Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Lenf damarları ve LECs rolünü karaciğerde de anlaşılmış değildir. Olsa da lenf damarları karaciğer¹ portal üçlü içinde bulunur ve hastalık²sırasında genişletin, çok az işlev ve LECs fenotip içinde karaciğer ile ilgili anlaşılmaktadır. Üzerinde öncelikle³LECs bulunur işaretleri keşfi ile bu hücrelerin farklı doku nişler homeostazı ve hastalık içinde önemini anlayışımızın önemli bir boşluğu dolduracaktır. LECs doğrudan T hücreleri^4,5,6,7,8ile^, etkileşerek periferik tolerans lenf nodu ve metastatik tümörler korumada önemli bir rol var ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs lenf düğümünde koruyucu bağışıklığı göçmen dendritik hücreler^14,15,16ile onların etkileşim yoluyla teşvik. Bu nedenle, doku ve etkileşimleri mevcut oldukları için belirli olabilir LECs için birden çok rol vardır. Ancak, çok az doku bağışıklık hücreleri nasıl LECs etkileşim veya nasıl farklı organ sistemlerinde LECs çalışması hakkında anlaşılmaktadır; Böylece, LECs karaciğer veya diğer organlara içinde hücre başına bazında değerlendirilmesi nasıl LECs doku özgü bağışıklık programı gelişmeler yol açabilir. Karaciğerde LECs üzerinde duruluyor edebiyat çoğunu LECs bir ya da iki işaretleri ve morfoloji¹⁷kullanarak görselleştirmek için mikroskobu kullanırken, çok az özellikle LECs akış sitometresi, yine de bir çalışmada kullanılarak hücre hücre için ayrı ayrı değerlendirmek için yapılmıştır karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri (LSECs) ve LECs¹⁸arasındaki farklılıkları değerlendirmek. LEC nüfus karaciğerde akış sitometresi tarafından analiz edememek LEC fenotip derinlemesine çalışma için normal homeostazı veya hastalık sırasında sağlar.

LECs tarafından akış sitometresi değerlendirmek için birden fazla yüzey işaretleyicileri ihtiyaç vardır. Genellikle, LECs ifade prospero ile ilgili homeobox 1 (Prox-1), lenf damarı endotel hyaluronan reseptör 1 (LYVE1) veya vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör 3 (VEGFR3) mikroskopi kullanarak tarafından görüntülenmiştir. Ancak, karaciğerde, bu işaretleri ifade LECs için sınırlı değildir. Prox-1 yaygın tarafından hepatosit karaciğer geliştirme, yenilenme ve yaralanma¹⁹sırasında ifade edilir ve LYVE1 ve VEGFR3 karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri¹⁸tarafından ifade edilir. Lenf düğümünde, LECs akış sitometresi farklılaşma (CD) kümeleri kullanılarak tanımlanır CD45-, CD31 + ve podoplanin + (PDPN)¹⁶. Ancak, bu yaklaşım LECs karaciğerde CD45 - CD31 + hücreler endotel hücreleri ele geçirecek, ve vasküler endotel hücreleri karaciğer baskın nüfusu LSECs yana yalıtmak için de en az düzeydedir. Böylece, diğer işaretleri bol LSEC nüfus nadir LEC popülasyondan ayırt etmek için ihtiyaç vardır. CD16/32 (olgun LSECs¹⁸tarafından ifade edilir) ve CD146 (içinde karaciğer sinusoids karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri²⁰ az lenfatik tarafından herhangi bir ifade ile ifade edilen ağırlıklı olan bir ortak vasküler endotel hücre işaretçisi endotel hücreleri²¹) aday işaretleri vardı.

Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş izole edip yukarıdaki işaretleri, CD45, CD31, CD146, CD16/32 PDPN akış sitometresi için kullanma ve karaciğerde LECs görüntülenmesi için bir yöntem. Biz collagenase IV kullanımı, DNaz 1 ve karaciğer dokusu sindirim içine bir tek hücre süspansiyon için mekanik ayırma açıklar. Biz de iodixanol yoğunluk gradient yalıtım parenkima hücre (NPC) ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, birden çok işaretçileri kullanarak, LECs ile PDPN baskın marker olarak karaciğer tanımlamak için en uygun akış sitometresi gating strateji belirleriz.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından onaylanmıştır.

