Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

9.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/58572

⸱

14 Kasım 2018

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Department of Anesthesiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 3German Center for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

Özet

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) proviral DNA'sının ana hücre genomu tekrarlayan siteleri ve genomik etkin noktaları olmayan rasgele tümleştirir. Burada ayrıntılı bir protokol roman tüp bebek modelleri üretimi için HIV enfeksiyonu için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak seçilen genomik tümleştirme siteleri ile mevcut. Bu yöntemle, seçim bir muhabir dizi bir hedefli, seçilen genomik locus klinik entegrasyon siteleri yansıtan entegre edilebilir.

İletişim kuralında, HIV kaynaklı bir muhabir tasarımı ve bir hedef site ve gRNA dizi seçme açıklanmıştır. Hedefleme vektör Homoloji silah ile inşa edilmiştir ve Jurkat T hücre içine transfected. Muhabir sıra Homolog rekombinasyon bir Cas9-aracılı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırılmış tarafından seçilen genomik siteye hedeflenmektedir. Tek hücre klonlar oluşturulan ve olaylar hedefleme için ekranlı akış sitometresi ve PCR tarafından. Seçili klonlar sonra genişletilir ve doğru hedefleyen PCR, sıralama ve Southern Blot tarafından doğrulanır. CRISPR-Cas9-aracılı genom mühendislik potansiyel hedef kapalı olayları analiz edilir.

Bu iletişim kuralı, roman hücre kültür sistemleri kullanarak bu modeli HIV enfeksiyonu klinik entegrasyon sitelerde oluşturulabilir. Tek hücre klonlar oluşturma ve doğrulama doğru muhabir sıra entegrasyon zaman alıcı olsa da, elde edilen klonal satırları işlevsel olarak proviral tümleştirme site seçim analiz etmek için güçlü araçlardır.

Giriş

Ana bilgisayar genom enfeksiyon üzerine proviral DNA entegrasyonu insan immün yetmezlik virüsü (HIV) yaşam döngüsünün kritik bir adımdır. Tümleştirme, HIV uzun ömürlü CD4 + T hücre alt kümeleri bellek CD4 + T hücreleri gibi gecikme süresi kurarak devam ederse. HIV tümleştirme rasgele1,2gibi görünüyor. Akut ve kronik olarak enfekte bireylerin2,3,4 entegrasyon sitelerin nasıl yapılacağını aracılığıyla çeşitli çalışmalarda yerleştirilmiştir entegre proviral DNA ile genomik etkin noktaları bir dizi algılandı ,5,6,7,8. İlginçtir, entegrasyon sitelerin bazıları enfekte hücreleri, tekrarlayan sitelerin entegrasyon klonal genişleme1olumlu etkileyebilir fikir önde gelen büyük bir kısmını aynı locus algılandı.

Tekrarlayan tümleştirme siteleri önemi bizim anlayışı ilerletmek için proviral tümleştirme site seçim keşfedilmeyi gerekir. Ancak, birkaç teknik yönleri eğitim HIV tümleştirme engel site seçimi ve sonuçları. Geniş JLat hücre hatları klinik tekrarlayan tümleştirme siteleri9yansıtmıyor gibi hücre kültür modelleri HIV gecikme süresi için kullanılır. Çalışmalar birincil hasta elde edilen hücrelerde, bir yandan, entegrasyon sitesi peyzaj açıklaması sıralama tarafından etkinleştirir, ancak fonksiyonel analiz için izin vermez. Bilgimizi, yeterli bir deneysel model işlevsel olarak seçilen klinik entegrasyon siteleri analiz etmek kullanılabilir.

