Yöntem makalesi

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

DOI:

10.3791/58601

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Munich Center of Integrated Protein Science and Biomedical Center, Ludwig-Maximilians University of Munich, 2Laboratory for Metabolism and Epigenetics in Aging, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN), 3German Mouse Clinic, Helmholtz Zentrum Munich, German Research Center for Environment and Health (GmbH), 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5Chair of Experimental Genetics, School of Life Science Weihenstephan, Technische Universität München, 6Laboratory for Metabolism and Epigenetics in Brain Aging, Institute of Neuroregeneration & Neurorehabilitation of Qingdao University, 7Molecular Biology Division, Biomedical Center, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik oranları değişiklikler ölçme ilerleme çeşitli hastalıklar ve yaşlanma anlamak için merkezi bir noktada bulunuyor. Burada, daha yakından fizyolojik devlet benzer ve mitokondrial etkinliği değiştirmek roman uyuşturucu açığa yardımcı olabilir tüm baş oksijen tüketimi ölçmek için bir roman tekniği mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzenlenmiş metabolik etkinliğini oturma hücrelerinin normal çalışması için önemlidir. Nitekim, değiştirilmiş metabolik aktivite nedensel kanser, diyabet, ateş ve bir kaç isim için yaşlanma ilerleme ile bağlantılıdır. Örneğin, mitokondrial etkinlik, hücrenin metabolik güç merkezi, değişimler birçok gibi hastalıklar nitelendirmiştir. Genel olarak, mitokondri ve oksijen Tüketim oranları mitokondrial faaliyet güvenilir bir okuma kabul edildi ve bu çalışmaların bazı ölçümlerde izole mitokondri veya hücreleri temel alan. Ancak, bu koşullar bütün doku karmaşıklığı temsil etmeyebilir. Son zamanlarda, biz tamamen izole sinek kafa dan oksijen Tüketim oranları dinamik ölçüm sağlar yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, düşük oksijen Tüketim oranları tüm baş segmentin yaşlı genç karşı sinekli kaydettik. İkinci olarak, lizin deacetylase inhibitörleri hızla oksijen tüketimi bütün başından alter keşfettim. Bizim roman tekniği bu nedenle ortaya çıkarılması, yeni özellikler metabolik oranları etkisi olabilir çeşitli ilaçların yardımcı olabilir. Ayrıca, bizim yöntemi daha çok fizyolojik Birleşik benzeyen bir deneysel kurulumunda metabolik davranış daha iyi anlaşılmasını verebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzenlenmiş metabolik aktivite hücreleri yaşama ve sağlıklı fonksiyonu bir doku için önemlidir. Kuralsız metabolik aktivite kapsamlı başlangıçlı ve ilerleme çeşitli maladies1bağlanacak şekilde gösterilmiştir. Örneğin, düşük metabolik aktivite daha önce Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklarda tanımlanmıştır ve yaş ilişkili bellek bozukluğu2,3. Ayrıca, mitokondrial disfonksiyon nedensel yaşlanma süreci4,5' te yer olduğuna inanılıyor. Öte yandan, yüksek mitokondrial ve metabolik oranları nerede tumorigenesis7mitokondrial inhibitörleri kullanımı azaltılmış kanser hücreleri6' da tarif edildi.

Metabolik aktivite bir okuma mitokondri oksijen tüketim oranı (OCR) olduğunu. İlginçtir, bu tür okuma öncelikle izole mitokondri elde edilir veya hücreleri, böylece ne literatürde açıklanan çoğunluğu fizyolojik devlet benzemez bir okuma ağırlıklı. Ancak, bu teknik bazı dezavantajları vardır. İlk olarak, mitokondrial tecrit Protokolü ilgili bir yapay doku genç karşı büyük doku9dan izole mitokondri karşılaştırırken olabilir onun bütünlük8, zarar verebilir. Ayrıca, yalıtım süreç uzun ve mitokondriyal işlev9,10,11düzenleyen ilgili protein ardından değişikliklerin kaybolmasına neden. Ayrıca, izole mitokondri sürekli olarak tüm doku metabolik oranları12,13temsil etmemektedir gösterilmiştir. Böyle hücresel biyolojik karmaşıklık olarak görülebilir, 'bütün, parçaların toplamından daha büyüktür', Yani, mitokondri izole zaman onların metabolizma hızı ile karşılaştırıldığında karmaşık hücre içinde farklı metabolik oranları görüntüleyebilir.