1. hazırlık malzemeleri

1. DNaz, 5 mg/mL solüsyon yapmak ı fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
2. Tıklayın'ın EHAA medya için 5000 U/mL collagenase IV ekleyerek bir sindirim karışımı olun.
3. Sindirim karışımı kullanmadan 30 dk önce için 37 ° C'de ısıtın.
4. Bir yalıtım arabellek % 4.8 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek getirin.
5. 100 mM amonyum klorür, 10 mM KHCO₃ve 0,1 mM EDTA H₂O. distile ekleyerek bir kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tampon yapmak

2. bir tek hücre süspansiyon bir fare karaciğer üzerinden hazırlanması

1. Fare ile CO₂ ve servikal çıkığı ötenazi.
2. Fare kürk ıslak için % 70 etanol ile aşağı sprey. Fare pin bir diseksiyon tahta metreye.
3. Yaklaşık 1 cm yukarıda sadece deri (yaklaşık 1 mm) yoluyla kesmek dikkatli olmak anüs, deriyi kesme diseksiyon makası kullanarak. Deri vücuttan dişli forseps ile çekin ve cilt ve karın zarını arasındaki makas ekleyin. Cilt periton ayırmak ve sonra belgili tanımlık kesme cilde boyun kesim için makas açın.
4. PIN diseksiyon kurulu her kol altında ve her bacak üstü bir PIN kullanarak cilde. Periton sac yukarı çekin ve yukarı doğru boyun kesti. Karaciğer lobları kapmak ve göğüs kemiği altında sadece kesti.
   Not: herhangi bir karaciğer immünhistokimya (IHC) için kullanılacaksa, özen gösterilmelidir.
5. Karaciğer kesmek ve fare karaciğer çıkarın ve 4 mL tıklayın'ın EHAA medya yerleştirin.
6. Bir neşter kullanarak, karaciğer ~ 1 mm çap parçalar kesin.
7. 500 µL sindirim karışımı ekleyip DNaz 500 µL karaciğere ben (2 mg/mL).
8. Karaciğer 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 15 dakika sonra 5 mL pipet kullanarak sıvı karışımı.
9. Kuluçka 30 dk sonra sindirilir örnek 50 mL konik tüp 100 µm süzgeç aracılığıyla aktarın.
10. Yavaşça kalan parçaları 1-mL şırınga pistonu ile filtre aracılığıyla itin.
11. Yalıtım arabelleği 5 mL filtresiyle yıkama ve yavaşça doku bir dalgıç arkası ile süzgeç aracılığıyla 1 mL şırınga itin. Filtre yalıtım arabellek 25 mL ile yıkanmış alıncaya kadar bunu yineleyin.
12. 5 dk. dikkatle Aspire için süpernatant 400 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi.
13. Pelet RBC lizis arabellek 4 mL ile resuspend. Hücreleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
14. Yalıtım tampon ve 5 min için 400 x g , santrifüj 10 mL hücrelerle yıkayın.
15. Tam karaciğer sayısını belirlemek için bir hemasitometre üzerinde hücreleri saymak.
16. 5 mL % 20 iodixanol de hücrelerde resuspend ve onları PBS 1 mL ile katman.
17. Hücreleri vasıl 300 x g bir fren olmadan 15 dakika santrifüj kapasitesi.
18. PBS ve iodixanol arasında kat kaldırmak ve, 100 µm filtreden bir yeni 50 mL konik tüp içine koyun.
19. Yalıtım tampon ve 5 min için 400 x g , santrifüj 10 mL hücrelerle yıkayın.
20. Süpernatant atın ve PBS 500 µL % 2 fetal Sığır serum (FBS) ile hücrelerde resuspend.