Burada CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik teknolojisi kullanarak HIV enfeksiyonu için roman modelleri oluşturmak için ayrıntılı bir iş akışı mevcut. Burada açıklanan iş akışı HIV enfeksiyonu, genomically entegre proviral muhabir seçilen tümleştirme sitesinde taşıyan model T hücre kaynaklı muhabiri hücre satırlarını oluşturmak için kullanılabilir. Böylece proviral tümleştirme sitesi HIV biyoloji nasıl etkileyebilir ve provirus farklı tedavi stratejileri (örneğin, inducibility gecikme süresi ters kayıt ajanları tarafından) nasıl yanıt vereceğini keşfetmek için yeni araçları olarak hizmet vermekteyiz. Bizim Yöntem CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik, muhabir hangi Wuppertal'de sırası Homolog rekombinasyon tarafından bir Cas9 nükleaz kaynaklı iki iplikçikli ara hedef sitesindeki kolaylaştırdı avantajları kullanır. Hedef siteleri tümleştirme için HIV enfekte bireylerin ve Cas9-aracılı genom Mühendisliği için uygun PAM motifleri varlığı üzerine çalışmalar açıklanan tekrarlayan tümleştirme sitelere yakınlık göre seçilir.

Örnek sonuçlarımızda BACH2 gen odağı, BTB ve CNC Homoloji transkripsiyon regülatör 2 için hangi kodları üzerinde odaklanmıştır. Kronik olarak HIV enfekte bireylerin antiretroviral tedavi, BACH2 zenginleştirme entegre HIV-1 dizileri3,6,7,8,10gösterilen loci biridir. Uzun terminal tekrar (LTR) HIV-1-türetilmiş, tdTomato kodlama dizisi ve sığır büyüme hormonu (BGH) Poliadenilasyon sinyal (PA), biz BACH2 intron 5 iki belirli sitelere hedef içeren en az bir HIV kaynaklı muhabir seçtik. Sunulan Protokolü Jurkat hücreleri, bir insan CD4 + T hücre kaynaklı süspansiyon hücre kültürünü, ama diğer hücre hatları kullanılabilir ve buna göre uyarlanmış protokolü için optimize edilmiştir. Biz hedef site, inşaat hedef vektörünün Homoloji silah, CRISPR-Cas9-aracılı seçilen genomik, üretimi ve site seçimi klonal satırlarının muhabir hedefleme ve kapsamlı ile seçim için ayrıntılı bir iş akışı mevcut doğrulama Yeni oluşturulan, hedeflenen muhabiri hücre satırı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Mühendislik ve vektör (tv) tasarımı hedefleyen genom için strateji hedefleme

Not: İlk adım genom mühendislik seçimi ve CRISPR-Cas9-aracılı hedefleme için gerekli araçları nesil içerir. Genomik tümleştirme sitesi locus yelpazesi, hedefleme için hücre tipi seçimi ve tasarım bir HIV kaynaklı muhabiri tümleştirme için bu adımı öncesinde. Bu iletişim kuralı bir HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA en az muhabir Jurkat hedef hücrelere hedefleme açıklar. CRISPR-Cas9-esaslı hedefleme, üretimi, tarama ve klonal satırları doğrulanması için iş akışının bir akış şeması Şekil 1' de tasvir edilir. S. pyogenes Cas9 açıklanan hedefleme stratejisi kullanır (SpCas9) gRNA Yönetmen: dsDNA sonları seçili tümleştirme sitesinde oluşturmak için. Muhabir sonra sözde 5' ve 3' Homoloji silah (HA)11tarafından çevrili muhabir sıra içeren bir sigara Doğrusallaştırılmış hedefleme vektör (tv) sağlayarak Homolog rekombinasyon yoluyla seçilmiş genomik locus içine hedeflenmektedir.