Hücreleri izole mitokondri daha daha iyi bir OCR okuma sunabilir iken, bütün bir doku hücre-hücre iletişim bağlamında kaybolabilir. Örneğin, beyindeki nöronların metabolik aktivite komşu Gliyal hücreler14metabolik faaliyete son derece bağımlı olur. Bu nedenle, tüm doku veya tüm organizmalar OCR araştırmak için yeni teknikler kurulması başlangıçlı ve çeşitli hastalıkların ilerleme için daha anlayışlı kanıtlayabilir.

Son zamanlarda, yeni teknikler bu sorunlar ve OCR ölçüm bütün doku, segment veya canlı organizmalar etkinleştirmek için ortaya çıkmıştır. Örneğin, son bir çalışma ile respirometer15permeabilized fiber yaklaşımı kullanarak bir böceği uçuş kas Oksijen ölçüm bildirdi. Yeni makineleri, mikro-basınçlırespirometri için OCR pankreas adacıkları16,17ölçümü izin. Sonuç olarak, bu teknoloji, OCR ölçüm tüm solucanlar18 ve Zebra balığı19sağlar bildirilmiştir. Ancak, sindirim bariyer varlığı çeşitli ilaçlar OCR değişiklikler bağlamında test etmek için bir sorun teşkil. İlginçtir, son raporları Neville ve arkadaşları ile iyi plaka20,21tek drosophila larva beyin ölçmek için yeni bir teknik göstermiştir.

Bu çalışmada, tüm yaşam ve mobil olmayan Drosophila22tüm OCR ölçümü etkinleştirmek için benzer bir kurulum kullandık. Bu teknik sindirim sistemi bariyer13,22geçmek zorunda kalmadan tüm segment metabolik aktivite üzerinde çeşitli ilaçlar etkisini ölçme ikincil bir avantaj sunuyor. Örneğin, daha önce bu lizin deacetylase inhibitörü (KDACi), enjeksiyon bir uyuşturucu inanılan bir geliştirilmiş anılar oluşumu23' sonuçlandı beyin, epigenetik yönteminde değiştirmek için doğrudan gösterilmiştir. Ancak, bizim roman tekniği kullanarak, hangi nöronal faaliyette tek başına bir faktör olabilir KDAC inhibisyon OCR, hızlı bir artış sonuçlandı keşfetti. Bizim iletişim kuralı çeşitli ilaçlar, genetik manipülasyon veya fizyolojik Devletler (hastalık, yaşlanma) etkisi üzerinde OCR bir bütün kafa bağlamında değerlendirmek için basit ve yeni bir yöntem sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. araç hazırlama

Not: Bu deneme için biz bir deniz atı XF24 aygıt "adacık plakalı" kullandık. Teknik operasyon karıştırma, bekliyor ve ölçümler hem de olasılığını farklı döngüleri ölçüm bölmenin maddeler eklemek için kullanır.

  1. Böylece istenilen sıcaklık ulaşmak ve kararlı kalmak için yeterli zaman makine de deneye başlamadan önce açın.
  2. Yazılım kurulumu (yönetim modu), kartuşu kalibrasyon uzunluğunu seçin (burada, 20 dk seçildi) ve istenilen sıcaklık.
    Not: mitokondri veya memeli doku ölçümleri genellikle yapılır iken dışarı 37 ° C'de, sinek kafa ortam sıcaklığı 25 ° C ama 31 ° c ölçüm sonuçlarını yayınladı. Bu cihazın, oda sıcaklığında en düşük sıcaklık ayarı olduğu için biz 31 ° C kullanılır. Sıcaklık 25 ° C veya daha düşük ulaşmak için makine soğuk bir odada veya 11 ° c kadar kısa bir süre önce21koyun.
  3. Yazılım, aşağıdaki iletişim kuralını kullanan: 3-2 dk bekleme – 2 dk ölçme karıştırma dak. Deneysel tasarımına bağlı olarak, A-D noktalarından seçilen ölçüm adımdan sonra enjeksiyon adımları ekleyebilirsiniz.
    1. Kalite kontrol ve bazal OCR belirlenmesi için ilk ilaç üzerinden bağlantı noktası A. enjekte önce en az üç ölçüm devir bekleyin Becker ve ark. için ayrıntılı zaman çizelgesi iletişim kuralı, lütfen bkz: başvuru 13 .

