Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) kapsamlı bir tanımlaması hücrelerdeki posttranscriptional düzenleyici ağ anlama anahtarıdır. RBP yakalama için yaygın olarak kullanılan bir strateji non-poly(A) RNA'ların çoğu proteinler tanımlanamayan bırakarak ökaryotik olgun mRNA üzerinde çoğunlukla oluşan Poliadenilasyon [Poli(a)] hedef RNA'ların, patlatır. Burada bir son zamanlarda bildirilen yönteminin metabolik etiketlerine göre birleştirerek poli(a) ve non-poly(A) RBPs transcriptome çapında yakalama sağlayan tıklama Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) olarak adlandırdığı ayrıntılı yordamlar açıklar RNA'ların, in vivo UV cross-linking ve bioorthogonal etiketleme.
Giriş
İnsan genomu çeşitli mRNA'ların, rRNA'lar, tRNA da dahil olmak üzere kodlama ve kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar), küçük nükleer RNA'ların (snRNA), küçük genelde RNA'ların (snoRNAs) ve uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs)1sentezlenir. Bu RNA'ların çoğunu RBPs giyim sahip ve Ribonükleoprotein parçacıklar (RNPs)2olarak işlev. Bu nedenle, RBPs kapsamlı bir tanımlaması çeşitli insan hastalıkları3,4,5' te karıştığı düzenleyici ağ arasında RNA'ların ve RBPs, anlamak için bir önkoşuldur.
Son birkaç yıldır insa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Dikkat: uygulanabilir olduğunda kullanılan reaktifler RNase free şeklinde satın alınan veya çözünmüş RNase-serbest, çözücüler (çoğu durumda dietil pyrocarbonate (DEPC) için-tedavi su). RNA örnekleri ve Kimyasalları RNase free ele alırken, her zaman eldiven ve maske ve sık sık RNase kirlenmesini önlemek için onları değiştirmek.
1. hazırlanması, Lysate metabolik olarak etiketli ve UV çapraz bağlı hücre
-
AB ve 4SU metabolik birleşme
- Kültür HeLa hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve % 5 CO2 atmosferde 37 ° C'de 100 μg/mL streptomisi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kalite kontrol adımları temsilcisi sonuçları sunulmuştur. Sonuçlar 2.3.2 (Şekil 1). adımda anlatılan jel floresan analizi, 4.1.3 (Şekil 2A). adımda anlatılan western blot Analizi ve gümüş boyama analiz 4.2.2 (Şekil 2B) adımda açıklanan rakamlar içerir. Kalite kontrol adımları CARIC protokolleri optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Her zaman büyük ölçekli RBP tanımlama deneyleri hazırlanmasında k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Adil RNA bütünlük bakımından başarılı CARIC deneyler anahtarlarına biridir. Kısmi düşme gözlendi rağmen ile uygun ligandlar Cu(I) ve dikkatli kullanım özellikleri ile RNA bozulması önemli ölçüde, azalır. AB ve deneysel örneklerinde 4SU değiştirme oranları ve % 1,18 %0,46, sırasıyla vardır (veri gösterilmez). 2.000 uzunluğu ile bozulmamış RNA'ların için nt, RNA'ların ~ %90 içeren en az bir AB ve bir 4SU. 1.000 uzunluğu ile kısmen bozulmuş RNA'ların için nt, RNA'ların ~ %70 içeren en az bir AB ve bir 4SU. Bu nedenle, şidde.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin hibe 91753206, 21425204 ve 21521003 ve ulusal anahtar araştırma ve geliştirme projesi 2016YFA0501500 tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Sığır Serumu) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penisilin & Streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| AB (5-etinil üridin) | Wuhu Huaren Co. | CAS: 69075-42-9 | |
| 4SU (4-tiyoridin) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10 kez; PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Su) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV çapraz bağlayıcı | UVP | CL-1000 | 365 nm UV lambası ile donatılmıştır |
| DEPC (Dietil pirokarbonat) | Sigma Aldrich | D5758 | Suyu arıtmak için. Son derece zehirli! |
| Tris ve orta nokta; HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli | Thermo Fisher Scientific | 88265 | 50 mL lizis tamponu için bir tablet. |
| LDS (Lityum dodesil sülfat) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15 mL ultrafiltrasyon tüpü (10 kDa kesme) | Millipore | UFC901024 | |
| 0,5 mL ultrafiltrasyon tüpü (10 kDa kesme) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin manyetik boncuklar | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimetil sülfoksit) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Tıklama Kimyası Araçları | AZ104 | |
| Bakır (II) sülfat | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris (3-hidroksipropiltriazolilmetil) amin] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodyum askorbat | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Tıklama Kimyası Araçları | AZ118 | |
| LDS örnek tamponu (4 kez;) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| %10 bis-Tris jel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodyum dodesil sülfat) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polioksietilen (20) oleyl eter] | J& K | 315442 | |
| Trietanolamin | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agaroz | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Üre | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosil ( N < / em >-Lauroylsarcosine sodyum tuzu) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodyum deoksikolat | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Sürüm: 1.5.5.1 |
Kaynaklar
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
