Method Article

Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır

DOI:

10.3791/58654

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli fare doku işleme için fare histopatolojik analiz insan numuneler ile karşılaştırıldığında kalitesini azaltır. Burada, robot sistemleri işleme ve insan örnekleri katıştırma için rutin olarak kullanılan fizibilite göstermek için fare iltihaplı ve uninflamed kolon dokularında histopatolojik incelenmesi gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan hastalıkları anlayış hayvan modelleri çalışma sayesinde büyük ölçüde genişletti. Yine de, deneysel modeller histopatolojik değerlendirilmesi olarak insan örnekler için uygulanan sıkı olması gerekiyor. Nitekim, güvenilir ve doğru kararınızı eleştirel doku bölümü hazırlık kalitesi ile etkilenir. Burada, biz yordam, parafin gömmenin fare örnekleri ilk hazırlanması sırasında birkaç otomatik adımları uygular histopatolojik analiz fare dokuların bir protokol tanımlamak. Metodolojik değişkenler üzerinden titiz Protokolü standardizasyon otomatik yordamlar gelen azalma artan genel güvenilirliğini fare patolojik analiz için katkıda bulunur. Özellikle, bu iletişim kuralını otomatik işleme kullanımını açıklar ve robot sistemleri, gömme rutin olarak doku işleme ve parafin insan örnekleri katıştırma için fare bağırsak iltihabı örnekleri işlemek için kullanılan. Biz standart ve otomatik teknikleri getirilmesi fare dokuların histopatolojik muayene güvenilirliğini önemli ölçüde arttığını sonucuna.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, insan hastalıkları1,2için önde gelen patojenik mekanizmaları incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bir hastalığın şiddetini değerlendirmek için araştırmacılar bir tedavinin etkisini değerlendirmek ve çalışma saytolojik ve histolojik mimari farklılıklar veya iltihap3miktarı. Bu modeller üzerinde gerçekleştirmek için detaylı histopatolojik analizler, fare ve insan örnekleri4,5kez karşılaştırma ihtiyaç vardır.

Ayrıca, insan örnekleri yaygın olarak işlenir ve histopatoloji çekirdek özellikleri tarafından attı ve histopatolojik kriterleri ve yöntemleri ile deneyimli insan patologlar standart. Bunun tersi olarak, fare dokular genellikle sabit, gömülü ve histopatolojik iletişim kurallarının sınırlı deneyimi olan araştırmacılar tarafından incelendi. Histopatolojik inceleme güvenilirliğini ve kalitesini yüksek kaliteli doku bölümleri hazırlanması ile başlar. Çeşitli faktörler eleştirel artmak ya da azalmak fiksasyon, makroskopik dahil olmak üzere son tahlilde kalitesini kesit, işleme, alkol gömme ve örnekleri6,7/ katıştırma için katkıda bulunur.

Manipülasyon örneği içeren bu pasajlar el ile hataları el ile gömme örnekleri de dahil olmak üzere ve daha az bir ölçüde, kesit ve boyama el ile microtome tabi tutulmaktadır. Şu anda, tüm fare doku hazırlık histolojik değerlendirme için Laboratuvar Laboratuvar farklı protokolleri ve el ile iletişim kuralları üzerinde dayanır. Bu çalışmanın amacı hatalar ve fare histopatolojik Muayene değişkenliği azaltmak için standart otomatik iletişim kuralları uygulamaktır.

Bilgimizi, burada ilk iletişim kuralları işleme ve fare dokuların histolojik değerlendirme için gömme tam otomatik dokusu için tanımlamak; Bunlar düzenli olarak insan numune analizleri için patoloji birimlerinde kullanılır. Yöntem fizibilite pratik bir örnek olarak, bağırsak iltihabı fare modeli, yani analiz edilmiştir, kronik kolit modeli tarafından neden yinelenen yönetim dextran sodyum sülfat (DSS) içme suyu8 ,9. DSS-tedavi hayvanlar Örneğin, kilo kaybı, gevşek dışkı veya ishal ve kolon gibi fibrozis kısalma bağırsak iltihabı belirtileri sergileyen bu yana bu deneysel ayarı yakından benzer insan iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD)10 8,9,11. İnsan IBD hastalar için gözlemlediği gibi DSS tedavi karmaşık hastalık sahası oluşturur. Bu bağlamda, ayrıntılı histolojik değerlendirme doku mimari derin İLETİMLERİNİZE anlamak için gereklidir. Bu nedenle, örnek hazırlık kalitesini artırmak için açıklanan protokoller uygulanması histolojik yorumlanması güvenerek araştırmacılar yararlanabilir ve immunohistokimyasal için fare deneysel ayarları inceliyor. İnsan hastalıkları doku mimari değişiklikler içeren fare deneysel modelleri, hücresel doku sızmak ya da farklı doku ve organların (bağırsak, beyin, karaciğer, cilt) iltihabı varlığı artan kalitesini kullanabilirsiniz histopatolojik inceleme için örnek hazırlanması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan yordamlar İtalyanca (auth 127/15, 27/13) Sağlık Bakanlığı tarafından kabul edildi ve onkoloji IACUC (kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi) Avrupa Enstitüsü ve hayvan bakımı kuralları takip