2. Kartuş hazırlık

  1. Kartuşu bir gün (ya da en az 4 h) öncesinde test önceden kalibre. Her şey için Calibrant (pH 7,4) 1.0 mL ekleyin ve ezelî CO2 için bir gecede ya da o daha 24 h için sulu kadar 72 h. parafilm kartuşla buharlaşma engellemek sensör kartuş plaka ve mağaza en üstünde 37 ° C'de yer.
  2. Deneysel ilaçlar de deneye başlamadan önce (taze Orta + % 2.5 glikoz) ortamda çözülür olun.
  3. Ölçmek ve aracın herhangi bir pH fark uyuşturucu enjekte sırasında önlemek için istenen sıcaklıkta pH için uyuşturucu çözüm pH ayarlayın.
  4. Damlalıklı ayrılmış enjeksiyon liman uyuşturucu çözümü. Örneğin, 1:10 elde etmek için bağlantı noktası A 77 μL kullanın seyreltme 770 μL çözüm ve daha sonra 85 μL bağlantı noktası b
  5. Kartuş makineye yüklemek ve kalibrasyon başlar.

3. tabak hazırlama

Not: İki kişi aynı anda plaka hazırlamak önerilir. İki kişi başına bir tabak hazırlık süresi ~ 45-60 gerektiriyor olabilir dakika.

  1. Taze hazırlanmış ayarlamak medya + % 2.5 glikoz 1 istenen pH için sıcaklık değişiklikleri N HCl. pH tarafından etkilenen değil emin olun.
  2. Bir buz kutusu hazırlamak ve buz üzerinde metal bir plaka yer.
  3. Adacık plaka (24-şey plaka) paketi açın ve medya ile Petri kabına (92 mm x 16 mm) ağları bırakın.
  4. Yerleştirici (net sıkıca kuyuda yerlerde küçük bir enstrüman) ile net bir toplamak ve yanında mikroskop ayağa yerleştirici var. Yerleştirici için bağlı net medya küçük bir damla ekleyin.
  5. (Bir hafta ya da 2 hafta eski Kanton erkekler burada kullanılmıştır) sinekler buz gibi metal plaka üzerinde sinekler yerleştirerek anestezi.
  6. Forseps kullanarak, bir sinek karın kapmak ve mikroskop altında bir petri medyada bırakın.
  7. Forseps ikinci bir çifti kullanarak, anında Başkanı yavaşça çıkarın. Yerleştirici için bağlı net ortasında yer ve baş medyada dalmış doğrulayın.
  8. Merkezi olduğu zaman 16 tanesi net başkanları. Gereksiz sıvı kuyuda yerleştirerek süre kafa kaybını önlemek için belgili tanımlık mezartaşı merkezleme önce kaldırın.
    Not: plaka hazırlık yöntemi kuruluş sırasında makul bir süre içinde yeterli ve dengeli veri bu numarayı verdi gibi 16 sinek kafa kullanılmıştır.
  9. Yerleştirici kullanarak, net kuyuda yerleştirin. Kafaları net altında tuzak vardır emin olun. Yavaş medya + % 2.5 glikoz (Şekil 1) 700 μL ekleyin. Her kuyuları için tekrarlayın.
    Not: 20 kuyu baş örnekleri sinek ve plaka başına arka plan kalibrasyonunun 4 boş kuyu tavsiye edilir. Boş wells de 700 μL arabellek + % 2.5 glikoz ile net içerdiğinden emin olun.
  10. Wells ağlar yolu ile mikroskop altında hava kabarcığı için kontrol edin. Damlalıklı yavaşça yukarı ve aşağı herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için 1 mL damlalıklı kullanma. Okuma güvenilir bir OCR için merkezli kafa tutmak.
  11. Ve ölçüm başlangıç plaka makineye ekleyebilirsiniz.