3. akış sitometrik analizinde tek karaciğer hücrelerinden

1. Bir hemasitometre ve hücrelerin ölçmek için trypan mavi dışlama kullanarak mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Trypan mavi 10 µL için hücre 10 µL ekleyin ve hemen onları bir hemasitometre üzerinde yer ve mikroskop altında canlı hücreleri (mavi değil) saymak. Sonra microliter başına hücre sayısını hesaplayın.
2. Aliquot yaklaşık 5 milyon 96-şey plaka tek bir kuyuya kalan nonparenchymal hücrelerinin.
3. Senaryo Özeti 400 x g 5 min için santrifüj kapasitesi.
4. Süpernatant atmak ve PBS 90 µL % 2 ile hücrelerde resuspend FBS.
5. Anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) ve PDPN (1: 200) 10 2.4G2 veya anti-CD16/32 (1: 200) x 10 µL içinde seyreltilmiş ekleyin.
   Not: Anti-CD16/32-etiketli antikor kullanıldığında herhangi bir Fc engelleme (2.4G2) kullanılmıştır.
6. Pozitif ve negatif kapıları nerede ayarlanması gerekir belirlemek için bir (FMO) leke her renk ve bir izotip kontrol antikor için eksi bir floresan içerir.
7. Canlı ve ölü hücreleri belirlemek için bir canlılık işaretleyici (örneğin, hayalet kırmızı 780) ile leke. 30 dk için 4 ° C'de hücreler kuluçkaya.
8. PBS 100 µL % 2 ile hücrelerle yıkama FBS.
9. Küçük bir aliquot hücre lazer ve tazminat akış sitometresi ayarları için kullanın. Her bireysel fluorophore ve herhangi bir antikor olmadan tek bir antikor hücrelerle leke.
   Not: Kullanılan akış sitometresi bağlı olarak bir tazminat matris spektral örtüşme kaldırmak için kurulmalıdır.
10. Örnek tüp sitometresi prob üzerine yerleştirin ve toplamak ve tüm olayları kaydedin.

4. veri analizi

1. Yan-dağılım alanı vs ileri-dağılım alanı arıyorsunuz, "canlı" hücreleri üzerine boyutu ve parçalı yapı ve canlılığı marker boya alarak kapıya.
2. Ardından, CD45 parlak mor 510 ve CD31 PerCp Cy5.5, pozitif ve negatif örneğin alınma olasılığını belirlemek için izotip kontrol eder ve FMO kullanarak CD45 - CD31 + hücre kapısı kullanarak.
3. Son olarak, CD146 v450 veya CD16/32 FITC ve PDPN APC kullanarak, CD146 - PDPN + veya CD16/32 Al-izotip kontrol eder ve FMO, pozitif ve negatif örneğin alınma olasılığını belirlemek için kullanarak yeniden PDPN + hücreler,. Bu LECs hücrelerdir.

Karaciğer Lenfleribile analiz çalışmaları öncelikle immünhistokimya frekans ve lenf damarları karaciğer çapını quantitate için kullanmış. Ancak, bu yöntem LECs değerlendirme hücre hücre olarak veya ifade birden çok işaretçileri, sitokinler, kemokinler veya transkripsiyon faktörleri için izin vermez. Bu nedenle, biz sordu olup olmadığını karaciğer LECs karaciğer izole olabilir ve akış sitometresi kullanılarak hesaplandı. Önceki çalışma lenf nodu LECs izole Liberase DL (collagenase ı-II-ve-dispase) ve DNaz iğneler14,16ile lenf nodu doku mekanik ayrılması ile birlikte 1 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu nedenle, karaciğer dokusu üzerinde aynı sindirim protokolün kullanılmış olduğunu veya daha önce açıklanan, karaciğer22 bağışıklık hücre izolasyon için ve sindirim ile bir yoğunluk degrade renk ayrımı (iodixanol) adım takip collagenase IV ve DNaz 1 kullanıldı hepatositlerin kaldırmak ve diğer hücre tipleri (Şekil 1A) karaciğer içinde sıklığını artırmak. Karaciğer sindirim ve Santrifüjü yoğunluğu gradyan ile aşağıdaki hücreleri CD45, CD31, PDPN ve CD16/32 ile lekeli. CD16/32 olgun LSEC nüfus ama değil LEC nüfus18tarafından ifade edilebilir nitelendirdi. Böylece, LECs CD45-, CD31 +, CD16/32 geçişli-, PDPN + hücreleri, LSECs CD45-, CD31 +, CD16 geçişli iken / 32 + ve PDPN-(Şekil 1A). Gates canlı hücreleri (hayalet kırmızı negatif) ayarla ve izotip kontrol eder ve (Şekil 1A) boyama FMO dayalı. LYVE-1 APC LEC nüfus da teyit (Şekil 1B) oldu. Her iki yöntem karaciğer içinde LEC nüfusunun görselleştirme izin; Ancak, hücre boyama profil collagenase IV ve DNaz 1 collagenase ı-II-ve-dispase (Şekil 1 c) kullanırken görsel olarak daha iyi. Bu nedenle, tüm gelecekteki manipülasyonlar collagenase IV ve DNaz 1, kullanma iletişim kuralında tanımlandığı gibi yapıldı. Ortalama olarak, yaklaşık 1.300 LECs karaciğer dokusunun gram başına veya saf karaciğer, başına 2.200 LECs Bu sindirim yöntemi kullanarak elde.