1. kronik kolit indüksiyon tekrarlayan DSS yönetim tarafından

  1. Ayrı yaş ve cinsiyet 2 grup (kontrol H2O vs tedavi DSS, deney grubu başına en az 5 fareler littermates) farelerde eşleştirdi.
  2. % 2.5 yönetmek DSS (40 kDa) 7 gün tedavi grubuna ve kontrol grubuna su içme suyu.
    Not: Bu model bir kronik transmural bağırsak iltihabı9neden olmaktadır.
  3. 7 gün sonra DSS tedaviyi durdurunca ve 14 gün boyunca her iki grup için su verin. Bu işlem 3 kez tekrarlayın.
    Not: DSS tekrarlayan yönetim yakından insan IBD, yani, fibrozis9benzeyen bağırsak mukoza değişikliklere neden olmaktadır.
  4. Fareler tarafından kurumsal IACUC, yani yetkili yordamlara, göre CO2 inhalasyon tarafından kurban.
  5. Fare karın ve karın zarını neşterle açmak.
    Not: Kısırlık önerilir ancak kesinlikle gerekli.
  6. İki nokta üst üste ince bağırsak forseps ve cımbız ile ayırın. İki nokta üst üste cımbız ve forseps ile tüketim.
    Not: İki nokta üst üste uzunluk ölçüm (Şekil 1A) kolit DSS tedavi edilen farelerde meydana Eğer belirlemek için bir yöntemdir.
  7. Bir petri soğuk 1 fosfat tampon serum (PBS) x 10 mL ile iki nokta üst üste durulama ve fekal malzeme çıkarmak için hafifçe bastırın.

2. fare doku fiksasyon

  1. 10 ml % 10 fare her iki nokta üst üste numune bırakın tarafsız arabelleğe alınmış Formalin (NBF) RT (Oda sıcaklığında).
    Not: Kısırlık önerilir ancak kesinlikle gerekli.
  2. 18-24 h için doku RT. düzeltmek

3. kolon kesit ve doku hazırlık

  1. Sabit dokular NBF kapsayıcıdan küçük cımbızla çıkarın ve bir kabında koydu. İki nokta üst üste ile küçük cımbız bir parça iş tabağa koy.
  2. İki nokta üst üste parçaları (0,3 cm uzunlukları 0.2 cm) steril neşter ile kesti. Bu parça uzunluğu kaset kalınlığını aşmayacak şekilde sırayla en iyi yöntemdir.
  3. Bir iki nokta üstüste segmenti kadar küçük cımbızla (Şekil 2A) seç. Bir iki nokta üstüste kesimi küçük cımbızla (Şekil 2B) kaset katıştırma odaklı parafin ipuçları çıkıntılı plastik birini takın.
  4. Kaset başına bir ek 3 iki nokta üstüste parçalarla (3.2-3.3) işlemini yineleyin. Segmentleri dokuları örtüşen en aza indirmek için bitişik çıkıntılı ipuçları ekleme kaçının
  5. Sıkıca kaset dikkatle dört kenarları (Şekil 2C) iterek kapatın. Doku hasarı önlemek için doku sıkma kaçının.
  6. Izgarayı plastik bir destek çerçeve içine yerleştirin. Örnek tanımlamak için destekleyici çerçeve etiket. Her biyolojik örnek için yineleyin.

4. doku işleme

  1. Otomatik işlemcilerde (Şekil 3A, 3B) güç düğmesine basarak kapatın.
  2. Sıcak Parafin balmumu erime sağlamak için 1 h için. Parafin tamamen özel simge (Şekil 3 c) varlığı gözlemleyerek erimiş araç doğrular kadar bekleyin.
  3. Otomatik işlemcisi (şekil 3D) tarafından sağlanan metal sepet içine odaklı kaset (doku örnekleri içeren) her el ile ekleyin. Kasetleri yakın bir diğer sepet doluluk optimize etmek için astar tarafından dikey olarak yerleştirin.
  4. Metal sepet (Şekil 3E) kapatın.
  5. İmbik (Şekil 3F) kapağını açın. İmbik sepeti makinenin içine yerleştirildiği yer. Sepet işlemci (Şekil 3 g) özel gövde içine yerleştirin. İmbik (Şekil 3 H) kapağını kapatın.
  6. Dokunmatik ekran araç bilgisayarda çalışma Protokolü (Şekil 3I) tanımlamak için kullanın. Çözüm, zamanlama ve Tablo 1' de sağlanan düzenine göre uygulanacak sıcaklık sırasını seçin.
  7. Sepeti (Şekil 3J) özel bilgisayar ikonuna tıklayarak içeren imbik çalıştırılması için iletişim kuralı atayın. Protokolü Başlat düğmesini (Şekil 3 L) yanında tıkırtı üstünde başlamak.
  8. Özel simge varlığı gözlemleyerek ve makine gelen alarm zil sesi işitme tarafından Protokolü ' nün sonu araç onaylar kadar bekleyin.
  9. İmbik kapağını açın. Sepet işlemciden (Şekil 3 M) kaldırın.

