellemek
    Not: Bu süspansiyon akış sisteminde enjekte edilir hazırdır.

6. sıvı sistemi hazırlanması

1. 37 ° C'de ayarla görüntüleme için hücre kuluçka sağlamak
   Not: Akış sistemi bir diyagram Şekil 2' de gösterilmiştir.
2. Boru bölüm ı: araya bir radarı bağlayıcı erkek (8 cm uzun ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir parça bir ucunu takın ve diğer ucunu bir satır içi radarı enjeksiyon kümesine bağlayın. Silikon (40 cm ve 3 mm kalınlığında) boru bir parça için ikinci radarı konektörüne takın bir ucunda.
   Not: İsteğe bağlı olarak, bir 5 mL şırınga bağlı bir 3-yollu musluk hatlı radarı enjeksiyon kümesi ve nihai hava kabarcık Temizleme için boru silikon arasında eklenir.
3. Araya boru Bölüm II: 20 mL şırınga (1 m uzunluğunda ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir uzunluğu bir ucunu bağlayın. Radarı bağlayıcı erkek tüp diğer sonuna yerleştirin.
4. Bağlanmak bölüm ı ve II boru radarı bağlayıcı erkek bir kadın radarı kilit bağlaştırıcı (Şekil 2A) için ekleyerek bölüm.
5. Havzanın 37 ° C'de ısındı akış arabellek (M199 + %0.5 BSA) içeren silikon tüp Ücretsiz sonu koymak
6. Boru akış arabellek ile doldurmak için pistonu 20 mL şırınga üzerinde çek.
7. Şırınga pompa yerleştirin ve güvenli.
8. Pompa ayarla içinde modu olarak demleyin (karşı) çekilme ve akış hızını belirtin.
9. Aşağıdaki formülü kullanarak kullanılan IBIDI slayt göre akış hızı belirleyin:
   
   Not: Slayt faktör deneme için kullanılan IBIDI slayt bağlıdır. Μ-slayt için ben^0,4 slayt faktör Bu örnekte kullanılan radarı kilit 131.6 olduğunu. Belirli slayt faktörler için bkz şirket web sitesi¹⁴. Akış arabellek viskozite 0.0072 dyn.s/cm²' dir. Yamultma stres sonrası kapiller venüller hakkında 0.5 dyn/cm²' dir.
10. Slayt (Şekil 2B) Bağlan:
    1. Silikon tüp kadın radarı kilit Coupler çevresinde kelepçe ve iki radarı bağlayıcı erkek bağlaştırıcı kesin.
    2. Onları teşvik HUVEC ve orta ile dolgu içeren slayt rezervuarlar bağlayın. Hava kabarcıkları bu adımı sırasında kaçının.
    3. Kelepçeler almak ve bağlantı değil sızdırıyor emin olun.
11. Hızlandırılmış görüntüleme için mikroskop altında slayt yerleştirin ve pompa başlar.

7. zaman hata görüntüleme akış tarafından Confocal mikroskobu altında monosit alımı

1. 40 x objektif kullanın (bkz. Tablo reçetesi) görüntüleme için.
2. 405 etkinleştirmek nm (mavi monosit çekirdeği), 488 nm (yeşil endotel hücreleri) ve 561 nm (kırmızı CD16 + alt) lazerler.
3. Satın alma parametrelerini ayarlamak için monosit içerir odası kullanın.
   Not: Sigara transmigrated hem transmigrated monosit algılamak için iğne deliği ve lazer 405 nm yoğunluğu yüksek ayarlanır. Böylece, transmigrated monosit biraz bazal planında görünür. Ancak tek transmigrated monosit yeni yer altında endotel hücreleri meşgul karşılık gelen çekirdek çevresinde günahı bir alan mevcut.
4. Mikroskop altında elde edilebilir için bir yer odası.
5. Views 1 cm çapındaki çok pozisyonlu confocal görüntüleme için 3 alanı seçin.
6. Bazal ve endotel hücrelerinin apikal kenarlarında tanımlamak
7. Bir z-yığın 10 – 12 µm aralığı (0.5 µm adım) ayarlayın. Hızlandırılmış bir kazanım her 1dk çalıştırın.
8. Görüntüleme 3 dk sonra 200 µL monosit süspansiyon (6 x 10⁶ hücre/mL), satır içi radarı enjeksiyon bağlantı noktası yoluyla enjekte et.
   Not: Hızla monosit apikal odak düzlemi içinde görünür, uygun ve hicret (üretim emrindeki apikal bazal planı) başlatın.
9. Görüntü için en az 30 dakika. Bir kez bitmiş, görüntüleme durdurmak ve akışını durdurmak. Slayttan bağlantısını kesmek için boru kelepçe.
10. Slayt 10 dk 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde ile düzeltmek.
11. Slayt PBS ile yıkayın ve slayt gerekirse daha fazla çözümleme için 4 ° C'de depolayın.