  1. Çeşitli hedeflenen odağı, gRNA ve vektör tasarımı hedefleme
    1. Thegenomic odağı olmak hedef için bireysel bilimsel soru üzerine dayalı seçin. Tekrarlayan tümleştirme site HIV yayımlanmış listesi bulunan hastalarda farklı kullanım olarak2,3,4,5,6,7,8 çalışmalar bir kılavuz. Silico ayıklamak hedeflenen (dizisi tam gen) veya en az 5 kb genomik sırası olmak istenen genomik locus genomik dizisi UCSC genom tarayıcı (http:// genome.edu.ucsc.edu) kullanarak.
    2. 20 (gRNAs) RNA'ların Kılavuzu seçin E-net webtool (http://www.e-crisp.org) kullanarak seçilen genomik odağı hedefleme için nt.
      1. "Homo sapiens GRCh38" organizma olarak seçin. 1.1.1. adımda elde istenen genomik locus kapsayan genomik sırası giriş 2.000 bp.
      2. (Herhangi bir PAM, herhangi bir 5' temel, hedefleri kapalı uyuşmazlıkları tahammül ve intron/CPG Adaları hariç) orta uygulama ayarları kullanarak bir gRNA arama başlatın. Mümkün gRNA tasarımları ile liste görünür sıralama yüksekten özgüllük ve verimliliği için bir puan daha düşük.
      3. Tercihen özgüllük ve verimliliği yüksek bir puan gösterir ve var olmak hedef için istenen genomik odağı için mümkün olduğu kadar yakın olan bir gRNA seçin.
        Not: Bulunmak istenilen genomik locus yakınlığı ve belirli ve verimli gRNA tasarımını arasında bir uzlaşma vardır.
    3. Patlama seçilen gRNA dizi benzersizliğini gRNA bağlama sitesini kontrol etmek için NCBI patlama tarayıcı (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) kullanarak başvuru genom karşı.
      1. "İnsan genom" seçin. Sorgu sırası gRNA sýrasýný girdi. "Son derece benzer dizileri" seçin (megablast) programı olarak. GRNA sıra benzersiz olduğundan emin olun. Aksi takdirde, farklı bir gRNA tekrar adım 1.1.2.3 ve patlama açmadı.
    4. GRNA dizisi seçilir sonra silico 1000 bp akış yukarı ve aşağı akım gRNA sırası 1.1.1. adımda 5' ve 3' HA buna göre çıkarılan genomik serisinden seçeneğini belirleyin.
      Not: GRNAs seçilen genomik tümleştirme sitesi locus homolog olmalı ve bitişiğindedir ve protospacer bitişik motifi (PAM; örneğin, NGG SpCas9 için) (Şekil 2a). Tv 5' ve 3' HAs tarafından çevrili olan muhabir sırasını içerir. Kapak 1000 bp akış yukarı ve aşağı akım gRNA sıra11vardır. Tam gRNA sıra içinde HA dahil edilmemesini. 5'e kadar bir çakışma nt olan kabul edilebilir (Şekil 2a).
  2. Nesil gRNA ve vektörel çizimler hedefleme
    Not: İçin vektör düzenleri, Şekil 2bbakın.
    1. SpCas9 ve gRNA ifadesi için bir vektör üretmek için pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 hangi SpCas9 ve tek Kılavuzu RNA (sgRNA) aynı anda ifade edilebilir bel kemiği olarak kullanın. GRNA sıra omurga içine clone BbsI kısıtlama siteleri12kullanın.
    2. Tv üretmek için bir yüksek-kopya plazmid bel kemiği olarak (, pMK veya cDNA3.1 gibi) seçin.
      1. İlk olarak, muhabir montajı (Bu protokol: LTR_tdTomato_BGH-PA) yapı omurga Gibson derleme clong ile içine klonlama ticari bir derleme kullanarak13 kiti ve 5' ve 3' kısıtlama siteleri kanat tanıtmak (örneğin, 5' PacI ve 3' SmaI) sonraki kısıtlama sindirim HAs klonlama için.
      2. 1000 bp, adım 1.1.4 genomik DNA (gDNA) seçilen HA parçacıkları var olmak hedef için hücre türü yükseltmek (Bu protokol: Jurkat hücreleri) etkinlik düzelti ile DNA polimeraz kullanarak (bkz: Tablo 1 ve 2 için PCR malzemeler ve «««Bisiklet) koşulları. O zaman, kısıtlama siteleri her HA (PacI üzerinde 5' HA her iki ucundaki SmaI üzerinde 3' HA her iki ucundaki) 5' ve 3' ucunda kanat muhabir tanıtmak.
      3. Sırayla klon zaten Restriksiyon enzimi tarafından14,15klonlama (1.2.2.1 adımda oluşturulan) muhabir içeren yapı omurga içine vardır. İlk olarak, 5' HA klon PacI kısıtlama sites'ı kullanarak, sonra 3' HA klon SmaI kısıtlama sites'ı kullanarak.
        Not: Tv omurga ek bir floresan muhabir içeriyorsa, istenmeyen omurga tümleştirme akış sitometresi tarafından tespit edilebilir (3.2.2 ve 3.2.3 adımlara bakın). TV omurga floresan hiçbir gazeteci içeriyorsa, omurga tümleştirme, PCR kullanarak değerlendirilmesi gerekir (bkz. Adım 3.2.8).