Perdeleme strateji ve fluorophores birleşimi en iyi duruma getirmek için ve LSECs kirlenme ortadan kaldırmak için CD16/32 ve CD146 kullanıldı. CD16/32 Fc gama reseptörleri II ve III ve olgun LSECs ama LECs18üzerinde ifade edilir. CD16/32 PDPN + CD16/32-hücre PDPN-CD16 ayırt / 32 + hücreleri, özellikle ne zaman PDPN kullanarak Birleşik APC veya PE ve CD16/32 de ne zaman PDPN PE-Cy7 (Şekil 1 c) Birleşik daha az, ama FITC (Şekil 1A) için Birleşik. Ifade CD16/32 LECs üzerinde bulunamadı ama LSECs üzerinde bulunur. FC bloğu CD16/32 antikor Fc reseptör bağlama ve nonantigen belirli bağlama Fc reseptörleri immünglobulin en aza indirmek için kullanır. CD16/32 LSECs görselleştirmek için kullanılan non-spesifik bağlama immünglobulin daha yüksek ve CD146 LSECs ölçmek için alternatif olarak optimize edildi. Bu nedenle, test ettik V450, son derece LECs23tarafından LSECs ve diğer vasküler endotel hücreleri20 ancak düşük herhangi bir ifade olarak ifade edilen bir vasküler endotel hücre işaretçisi için Birleşik CD146. Biz ilk CD146 boyama optimize CD16/32 ve CD146 için FMO ve izotip denetimlerini kullanarak (Şekil 2A). Biz sadece CD16 değerlendirildi Eğer / 32 + hücreleri veya CD16/32-hücreleri, CD16 / 32 + hücreler, tüm CD146 + ve PDPN - CD16/32-hücre öncelikle CD146 - ve PDPN - ya da PDPN + (Şekil 2B) iken vardı. Bu boyama onaylamak için FMO kullanıldı. PDPN leke kaldırarak, PDPN + nüfus (Şekil 2C) kayboldu. İlginçtir, CD146 değil ya da çok basit PDPN + LECs tarafından ifade edilir olduğunu doğrulayan hiçbir CD146 + PDPN + hücre, edildi. Böylece, biz de bu işaretleri kullanılabilir eminiz Gate karaciğerde vasküler endotel hücreleri dışarı.

Daha fazla PDPN LECs için uygun bir işaretleyicidir doğrulamak için fare karaciğer bölümleri PDPN (yeşil) ve F4/80 (kahverengi) (Şekil 3A) ile lekeli. PDPN vasküler endotel de makrofajlar içinde fare karaciğer dile getirdi. Ayrıca cholangiocytes, PDPN, lenf damarları, farklı nükleer yapılar olarak safra kanallarının ve cytokeratin 7 boyama tarafından temel üzerinden için olumlu leke olabilir ayırt etmek başardık (Şekil 3B; kırmızı: cytokeratin 7, yeşil: PDPN). Birden çok işaretleri cholangiocytes24tarafından ifade değil, CD31 gibi akış sitometresi için kullanılan bu yana biz bu hücreler analizinden kaldırıyorsunuz, böylece teyit CD45-, CD31 +, CD146 olan karaciğer hücreleri eminiz Lo/neg, CD16/32-, ve PDPN + LECs. Son olarak, lekeli hücreleri LECs olduğuna dair bir kanıt sağlamak için biz hücreleri bu popülasyon sıralanmış ve nitel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu Vegfr3 ve prox-1 deyimleri değerlendirmek için kullanılır. Vegfr3 ve prox-1 değerlendirildi, bu tutanaklar diğer hücreleri karaciğer tarafından ifade edilir gibi —prox1 tetkikine ve Vegfr3 LSECS tarafından (diğerleri) — ama hiçbir diğer hücre LECs yanında her ikisi de hızlı. Her iki işaretleyiciyi de ifade normalde bu işaretleri ifade değil ama benzer ifade kültürlü fare LECs (Şekil 3 c için kültürlü fare makrofaj hücre hattı (RAW264.7) sıralanmış popülasyonda daha yüksek ).