4. analiz OCR ölçümler

  1. Protokol sonunda kartuşunu çıkarın.
  2. Kalite kontrolü, bağlantı noktası dolgular içinde görünür herhangi bir yemek artıkları gözlemlemek. Eğer belgili tanımlık mezartaşı protein çıkarma için Örneğin, kullanılmak üzere kartuş ve plaka (seçenek 1) atmak (seçenek 2 bakınız).
  3. Elektronik tablo dosyalarını ayıklamak için ve kalite kontrol her oksijen ve pH düzeyleri için iyi. Arka plan wells yok OCR Haritayı ve oksijen seviyesi kararlı olduğundan emin olun.
    1. Veri analizi, bazıları ilgili yazılım seçilebilir için bir algoritma kullanıyoruz. Kullanım AKOS algoritması (alt ölçüm =) ilk ve son onay arasındaki tüm ölçüm sırasında oksijen dizi düzeyleri Eğer OCR değerleri2 için iki biyolojik örnekleri arasında benzer ve son keneler oksijen düzeyleri 95 () düşük değildir mmHg) (heads'OCR bu oksijen düzeyinde, belirgin düşüktür), (Şekil 2).
    2. Bazı koşullar hızlı bir OCR oluşturmak örnek neden olur ve düşük oksijen seviyeleri 1st kene sırasında ve/veya son kene (kanda oksijen azlığı) (Şekil 3A) görüntüleyebilir. Böyle bir senaryoda, sabit algoritması gibi bir alternatif ölçüm yöntemini kullanın. Kanda oksijen azlığı, OCR çözüm oksijen seviyesinin düşük nedeniyle önemli ölçüde azalır. Bu nedenle, yanıltıcı okuma AKOS algoritması verir.
      Not: Daha yeni makine sabit algoritması eksik. Bu nedenle, toplam oksijen düzeyleri ayıklamak ve ilk kez başına oranı 3-5 keneler (Şekil 3) çizmek için tercih edilir.

5. (seçenek 2) biyokimyasal analiz kafa segmentin

  1. Biyokimyasal ölçmek için (metabolitleri, Proteom, vb), bir baş kesim özelliklerini ayarlamak çalıştırma gereksinimi; Ancak, herhangi bir zamanda Protokolü iptal ve plaka çıkarmak mümkündür.
  2. Bir kez plaka çıkarmak, Sigara bilenmiş forseps net bir delik açmak ve böylece serbest kayan nokta için belgili tanımlık mezartaşı kaldırmak için kullanın.
  3. Bir kesim ile 1 mL damlalıklı kullanarak ipucu ve kafaları bir şişe için transfer.
  4. Hızlı bir şekilde arabellek atın ve ek-kafaları sıvı azot kıpırdama. Belgili tanımlık mezartaşı ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek kaliteli OCR ölçüm kayıt yeteneği başından (Şekil 1) net ortasında merkezleme dayanır. Bu sensör daha büyük olan daha yeni XFe24 makineye göre oldukça küçük oksijen sensörü spot XF24 makine için önemlidir. Daha önce gösterilen, merkezleme kafaları genç sinekler13' te sabit bir OCR için en az 20 ardışık ölçümleri görüntülemek.

Makinelerin kullanılması bir kritik yönü doğru analiz uygulamaktır. Bu deneyler sırasında oksijen seviyesini kontrol etmek için tavsiye edilir. Her 2 dk ölçüm 10 alt ölçümleri (keneler) bölünmüştür. Bir de 16 sağlıklı kafalı genellikle 140-170 (mmHg) ilk kene için bir oksijen kısmi basınç (pO2) görüntüler. İlk örnekte, biz genç orta yaştan sinek kafa (Şekil 2A ve 2B) vs göre. Oksijen seviyesi daha hızlı orta yaşlı kafasına bırak, gözlenen fark küçük iken (Şekil 2A). Ayrıca, oksijen düzeylerinin aralığı ile 165 120 son onay sırasında ilk kene sırasında koşulları arasındaki benzer. Böyle bir durumda, güvenilir bir şekilde oksijen düzeyi açılan genç karşı orta yaştan başkanları (2B rakam) arasında aynalar OCR (pmol/dak)2otomatik olarak oluşturmak için AKOS algoritmasını kullanmak için tercih edilir. Not, makine tarafından analiz programı AKOS algoritma otomatik olarak seçer.