8. ImageJ verilerle analiz

1. Her alandaki toplam yapisan monosit saymak. Mm²başına hücre sayısı belirler.
2. Bazal planı endotel hücreleri altında bulunması ve bir kara delik (yeşil kanal) çekirdek çevresinde varlığı ile saptanan transmigrated monosit saymak.
3. Yapisan lökosit sayısı tarafından transmigrated lökosit sayısı bölün. Hicret oranı yapisan monosit yüzdesi olarak sunulur.
4. Gösterim amacıyla, apikal ve bazal iki tarafın aynı anda her endotel bu bölmeleri içinde gerçekleşen olayları göstermek için gösterilebilir.

Sonuçlar

TNFα tarafından indüklenen HUVEC etkinleştirme durumunu belirleme

Biyo-etkinlik inflamatuar sitokin TNFα, toplu iş ve donma-çözülme döngüsü repletion göre farklı. HUVEC harekete geçirmek durum TNFα tedavi ile kontrol etmek önemlidir. Bu paralel olarak selectins, ICAM-1 ve VCAM-1^15,16,17inflamatuar indüksiyon için konfluent HUVEC bazı örnek...

Tartışma

Burada, bir yöntemi nasıl monosit altgrupları iltihaplı endotel monolayer transmigrate bir çalışma ayrıntılı raporu. Confocal mikroskobu Ayrıca monosit işe akışı^3,11,19altında incelemek için kullanılır faz kontrast mikroskobu yerine kullanılan çok tartışılan yöntem. Confocal Mikroskopi için hızlandırılmış Imaging'i kullanma bir büyük avantajı belirsizliğe yer bırakmadan hicret ve güçlü yapışma monosit arasında ayırımcılık için y...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Doku Kültürü Şişeleri 75 cm2	TPP	90076	İzole HUVEC
µ-Slide VI rutin kültürü 0.4	IBIDI	80606
Santrifüj Tüpleri 15 mL	TPP	191015
Santrifüj Tüpleri 50 mL	TPP	191050
Kollajen G	Biochrom	L 7213	Hücre kültürü kaplaması için şişeler
Jelatin	Sigma-Aldrich	1393	Hücre kültürü şişelerinin kaplanması için
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (MgCl2< / sub> ve CaCl2< / sub> olmadan)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (MgCl2< / sub> ve CaCl2< / sub> ile)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Orta	Sigma-Aldrich	R8758
3 Musluklar	BIO-RAD	7328103
penisilin 10.000 μ/mL streptomisin 10.000 μ g/mL mantar zonu 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Kollajenaz tip 1	Worthington	LS004216
Orta 199 1x avec Earle tuzları, L-Glutamin, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Sığır Albümin Fraksiyonu V	ThermoFisher	15260037
Endotel Hücre Büyüme Takviyesi, 150 mg	Millipore	02-102
Heparin Sodyum	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hidrokortizon	Sigma-Aldrich	H6909
L-Askorbik asit	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA disodyum tuzu dihidrat C10H14N2Na2O8 ve orta nokta; 2H < altı > 2 < / alt >O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), insan rekombinant klonu: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE antikoru, insan rekombinant klonu: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, insan rekombinant klonu: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-klorometilfloresein diasetat)	ThermoFisher	C2925
Rekombinant insan TNF ve alfa;	Peprotech	300-01A
Rekombinant insan VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programlanabilir Şırınga Pompası	KF Teknolojisi	NE-1000
Ficoll  Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-insan CD14-PE, insan rekombinant klonu: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monosit İzolasyon Kiti, insan	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-insan CD16-PE, insan rekombinant klonu: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS sütunları	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Ayırıcı	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat	ThermoFisher	H1399
Silikon boru	IBIDI	10841
Dirsek Luer Konektörü	IBIDI	10802
Dişi Luer Kilit Kuplörü	IBIDI	10823
Luer Kilit Konektörü Dişi	IBIDI	10825
Sıralı Luer Enjeksiyon Portu	IBIDI	10820
Ar1 konfokal mikroskop	Nikon
40x objektif	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Düzlem Fluor WD: 3.6-2.8mm düzeltme 0-2mm
ImageJ Yazılımı	NIH