Özet

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Published: November 26, 2018
doi:

Özet

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Abstract

Hedeflenen periferik dokulara kan üzerinden monosit alımı, doku hasarı, tümör gelişimi ve otoimmün hastalıklar sırasında enflamatuar süreç önemlidir. Bu onların yapışma ve transendothelial göç (hicret) temel etkilenen doku takip aktive endotel hücrelerinin luminal yüzeyine serbest akışı yakalama sürecinde kolaylaştırılmıştır. Ancak, monosit altgrupları Tercihli ve içerik bağımlı alımı destek mekanizmaları hala tam anlaşılır. Bu nedenle, aynı anda görüntülenir ve akış altında ölçülen için farklı monosit altgrupları alımı sağlayan bir yöntem geliştirdik. Hızlandırılmış confocal görüntüleme üzerinde dayalı bu yöntemi yapışık ve transmigrated monosit arasında kesin ayrım olanak sağlar. Burada, bu yöntem aynı anda pro-anjiogenik ve sigara anjiogenik monosit tüp bebek işe alım çağlayan eğitim için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem en çok üç monosit nüfus alımı farklı adımları incelemek için uzun olabilir.

Introduction

Hasarlı doku, anjiogenez ve kanser1,2,3 de dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi temizlik patojenler, kavga ettiği için esastır doğuştan gelen bağışıklık fagositik bileşeni monosit teşkil . Monosit, kanda dolaşan, ancak periferik doku iltihabı site için belirli moleküler mekanizmalar aracılığıyla işe heterojen altgrupları oluşur ve kemik iliği türevi hücrelerdir. Monosit, lökosit gelince işe alım cascades genel olarak, yakalama, inişli çıkışlı, tarama, tutuklama, transendothelial geçiş (hicret) ve geçiş damar duvarı (membran ve duvar resmi de dahil olmak üzere farklı adımları implicates hücreleri)4. Bu adımlar, esas olarak iltihap kaynaklı moleküller üzerinde endotel luminal yüzeyinde selectins, glikoprotein ligandlar, kemokinler, hücreler arası ve bileske adezyon molekülleri ve onların reseptörleri gibi ligandlar selektin gibi lökosit içerir ve integrinler. Ticaret yolları endotel hücre kavşak (paracellular) veya endotel hücre vücut (transcellular) aracılığıyla endotel bariyer5geçmeye lökositler tarafından kullanılabilir. Monosit tarihsel transcellular yönlendirme yolu transmigrate için dokümante edilmiş iken, monosit artık homojen hücre nüfus kabul edilir gibi onların göç yolu içinde olası farklılıkları gidermek önerilmiştir. Şimdi monosit çeşitlilik her onların farklılıklar ve ortak tarafından tanımlanabilir,3,6ile ilgili olarak kendi kendine özgü ekstravazasyonu basamaklandırır açık hale geliyor. Bu nedenle, belirsizliğe yer bırakmadan monosit altgrupları arasında ayırımcılık için görselleştirmek önemlidir ve fenotip her işe alım sırasında farklı bu altgrupları davranışını işlemek.

Monosit gelen insan, domuz, fare ve fare ile belirli görev atfedilen ve özel göçmen davranış7,8,9fenotipik altgrupları içine kentler. Örneğin, insanlarda, monosit CD14, bakteriyel lipopolysaccharide için bir coreceptor ve CD16, Fc-gama reseptör III onların yüzey ifadeye dayalı üç alt kümeleri ayrılabilir. İnsan monosit altgrupları dahil klasik CD14+CD16, orta CD14+CD16+ ve klasik olmayan CD14dimCD16+ hücreleri6,9. Klasik CD14+CD16 monosit esas olarak iltihaplı olmak gösterildi ise CD16 havuzu+ monosit topluca TIE2 ifade ve proangiogenic işlev10sunmak için bulunmuştur. Sürekli olarak, endotel hücre stimülasyon ile inflamatuar sitokinlerin gibi insan tümör nekroz faktör (TNF) α veya interlökin (IL-1) beta (geleneksel iltihabı) klasik CD14 tam istihdamı tetiklemek yeterli+CD16 monosit. Ancak, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) A ve TNFα (anjiogenik faktörler tahrik iltihabı) eş zamanlı eylemleri CD16 hicret kışkırtmak için gerekli olan+ proangiogenic havuzu monosit3. Tarihsel olarak, statik koşulları, paralel plaka akışı odası ve μ-slayt akışı odaları geleneksel Transwell sisteminde kullanılan kantitatif analiz bir lökosit nüfus bir zaman vitro11, işe alım ,12,13. Bu protokoller doğrulandıktan iken, aynı anda birden fazla monosit altgrupları analizine izin daha sağlam bir yöntem daha anlayışlı olarak değerlendirilir. Böyle metodolojisi birden çok etkileşimler ve her ilgili nüfus farklı frekansları için hesap ve ayrıca her monosit tanımlamak işe alım cascades için benzerlikler ve özelliklerine mekanik bir anlayış sağlamak alt küme küme.