Ancak, bizim gözlem dayalı, AKOS algoritması kullanılarak otomatik olarak yanıltıcı verebilir, eğer değil tam tersi doğru OCR için sonuçlar. Bu tür eserlerin kanda oksijen azlığı13,22ulaştığı yüksek alıcı bir örnek koşullarda oluşturulabilir. Örneğin, sodyum bütrat (SB), bir KDAC inhibitörü eklenmesi geçici oksijen düzeyleri (Şekil 3A) dinamikleri değiştirir. Oysa araç denetimleri sırasında ilk ve son keneler oksijen sürekli düzeylerini görüntülemek, SB yanı sıra oksijen seviyesi önemli ve geçici damla bu keneler (Şekil 3A) neden olur. SB tek başına hiçbir başkanları (veri gösterilmez) nerede eklenir arka plan Wells, oksijen seviyesi değiştirmez. Verileri SB oksijen tüketimi artar kavramı destekler. İlk kene koleksiyonu (12 saniye ilk kene ölçüm aşamasında kaydedilir kadar) ertelendiği gibi ilk veri noktası zaten SB tedavi wells düşüktür. Bu nedenle, bu HDAC inhibitörü eklenmesi aşağıdaki oksijen tüketimi erken değişiklikleri yakalamak zordur. Ayrıca, SB tedavi örnekleri oksijen düzeyleri son keneler topluluğu tarafından belirtildiği gibi zaten düşük düzeylere (kanda oksijen azlığı) azaltılır. Kanda oksijen azlığı kendi oksijen tüketimini son dilimleri (Şekil 3A) başları yavaş. AKOS hesaplama tüm keneler dikkate alır ve bir anoksik duruma yoksayar çünkü yanıltıcı bir OCR oluşturur. Nitekim, olmayan normalleştirilmiş AKOS OCR düzeyleri göster küçük bir (Veh/SB) (3B rakam) bağlantı noktasının enjeksiyon (kesik çizgi) göre değişen.

AKOS üzerinde dayalı öncesi enjeksiyon ölçüm OCR düzeylere normalize OCR çok benzer düzeyde öncesi ve does değil çekmek oksijen düzeyi değişiklikleri (Şekil 3A) bağlantı noktası A, enjeksiyon sonrası ortaya koymaktadır. Bu şartlar altında daha çok modelleri/OCR ve oksijen düzeyi değişiklikleri benzeyen sabit algoritma (Şekil 3 c) önerilir. Sonuç olarak, alan sabit algoritma ölçüm ortaya artan bir OCR SB tedavi (Şekil 3 c) üzerine normalleştirilmiş.

SABİT algoritması yokluğu ile yeni makine bir dezavantajıdır. Bu nedenle, son derece örnek/tedavi tüketen kullanıldığı deneyler, bu el ile OCR ölçümleri hesaplamak için tavsiye edilir ve oksijen azalmaya hesaplama 3-5 keneler her ölçüm birim zamanda ilk seviye.

figure-results-1
Resim 1 . Bir de erkek sinek 16 tane - hafta eski başkanları içeren örneği. Kafaları bir net altında ortalanmış ve medya kayan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Resim 2 . OCR ölçüm karşılaştırma bir - hafta eski sinek kafa (genç) arasında temsili örneği ve dört - hafta eski sinek kafa (orta-yaş). (A) oksijen düzeyleri için üç farklı ölçümleri gösterilir; Her 2 dk ölçüm on alt ölçümleri (keneler) bölünmüştür. (B) (a) bir miktar. Orta yaş örnek düzeyde biraz daha düşük olmasına rağmen ilk ve son keneler düzeyde benzer. Bir miktar oksijen düzeyleri azalma eğimi, OCR düzeyleri oluşturmak için kullanılır. Yukarıda açıklanan22, % 10- genç sinek yüksek orta yaşlı sinekler OCR var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3 . OCR değişiklik sodyum bütrat (SB) genç sinek başlarını tarafından örneği. (A) oksijen seviyesi 15 mM SB eklenmesi aşağıdaki yedi ölçümleri kaydedildi. Kesikli çizgi enjeksiyon uyuşturucu (veya araç) bağlantı noktası A. işaretler. Keneler 1 ve 10 oksijen düzeyleri (mavi), kontrol grubunda sabit kalırken belirtmek gerekirse bu keneler sırasında oksijen düzeyleri geçici şunlardır (altı ölçüler enjeksiyon takip) azaltılmış SB tedavi örnekleri (turuncu). Buna ek olarak, oksijen düzeyleri azalma SB tedavi örnekleri son keneler sırasında önemli ölçüde azalır. N = 3 (B) grubu [sol] sigara normalleştirilmiş OCR düzeyleri başına AKOS algoritma hesaplanır. Hesaplama yanlış önce ve sonra bağlantı noktası bağlantı noktası A. (C) [sol] 'Sabit' algoritma hesaplama (A) olmayan normalleştirilmiş OCR gösteren enjeksiyon önce ölçüm için OCR A. [sağ] normalleştirme tarafından SB enjeksiyon OCR benzer düzeyde gösterir . Burada, OCR yakından oksijen kullanımı SB tedavi üzerine kafa geçici artış temsil eder; [Sağ] A. hata çubukları bağlantı noktasının enjeksiyon önce ölçüm için OCR normalleştirme S.E.M. tüm grafiklerde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim yeni teknik yaşlanma metabolik değişiklikler ve hastalık bütün sinek kafa kesimleri22bağlamında incelemek için yeni bir yaklaşım sunar. Yöntem de KDAC sodyum bütrat oksijen tüketimi etkisini incelemek için uygun olması. Biz gösterildiği lizin deacetlyase inhibitörleri (HDACs/KDACs) OCR değişiklikleri neden. Esasen, böyle inhibitörleri hedefler (Bu inhibitörleri Sınıf III uyku, Sirtuins değil etkisi) mitokondri içinde lokalize normalde olmayan24, tür ilaçlar sadece test edilebilir üzerinde bir en az doku düzeyi. Gerçekten de, çeşitli ilaçlar doğrudan beyne böylece sindirim sistemi tarafından olası işleme/değiştirme/inactivation atlayarak, enjekte edilir. Bu nedenle, bizim teknik baş kesimi nasıl böyle doğrudan etkisi uyuşturucu içine yeni bilgiler sunar.

Birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, iletişim kuralında belirtildiği gibi iki kişinin plaka hazırlanması ile küçük bir saat, bir tabak hazırlama önerilir. Bizim deneyim, kalite ve istikrar OCR ölçümlerin zaman zamanında hazırlanan daha iyi. Ne zaman çok uzun sürdü, istikrarlı OCR daha kısa süre yanı sıra düşük OCR alıcı kuyu oluşumu artmaktadır. İkinci olarak, kalite kontrol yapmak ve çeşitli örnekleri arasında deneysel koşullar benzer (pH, oksijen seviyesi) olduğundan emin olmak önemlidir. Son olarak, önemli bir adım doğru algoritma örnekleri analiz etmek için seçmektir. Biz gösterildiği varsayılan AKOS algoritma oksijen yüksek oranları13tüketilen örnekleri yanıltıcı ve bazen karşıt hesaplamalarda vermiştir. Biz bu nedenle oksijen düzeyleri için ham veri kontrolü ve elde edilen OCR karşılaştırarak önemini vurgulamak.

Şu anda, bu teknik ile bazı sınırlamaları vardır. Oda sıcaklığında makine ilâ 31 ° (Bu en az ölçüm sıcaklığı makine oda sıcaklığında ise) C, ısıtır sinek kafa25bir stres durumu temsil. Bu ancak 25 ° c ölçümleri sağlayacak bir soğuk oda makine yerleştirerek üstesinden gelebilir ve dolayısıyla sinek başkanları için olası ısı stres olmadan. Son rapor böylece sinekler 25 ° C21OCR kaydını etkinleştirme 11 ° C'de makine yerleştirerek göstermiştir. Yine de, sinek kafa ayrılık oda sıcaklığında yapılmalıdır. Ayrıca, sıcaklık derecesi fluctuations zorlu denetim pH değişiklikleri yapmak ve bu nedenle oldukça benzer deneysel kurulumları kullanarak OCR fizyolojik koşullar/ilaç etkisini test etmek için tavsiye edilir. Buna ek olarak, katkı oksijen tüketimi olmayan-mitokondrial-bağımsız mekanizmalar tarafından kurulan26henüz olmamıştır. Sinek kafasına verimli çeşitli solunum inhibitörleri kullanarak, böyle mitokondrial Sigara oksijen Tüketim oranları kurmak mümkün olacaktır.

Bu çeşitli memeli maladies değişiklikler enerji metabolizması ile karakterize dikkat çekicidir. Bunlar arasında kanser gibi her iki metabolik azaltma Alzheimer hastalığı gibi veya metabolik tarafından karakterize hastalıklar uyumlanma. İlginçtir, KDAC inhibitörleri Alzheimer hastalığı ve kanser tedavi27için kullanılır. Hangi KDAC tarafından inhibitörleri ve tedavi edici yönü ulaşmada vardır kesin mekanizmaları belirsiz kalırken, bizim teknik verilerden böyle inhibitörleri metabolizma modüle roman kavramı destekler.