figure-protocol-1
Şekil 1: CRISPR-Cas9-aracılı hedefleme, üretimi ve klonal muhabir yelpazesi için iş akışı hatları ile tanımlanmış tümleştirme site. (A)hedef vektör oluşturmak ve Jurkat T hücreleri hedef vektör ve Cas9/gRNA ifade plazmid transduce. (B) zenginleştirin transfected hücreleri 72 h mesaj transfection FACS tarafından. Hücreleri 10-14 gün boyunca büyümeye ve oluşumu olayları PCR tarafından hedefleme onaylamak ve akış sitometresi (C) Let. 3 hafta boyunca tek hücre klonlar seyreltme ve izin klonlar sınırlandırarak büyümeye (D) oluştur. (E) doğru PCR tarafından hedefleme için klonlar ekran ve akış sitometresi 96-şey biçiminde. Seçili klonlar genişletin. (F) Doğrula Southern blot, PCR ve sıralama ve Cas9 endonükleaz faaliyet hedef dışı olayların analizi tarafından seçilen klonlar hedefleme doğru. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-protocol-2
Şekil 2: strateji ve vektör tasarım hedefleme. (bir) gRNA ve Homoloji silah seçimi. 20 nt gRNA seçilen genomik hedef siteye homolog olması ve silah için 1000 bp up - tamamlayıcı ve gRNA aşağı ve gRNA sıra içermemesi gerekir bir mısınız Homoloji bitişik. (b) şemaları vektör ve gRNA/Cas9 vektör hedefleme. Hedefleme vektör 5' ve 3' Homoloji kolu tarafından çevrili olan seçilmiş muhabir sırasını oluşur. GRNA/Cas9 vektör pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 omurga üzerinde temel alır. (c) tarafından Homolog rekombinasyon hedefleme şematik. Hedef vektör ve guideRNA/Cas9 vektör Jurkat hücrelere transfected. Cas9 aracılık eder genomik hedef site Çift Kişilik strand tatilinde (belirttiği *) ve Homolog rekombinasyon ve genomik hedef locus muhabir dizisi entegrasyonunu kolaylaştırır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. CRISPR Cas9-tabanlı Jurkat hücrelerinin hedefleme