Burada, aynı anda confocal mikroskobu kullanılarak belirlenmesi için farklı monosit altgrupları göçmen cascades sağlayan akış altında monosit alımı zaman hata görüntüleme dayalı bir yöntem mevcut. Bu yöntem endotel hücre iltihabı, hem de sonrası kapiller venüller, monosit dolaşan hemodinami lökosit işe alım içinde vivo ana konumunu taklit bazı kritik özellikleri entegre. İnsan göbek bağları izolasyonu iyi kurulmuş bir protokol aracılığıyla oluşturulan insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), önerilen yöntem kullanır. Bu klinik kaynağın ederken aynı zamanda umbilikal ven ayrılmış olabilir endotel hücrelerinin makul bir verim sağlayan biyolojik bir yan ürün kolayca kullanılabilir olmanın avantajı var. Biz de floresan boyalar ve ayirt farklı hücresel bileşenleri ve belirsizliğe yer bırakmadan monosit (abluminal vs. luminal) konumlandırma tanımlamak için confocal mikroskobu arasında ayırt etmek için kullanılan zaman içinde. Burada sunulan Protokolü monosit altgrupları hicret düzeyde aynı anda ölçmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu yöntem diğer lökositler altgrupları ve işe alım süreçleri çalışmaya farklı biyolojik ve etiketleme kullanımı ile uzatılabilir olduğunu belirtmek gerekir.