Özet olarak, bu yöntem genel oksijen tüketimini ölçme vivo içinde oranları ve daha doğru bir şekilde izole mitokondri protokolleri12' gözden genel metabolizma üzerinde uyuşturucu etkileri görüntüler için değerlidir. Örneğin, bu yöntemi, yerine önceki teknikleri, elde edilen sonuçlar yaş ilişkili metabolik değişmezlik KDAC tedavi üzerine yeni trendleri karıştığı. Ek iş en iyi duruma getirmek için gerekli ise deneysel koşullar için kafaları uç, bizim teknik ve uygun analiz ile birlikte tüm yaşam dokuları bağlamında mitokondrial aktivitesinin daha fazla aydınlatma neden olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andreas Ladurner, Carla Margulis'in ve takımları kapsamlı deneysel destek için teşekkür ederiz. Caitlin Ondracek el yazması üzerine onun yorum için teşekkür. Sofia Vikstrom bize bu tekniği erken aşamalarında oluşturmada yardım için teşekkür etmek istiyorum. Biz de onun teknik yardım için olabilir Sanderhoff teşekkür ederim. LB Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma (Infrafrontier grant 01KX1012) tarafından finanse edilmektedir. SP AXA araştırma fonu doktora sonrası Bursu ve NSFC (Grant numarası 81870900) tarafından finanse edildi. AVV QBM tarafından finanse edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GlikozSigma-AldrichG8644D-(+)-H2O içinde 100 g/L glikoz çözeltisi, steril filtreli
XF testi OrtaAgilent103575-100Denizatı XF DMEM Ortamı, pH 7.4
Sodyum bütiratMerck817500XF tahlil tamponunda çözünmüş
Denizatı XF24/e24 analizörüAgilent
XF24/e24 Hücre Dışı Test KitiAgilent100850-001Kartuş
XF24/e24 Adacık Yakalama MikroplakalarıAgilent101122-100Plakalı Denizatı
Yakalama Ekranı Ekleme AracıAgilent101135-10Yerleştirici
Petri kabıSarstedt821,472Petri kabı 92 x 16 mm

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. 283 (5407), Science. New York, N.Y. 1482-1488 (1999).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  3. Cunnane, S., et al. Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease. Nutrition. 27 (1), Burbank, Los Angeles County, Calif. 3-20 (2011).
  4. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350 (6265), Science. New York, N.Y. 1204-1207 (2015).
  5. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).
  6. Zhang, X., et al. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nature communications. 5, 3295(2014).
  7. Wheaton, W. W., et al. Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis. eLife. 3, e02242(2014).
  8. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS one. 6 (3), e18317(2011).
  9. Baker, D. J., Peleg, S. Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging. Trends in biochemical sciences. 42 (9), 702-711 (2017).
  10. Zhao, S., et al. Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327 (5968), Science. New York, N.Y. 1000-1004 (2010).
  11. Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria. Trends in biochemical sciences. 41 (3), 231-244 (2016).
  12. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
  13. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific reports. 8 (1), 4199(2018).
  14. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
  15. Newell, C. Physiological Entomology. 41, 96-102 (2016).
  16. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6 (7), e21746(2011).
  17. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PloS one. 7 (5), e33023(2012).
  18. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature. 11 (10), 1798-1816 (2016).
  19. Kumar, M. G., et al. Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome. eNeuro. 3 (2), (2016).
  20. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).
  21. Neville, K. E., et al. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).
  22. Peleg, S., et al. Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila. EMBO reports. 17 (3), 455-469 (2016).
  23. Peleg, S., et al. Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328 (5979), Science. New York, N.Y. 753-756 (2010).
  24. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochimica et biophysica acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  25. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of ageing and development. 5 (5), 347-370 (1976).
  26. Banh, R. S., et al. PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia. Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).
  27. Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders. Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksijen T ketim H zMetabolik Aktivite l mT m Doku AnaliziMitokondriyal FonksiyonLizin Deasetilaz nhibit rleriYa lanma Ara t rmalarla Metabolizma EtkileriFizyolojik Durum ModellemeBiyokimyasal Analiz Y ntemleri

İlgili makaleler