Resim 1 : Collagenase ı-II-dispase ve collagenase IV sindirilmiş fare karaciğer dokusu temsilcisi Akış Sitometresi Analizi. (A) Bu panel gösterir gating strateji, floresan bir boyama, eksi ve izotip yordamı için denetler. (B) Bu panel gösterir LYVE-1 CD16/32 boyama-PDPN + hücreler. (C) Bu panel gösterir son akış sitometresi kapısı ya da collagenase ı-II-dispase (Örneğin, Liberase DL) ile fare karaciğer sindirerek sonra veya collagenase IV ve CD16/32 PerCP X PDPN PE-LECs CD16/32 nerede Cy7 değerlendirilmesi- ve PDPN +. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : CD146 ve PDPN tanımlaması olarak karaciğer lenfatik endotel hücreleri için uygun işaretleri. (A) Bu paneli gösterir floresans eksi bir ve izotip denetimlerinde CD16/32 (solda) ve CD146 (sağda). (B) Bu panel kapı CD16/32 pozitif veya negatif hücreleri paneli Anoktasından belirlenen gösterir. Her iki örneğin alınma olasılığını CD146XPDPN gösterilir. (C) Bu panel floresans eksi bir PDPN boyama antikor değil eklendiğinde yok olduğunu ispat için gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Akış PDPN + tanımlaması hücreleri olarak lenfatik endotel hücreleri. (A) Bu paneli gösterir temsilcisi immünhistokimya bir fareden karaciğer PDPN (mavi/yeşil) ve F4/80 (kahverengi) ile lekeli. Lenf damarı (LV), kan damarı (BV) ve makrofaj (MF) etiketlenir. Ölçek çubuğu = 100 deparaffinized ksilen içinde 20 dk için µm. parafin gömülü doku Formalin sabit. Doku etanol bir degrade su sulu ve antijen alma için 15 dk. doku % 0,1 BSA kullanılarak engellendi bir düdüklü tencere bir pH 6 antijen alma arabellek kullanarak gerçekleştirilmiş ve anti-fare PDPN ve anti-fare F4/80 oda, 1 h için kullanarak lekeli sıcaklık. Anti-hamster IgG HRP ve anti-tavşan IgG HRP ikincil antikor kullanılmıştır. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + ve Vina yeşil F4/80 ve PDPN, sırasıyla algılamak için kullanılmıştır. Doku hematoksilen ile counterstained ve mikroskop görüntüsü. (B) Bu panel olduğu gibi paneli bir, burada dışında gerçekleştirilen aynı deneyi gösterir, PDPN kırmızı ve 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mavi yeşil, cytokeratin 7 gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = %5 eşek ve % 5 keçi serum kullanarak ve oda sıcaklığında 1 h için anti-fare PDPN (8.1.1) 1: 100 ve anti-fare cytokeratin 7 1: 200 kullanarak lekeli doku bloke. Anti-hamster IgG AF647 ve anti-tavşan IgG-PE ikincil antikor kullanılmıştır. Doku DAPI ile counterstained ve görüntüsü. Ölçek çubuğu 100 µm =. Lenf damarı (LV), kan damarı (BV) ve safra kanalını (BD) etiketlenir. (C) Bu panel bir günlük kat sıralanmış karaciğer üzerinde ham hücreleri veya birincil fare lenf nodu LECs ile karşılaştırıldığında Protokolü (CD45-, CD31 +, CD146lo/negve PDPN +) boyama LECs dayalı Vegfr3 ve prox-1 ifadeden değişim gösterir. Sıralanmış hücreleri bir biyopolimer parçalama sütun geçirildi, RNA bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak ayıklandı ve cDNA Ters transkripsiyon kiti kullanılarak yapıldı. Transkript bereket temizlik gene, Gapdh, her örnek için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.