Protocol

İnsan malzemeler ile aydınlatılmış onam gönüllü bağış ve İsviçre etik komiteler klinik araştırma uygun olarak kullanılmıştır. 1. izolasyon ve insan göbek dondurulması damar endotel hücreleri (HUVEC) 5 mL kaplama çözeltisi (0.1 mg/mL kollajen G ve fosfat tamponlu tuz PBS pH %7,4 0,2 jelatin) T75 şişesi için 37 ° C’de 30 dk HUVEC yalıtım işlemini başlatmadan önce ekleyin. PBS sahip kablo temiz, steril kompres ile silin ve bir steril 20 cm Petri kabına yerleştirin. Kablonun ucu steril makasla kesme. Tek büyük damar ve iki küçük arterlerin tanımlar. Yavaşça bir kanül kendisine ven ekstremitelerde kordon ucunda içine iliştirilmiş bir üçlü stopcock yerleştirin. Kablo ve tel uzunluğu ile sıkıca kanül bağlantı sıkın. İki kez 20 mL ile kordon RPMI orta 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve 250 ng/mL kordon ‘s damarlar yıkamayı Amfoterisin B içeren sıvı. Bu işlem daha beyaz ve daha net kablosunu görünümünü sağlar. Ven collagenase ek Önce bir ucunda bir şırınga RPMI toplayarak boş. Ven ile 1 mg/mL collagenase türü 12 mL sıvı ben (0,22 µm filtre). Yakın stopcock, göbek bağını sona erer ve kordon 12 dk için 37 ° C’de kuluçkaya. Yavaşça endotel hücrelerinden damar lümen ayırmak için kordon masaj. 30 mL % 10 fetal buzağı serum 50 mL şırınga içeren RPMI almak ve göbek kordonu bir ucunu bağlayın. Bir boş 50 mL şırınga göbek kordonu diğer ucunu takın Stopcock açın ve damar bir ucundan diğer ucundan karşılıklı toplama iken sıvı.Not: Toplanan süspansiyon endotel hücreleri içerir. Bu hücre süspansiyon 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve hücre Pelet tam M199 Orta (M199 içeren % 20 FCS, 15 µg/mL endotel hücre büyümesini takviyeleri, 100 µg/mL heparin sodyum, 0.5 µM hidrokortizon, 10 µg/mL L-askorbik asit, 100 U/mL penisilin, 100 U/mL 10 mL ile resuspend streptomisin ve 250 ng/mL Amfoterisin B). Kaplama çözüm T75 balonun kaldırmak ve bir kez PBS ile durulayın. Tohum hücreleri T75 şişesi adım 1,13 toplanan ve % 5 CO237 ° C’de kuluçka yerleştirin. Ertesi gün, şişeye kalan kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve sonra Orta 2 günde izdiham kadar değiştirmek için 3 kez tam M199 orta ile yıkayın. % 80-90 izdiham, HUVEC monolayer kez 5 mL de PBS ile durulayın ve 5 mL 1 mM EDTA M199 5 dk. eklemek 4 mL ve 1 mL tripsin eylemi durdurmak için FCS için 37 ° C’de % 0.05 tripsin de hücrelerle bağlantısını kesin. Tüm HUVEC ayırmak için şişeye boşalt. Bir aliquot VE-cadherin, PECAM-1 ve gp38 boyama için kullanılan ve HUVEC saflık kontrol etmek için akış sitometresi tarafından çözümlemek için 50 µL toplamak. HUVEC kalan 200 x g oda sıcaklığında 5 min için adımda 1,18 15 mL tüp ve santrifüj toplamak. Adım 1.19 süpernatant atmak, 5 x 105 hücre/mL cryotubes yoğunluğu, çözüm (FCS % 10 DMSO içeren) dondurma hücre Pelet resuspend ve-80 ° C’de veya sıvı azot kullanımı kadar dondurmak. HUVEC saflık denetlemek için: Anti-insan VE-cadherin-FITC antikor 1 µL, Anti-insan PECAM1-PE antikor 1 µL ve anti-insan Podoplanin-APC antikor 1 µL 1,18 adımda toplanan HUVEC 50 µL aliquot ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. PBS ve santrifüj 100 µL 400 x g 30 eklemek s. Süpernatant atın ve PBS 100 µL içinde resuspend. Veri akış sitometresi teknikleri tarafından şimdi elde edilebilir.Not: HUVEC VE-cadherin ve PECAM-1 için pozitif ve negatif Podoplanin için. 2. HUVEC buz çözme Not: HUVEC düşük geçiş deneyler için (en fazla 5 pasajlar) kullanın. Bir T75 şişesi 1 mL 30 dk 37 ° C’de kaplama çözeltisi ile kat. Hızla 2 min için 37 ° C’de HUVEC defreeze ve tam M199 10 mL hücrelerde resuspend. Hücreleri 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet tam M199 10 mL resuspend. Önceden kaplanmış şişeye hücre süspansiyon aktarın. Kuluçka %5 CO237 ° C’de şişeye koyun. Hücre kültür orta 2 günde değiştirin. 