  1. Jurkat hücre transfection
    1. RPMI % 10 (v/v) fetal buzağı serum (FCS) ile ve 4 mM L-glutamin ["RPMI w.o. antibiyotik (AB)" 6-şey hücre kültür plaka kuyu sevk] 1640 2.5 ml 24 saat önce transfection, Plaka 1,25 x 106 Jurkat T hücreleri. Tek bir hedefleme deneme için bir tam 6-şey plaka hazırlamak (yani, 6 kuyuları her hücre süspansiyon 2.5 mL).
    2. Ertesi gün, dairesel tv ve pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/Jurkat hücreler için belirli bir transfection reaktif kullanarak gRNA hücrelerle birlikte transfect.
      1. 2 µg dairesel TV ve pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA şey başına 2 µg ticari RPMI orta 250 µL için indirimli serum konsantrasyonu transfection (RPMI serum % 50 azalma) için en iyi duruma getirilmiş bir tepki tüp ve karıştırmak iyi olarak ekleyin.
      2. Transfection reaktif 12 µL yavaş ekleyin DNA/orta olarak tüp duvarına dokunmadan ve girdap. 15 dakikadır kuluçkaya ve dropwise hücrelerinin bir şey eklemek karışım izin. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri kuluçkaya.
        Not: Tepki transfection hazırlanması ölçeklendirilebilir. Hiçbir orta değiştirmek transfection sonra gereklidir.
  2. Zenginleştirme floresans aktif hücre (FACS) sıralama transfected hücre
    1. 72 h sonrası transfection, havuz transfected hücreleri, onları saymak ve zenginleştirme FACS tarafından hazırlamak. 50 mL konik Tüp, santrifüj vasıl 300 x g ve oda sıcaklığında (RT) içinde hücreleri toplamak için 4 dk, PBS hücrelerde bir kez yıkamak, tekrar santrifüj kapasitesi, 1 x 10 Pelet FACS arabellek (PBS takıma % 1 FCS + 1 mM EDTA ile) uygun bir miktarda askıya 7 hücre/mL ve nihayet bir FACS tüp içine aktarın.
    2. Hücreleri FACS için konu ve bu da tv (örneğin, tdTomato bu protokolü) Floresan muhabir hızlı sıralayın. RPMI % 10 FCS, 4 mM L-glutamin ve 50 U/mL penisilin ve streptomisin ("RPMI w / AB" anılacaktır) ile takıma 1640 hücrelerde toplamak.
    3. Sıralama FACS sonra bir kez 20 mL RPMI w / AB sıralanmış hücrelere ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300 x g 4 dk RT. Resuspend az için de AB w / RPMI uygun bir miktarda hücre Pelet santrifüj kapasitesi ve hücre kültür plaka ile bir şey hücrelerde plakası uygun birim hücre sayı yazı-FACS göre.
      Not: Kültür küçük hacimli (örneğin,





















Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Temsilcisi bu deneyde LTR, tdTomato kodlama dizisi ve iki loci intron 5 BACH2 gen17dizisine polyA-sinyal oluşan en az bir HIV-1-türetilmiş muhabir hedeflemek seçtiniz. Hedefleme için loci yayımlanmış tekrarlayan tümleştirme yerler HIV infekte hastaların2,4,5,6birincil T hücreleri üzerinde farklı çalışmalarda bulundu göre seçilmiş olu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik uygulama seçilen proviral tümleştirme sitelerle HIV-1-türetilmiş Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için bir protokol açıklayın.