3. HUVEC kültür 0.4 µ-slayt odasında Akış deney başlamadan önce beş gün önceden 0.4 µ-slayt chambers ile 0.1 mg/mL kollajen G, 30 dk 37 ° C’de % 0,2 jelatin içeren PBS 30 µL kat. Chambers PBS 100 µL ile yıkayın. Bir T75 şişesi bir % 80 – 90 konfluent HUVEC hücrelerden bağlantısını kesin. PBS ile 5 mL HUVEC durulama ve onları 5 mL 5 min için 37 ° C’de % 0.05 tripsin ile bağlantısını kesin. Temizleme ve tam M199 hücre süspansiyon toplamak ve en uygun yöntemi tarafından hücreleri saymak. 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet 106 hücre/mL resuspend ve oda başına 30 µL (30.000 hücreleri) dağıtın. 1s için % 5 CO2 37 ° C’de bir kuluçka hücrelerde kuluçkaya. Tam M199 150 µL her odasına ekleyin ve kuluçka CO237 ° C ve % 5, 5 gün boyunca hücreler kültür. Orta 2 günde değiştirin. 4. HUVEC monosit işe alım tahlil akış altında için boyama M199 ve CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) 1 µM etiketleme orta hazırlamak ve 5 min için 37 ° C’de hücre etiketleme önce sıcak. 37 ° C’de yıkama HUVEC M199 orta ile iki kez ısındı Orta CMFDA 1 µM içeren ısıtılan etiketleme orta 30 µL ile değiştirin ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 10 dakika yerleştirin. Bir kez yıkama ile tam M199 ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka 30 dk için tam M199 hücrelerle kuluçkaya.Not: Serum etiketleme çözüm eklenmesi önce tüm izlerini silmek önemlidir, aksi takdirde HUVEC boyama değiştirebilir. Her iki insan TNFα içeren orta tam M199 ile değiştirin (500 U/mL) veya insan TNFα karışımı (500 U/mL) insan VEGFA ile (1 µg/mL) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO26 h için. 5. yalıtım insan Pan monosit ve altgrupları boyama Yoğun insan kanı buffy bir kat veya 20 mL EDTA Tüp tüpler deneyde gününde toplanan taze izole insan kanı kullanın. PBS-1 mM EDTA (1:1) kanda sulandırmak ve yavaşça seyreltilmiş kan yoğunluk gradient medya 20 mL üstüne 20 mL pipet. Vasıl 400 x g oda sıcaklığında yavaş hızlanma ve fren olmadan 30 dk santrifüj kapasitesi. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) toplamak-(arasında yoğunluk gradient medya ve plazma katmanları) trombosit katmanına 40 mL PBS – 1 mm EDTA içeren yeni bir 50 mL tüp. 50 mL PBS – 1 mM EDTA ile top. 5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak. Hücre Pelet boyama arabellek (1 mM % 0.5 Sığır serum albümin BSA içeren PBS – EDTA) 10 mL ile resuspend. 5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak. 5.5 ve 5.6 adımları yineleyin. Hücre Pelet arabellek boyama 10 mL ile resuspend. 10 µL hücre sayısı için bir aliquot almak. PBMC nüfus kontrol edin ve hızla bir akış sitometresi içeren hücreleri saymak.Not: Karakteristik lenfosit ve monosit nüfusu (Şekil 1A) görülebilir. Hakkında taze insan kanı 50 mL bekliyoruz 50-100 10 x6 PBMC. CD14 + karşı CD14-PBMC akış altında alımı için: Üç kez ile akış arabellek Pelet yıkayın (M199% 0.5 BSA içeren) ve akış arabellek, 6 x 10 mL başına6 hücre mononükleer hücrelerde resuspend. Her tahlil için 200 µL aliquots olun. Önce tahlil 20 dk kadar 37 ° C’de kuluçkaya. 5 µL anti-CD14-PE ve Höchst 33342 2 µM son bir konsantrasyon, her aliquot için ekleyin. Mix ve 10 dk 37 ° C’de kuluçkaya. Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s. Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 200 µL ile resuspend. Monosit altgrupları akış altında alımı için: Monosit üretici yönergelerine uygun bir pan monosit izolasyon kiti ile izole et.Not: Aşağıdaki yalıtım 50 x 106 hücreler için protokolüdür. Üreticinin önerilerini içinde olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. PBMC süspansiyon 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve Pelet arabellek boyama 400 µL ile resuspend. 50 µL Fc reseptör engelleme reaktif ve Pan monosit antikor kokteyl 50 µL ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Tampon ve manyetik boncuklar konjuge anti-biotin antikor 100 µL boyama 400 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Boyama arabellek 2 mL ekleyin ve bir mıknatıs ile birleştiğinde bir MAC’ler LS sütun kullanın. LS sütun üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve tampon boyama 1 mL ekleyin. Akışı aracılığıyla atın. PBMC süspansiyon sütunda geçmek ve yeni 15 mL tüp içinde pan monosit içeren rağmen açık akış toplamak. 5 mL top için boyama tampon ekleyin. Bir aliquot alın ve monosit yalıtım akış sitometresi ile kalitesini kontrol edin. Pan monosit sayısı belirler.Not: Sadece monosit nüfus (Şekil 1B)görülebilir. Monosit adım 5.11.11 200 x g 5 min için de geri kalanı santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. Hücre Pelet akış arabellek 5 mL resuspend (M199% 0.5 BSA içeren). 5.11.13-5.11.14 iki kez EDTA herhangi bir iz ortadan kaldırmak için yineleyin. Monosit süspansiyon akışında olun 6 x 106 hücre/mL tampon (M199% 0.5 BSA ile). Monosit her işe alım tahlil için 200 µL aliquots olun. Enjeksiyon önce 20 dk kadar kuluçka 37 ° C’de aliquot devam et. Anti-CD16-PE antikor ve Höchst 33342 (son 2 µM) 5 µL her aliquot için ekleyin. Mix ve 10 dk 37 ° C’de kuluçkaya. Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s. Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 250 µL ile resuspend. 30 µL monosit süspansiyon confocal mikroskobunun edinme parametreleri ayarlamak için kullanılmak üzere slaytı bir odası ekleyin. Adım 5,18 37 ° C’de monosit süspansiyon aliquots engellemekNot: Bu süspansiyon akış sisteminde enjekte edilir hazırdır. 6. sıvı sistemi hazırlanması 37 ° C’de ayarla görüntüleme için hücre kuluçka sağlamakNot: Akış sistemi bir diyagram Şekil 2′ de gösterilmiştir. Boru bölüm ı: araya bir radarı bağlayıcı erkek (8 cm uzun ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir parça bir ucunu takın ve diğer ucunu bir satır içi radarı enjeksiyon kümesine bağlayın. Silikon (40 cm ve 3 mm kalınlığında) boru bir parça için ikinci radarı konektörüne takın bir ucunda.Not: İsteğe bağlı olarak, bir 5 mL şırınga bağlı bir 3-yollu musluk hatlı radarı enjeksiyon kümesi ve nihai hava kabarcık Temizleme için boru silikon arasında eklenir. Araya boru Bölüm II: 20 mL şırınga (1 m uzunluğunda ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir uzunluğu bir ucunu bağlayın. Radarı bağlayıcı erkek tüp diğer sonuna yerleştirin. Bağlanmak bölüm ı ve II boru radarı bağlayıcı erkek bir kadın radarı kilit bağlaştırıcı (Şekil 2A) için ekleyerek bölüm. Havzanın 37 ° C’de ısındı akış arabellek (M199 + %0.5 BSA) içeren silikon tüp Ücretsiz sonu koymak Boru akış arabellek ile doldurmak için pistonu 20 mL şırınga üzerinde çek. Şırınga pompa yerleştirin ve güvenli. Pompa ayarla içinde modu olarak demleyin (karşı) çekilme ve akış hızını belirtin. Aşağıdaki formülü kullanarak kullanılan IBIDI slayt göre akış hızı belirleyin:Not: Slayt faktör deneme için kullanılan IBIDI slayt bağlıdır. Μ-slayt için ben0,4 slayt faktör Bu örnekte kullanılan radarı kilit 131.6 olduğunu. Belirli slayt faktörler için bkz şirket web sitesi14. Akış arabellek viskozite 0.0072 dyn.s/cm2′ dir. Yamultma stres sonrası kapiller venüller hakkında 0.5 dyn/cm2’ dir. Slayt (Şekil 2B) Bağlan: Silikon tüp kadın radarı kilit Coupler çevresinde kelepçe ve iki radarı bağlayıcı erkek bağlaştırıcı kesin. Onları teşvik HUVEC ve orta ile dolgu içeren slayt rezervuarlar bağlayın. Hava kabarcıkları bu adımı sırasında kaçının. Kelepçeler almak ve bağlantı değil sızdırıyor emin olun. Hızlandırılmış görüntüleme için mikroskop altında slayt yerleştirin ve pompa başlar. 7. zaman hata görüntüleme akış tarafından Confocal mikroskobu altında monosit alımı 40 x objektif kullanın (bkz. Tablo reçetesi) görüntüleme için. 405 etkinleştirmek nm (mavi monosit çekirdeği), 488 nm (yeşil endotel hücreleri) ve 561 nm (kırmızı CD16 + alt) lazerler. Satın alma parametrelerini ayarlamak için monosit içerir odası kullanın.Not: Sigara transmigrated hem transmigrated monosit algılamak için iğne deliği ve lazer 405 nm yoğunluğu yüksek ayarlanır. Böylece, transmigrated monosit biraz bazal planında görünür. Ancak tek transmigrated monosit yeni yer altında endotel hücreleri meşgul karşılık gelen çekirdek çevresinde günahı bir alan mevcut. Mikroskop altında elde edilebilir için bir yer odası. Views 1 cm çapındaki çok pozisyonlu confocal görüntüleme için 3 alanı seçin. Bazal ve endotel hücrelerinin apikal kenarlarında tanımlamak Bir z-yığın 10 – 12 µm aralığı (0.5 µm adım) ayarlayın. Hızlandırılmış bir kazanım her 1dk çalıştırın. Görüntüleme 3 dk sonra 200 µL monosit süspansiyon (6 x 106 hücre/mL), satır içi radarı enjeksiyon bağlantı noktası yoluyla enjekte et.Not: Hızla monosit apikal odak düzlemi içinde görünür, uygun ve hicret (üretim emrindeki apikal bazal planı) başlatın. Görüntü için en az 30 dakika. Bir kez bitmiş, görüntüleme durdurmak ve akışını durdurmak. Slayttan bağlantısını kesmek için boru kelepçe. Slayt 10 dk 4 ° C’de % 4 paraformaldehyde ile düzeltmek. Slayt PBS ile yıkayın ve slayt gerekirse daha fazla çözümleme için 4 ° C’de depolayın. 8. ImageJ verilerle analiz Her alandaki toplam yapisan monosit saymak. Mm2başına hücre sayısı belirler. Bazal planı endotel hücreleri altında bulunması ve bir kara delik (yeşil kanal) çekirdek çevresinde varlığı ile saptanan transmigrated monosit saymak. Yapisan lökosit sayısı tarafından transmigrated lökosit sayısı bölün. Hicret oranı yapisan monosit yüzdesi olarak sunulur. Gösterim amacıyla, apikal ve bazal iki tarafın aynı anda her endotel bu bölmeleri içinde gerçekleşen olayları göstermek için gösterilebilir.

Representative Results

TNFα tarafından indüklenen HUVEC etkinleştirme durumunu belirleme Biyo-etkinlik inflamatuar sitokin TNFα, toplu iş ve donma-çözülme döngüsü repletion göre farklı. HUVEC harekete geçirmek durum TNFα tedavi ile kontrol etmek önemlidir. Bu paralel olarak selectins, ICAM-1 ve VCAM-115,16,17inflamatuar indüksiyon için konflue…

Discussion

Burada, bir yöntemi nasıl monosit altgrupları iltihaplı endotel monolayer transmigrate bir çalışma ayrıntılı raporu. Confocal mikroskobu Ayrıca monosit işe akışı3,11,19altında incelemek için kullanılır faz kontrast mikroskobu yerine kullanılan çok tartışılan yöntem. Confocal Mikroskopi için hızlandırılmış Imaging’i kullanma bir büyük avantajı belirsizliğe yer bırakmadan hicret ve güçlü yap?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr Paul Bradfield okuma el yazması ve geri bildirimler için teşekkür ederiz. A. S., efendim Jules Thorn hayırsever yurtdışı güven trafiğe çıkış mali destek aldı.

Materials

Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40X objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

Referanslar

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

View Video