İletişim kuralı birkaç puan planlama aşamasında dikkat gerektirir. Gibi bazı loci diğerlerinden daha hedef için daha kolay olabilir ilk olarak, var olmak hedef için odağı dikkatli seçilmelidir (örneğin, bölge ve hedef kromatin durumuna bağlı olarak kendisi sıra). Tekrarlayan dizileri hedefleme vektör clone zordur...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Britta Weseloh ve Bettina Abel teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz de Arne Düsedau ve Jana Hennesen (akış sitometresi teknoloji platformu, Heinrich Pette Institut) Teknik destek için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SpCas9 ve gRNA'nın ekspresyonu içinpX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9Addgene42230
cDNA3.1klonlama için InvitrogenV79020memeli ekspresyon vektörü
BbsINew England BiolabsR0539Skısıtlama enzimi
Montaj Klonlama KitiNew England BiolabsE5520SHedef vektör üretimi için kullanılan montaj klonlama kiti
TaqPlus Hassas PCR SistemiAgilent Technologies600210Homoloji kollarının amplifikasyonu için kullanılan düzeltme okuma aktivitesine sahip DNA polimeraz (adım 1.2.2.2), entegrasyon bölgesi ve raportör dizisinin doğrulanması (adım 3.3.3 ve 3.3.5), Southern blot için genomik prob üretimi (adım 3.4.1.5) ve hedef dışı olayların analizi için kullanılır (Adım 3.5.4)
96 oyuklu doku kültürü plakası (yuvarlak altlı)TPP92097seyreltme kaplaması için doku kültürü plakaları
Phusion High-Fidelity DNA polimerazNew England BiolabsM0530 LDNA polimeraz (adım 2.4.2) ve Southern blot için muhabire özgü prob oluşturulması (adım 3.4.1.4)
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD9170PCR olarak dimetil sülfoksit katkı maddesi
Magnezyum Klorür (MgCl2) ÇözeltisiNew England BiolabsB9021SPCR katkı maddesi olarak MgCl2 çözeltisi
Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti KarışımıNew England BiolabsN0447SPCR reaksiyonları için her nt'den 10 mM içeren dNTP karışımı
5PRIME HotMasterMixPCRtaraması için kullanılan kullanıma hazır PCR karışımı (adım 3.2.11)
QIAamp DNA kan mini kitiQiagen51106DNA izolasyon ve saflaştırma kiti
QIAquick PCR Saflaştırma KitiQiagen28106PCR Saflaştırma Kiti
RPMI 1640 glutamin içermezLonzaBE12-167Fhücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu Güney Afrika ŞarjıPAN BiotechP123002hücre kültürü ortamı takviyesi
L-glutaminBiochromK 0282hücre kültürü ortamı takviyesi
Penisilin / Streptomisin 10.000 U / mL / 10.000 ve mikro; g/mLBiochromA 2212hücre kültürü ortamı takviyesi
Gibco Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Scientific31985062transfeksiyon için optimize edilmiş azaltılmış serum konsantrasyonuna sahip hücre kültürü ortamı
TransIT-JurkatMirus Bio MIR2125transfeksiyon reaktifi
phorbol 12-miristat 13-asetatSigma-AldrichP8139-1MGhücre kültürü reaktif
İyonomisinSigma-AldrichI0634-1MGhücre kültürü reaktifi
Şırınga tahrikli filtre ünitesi, PES membranı, 0,22 ve mikro; SterilMillexSLGP033RBfiltre ünitesi
Heracell 150i inkübatörThermo Fisher Scientific51026280doku kültürü inkübatörü
Amershan Hybond-N+GE HealthcareRPN1520BDNA ve RNA lekeleme için pozitif yüklü naylon membran
Stratalinker 1800Stratagene400072UV çapraz bağlayıcı
High PrimePrimerolarak rastgele oligonükleotidler kullanılarak DNA'nın radyoaktif dCTP ile etiketlenmesi için11585592001
illustra ProbeQuant G-50 Mikro SütunlarGE Healthcare28-9034-08etiketli DNA'nın saflaştırılması için kromatografi spin-kolonları
vektörüNEBuilder Hifi DNA filtrasyon için m Roche kiti

Kaynaklar

  1. Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
  2. Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498(2017).
  4. Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
  5. Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  6. Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
  7. Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
  8. Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  9. Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
  10. Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
  11. Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
  12. ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013).
  13. Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009).
  14. Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014).
  15. Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013).
  16. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
  17. Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
  18. Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).
  19. Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
  20. Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
  21. Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
  22. Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CRISPR Cas9 Genom M hendisli iHIV 1 Entegrasyon B lgeleriHomolog RekombinasyonAk Sitometrisi TaramasTek H cre KlonlamaSouthern Blot Do rulamasRehber RNA Tasar mHedefleme Vekt r Olu turmaProviral Raporlay c Entegrasyonu
HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.