5. doku gömme

  1. Otomatik embedder (Şekil 4A) güç düğmesine basarak kapatın.
  2. Sıcak Parafin balmumu erime sağlamak için 1 h için. Parafin tamamen aracı dahili termometre tarafından belirtilen parafin banyo sıcaklığı gözlemleyerek erimiş araç onaylar kadar bekleyin.
  3. Elle işlenmiş kaset işlemci sepetten embedder raf aktarın. Her raf en çok 32 kaset içerebilir. (Şekil 4B, 4 C).
  4. (Şekil 4 c, 4 D, 4E) ana embedder kapağı açın.
  5. Araç bilgisayarda robot için sinyal için dokunmatik ekranı kullanın bir raf olmak sistem takılı (Şekil 4F).
  6. Giriş konut kapak (Şekil 4 g) açın. Raf giriş gövde içine yerleştirin. Her embedder aynı anda 4 raflar içerebilir (Şekil 4 H, 4I). (Şekil 4J) giriş konut kapağını kapatın.
  7. Dokunmatik ekran araç bilgisayarda Tablo 2 göre (Şekil 4 K) gömme işlemi başlatmak için kullanın.
    Not: Her raf 32 kaset katıştırılması için 45 dakika sürer.
  8. Özel simge (Şekil 4 L) varlığı gözlemleyerek Protokolü ' nün sonu araç doğrular kadar bekleyin.
  9. Çıkış raf (Şekil 4 M) kaldırın. Ana embedder kapağını kapatın.
  10. (Yönlendirme ızgaralar içeren) katıştırılmış blokları rafa kaldırın. Katıştırılmış blok depolama mukavva koli içerisinde aktarın.

6. mikrometre kesit

  1. Microtome soğutma plaka üzerinde açın. -8 arasında sıcaklığı ayarlamak ve -10 ° c
  2. 2 L distile su içeren microtome, termostatik su banyosu üzerinde açın. Su banyosu 42-45 ° c arasında sıcaklık ayarlayın
  3. Yer parafin blok soğutma plaka üzerinde gömülü. Blok soğutmak izin vermek için en az 5 dakika bekleyin.
  4. Soğutma plaka bir blok alın ve microtome blok yuvasına yerleştirin.
  5. 10 µm kalınlık 6 kere keserek ila 10 µm. Trim blok kesme microtome ayarlayın.
  6. Microtome kalınlık ayarı 10 µm Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için 3 µm. kesim bir 3 µm bölümüne değiştirin.
  7. Küçük bir fırça 3 µm bölümle toplamak. 3 µm bölümüne su banyosunda dikkatle doku kırışıklıkları azaltmak için su yüzeyine döşeme koymak. Doku bölümü termostatik kontrollü su banyosundan bir tek cam slayt üzerinde toplamak.
    1. Gerekirse, ek bölümler kesti.
  8. Cam slayt örnek kimliği yazılı olarak etiketleyin.
  9. En az 10 dk. 37 ° C fırında slaytları koymak.
  10. Cam slaytlar raflar hemen analizleri veya saklama kutuları içine koymak.

7. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

  1. Otomatik stainer güç düğmesine basarak geçin. Robotik kol Başlatma araç monitör yükleme çubuğu değişikliği gözlemleyerek izin.
  2. Cam slayt dikey olarak 30 slaytlar ekleme stainer raf yerleştirin.
  3. Raf ile uygun radyo frekansı tanımlama (RFID) plastik etiket etiket. RFID etiketleme stainer bilgisayara yüklenen doğru boyama Protokolü tanımlayan bir sistemdir.
  4. Raf stainer yerleştirin. Bilgisayar otomatik olarak yüklemek ve RFID etiket tanıma göre boyama Protokolü başlatmak izin veriyor.
    Not: H & E boyama için protokol açıklanan Tablo 3.

8. immunohistokimyasal boyama

  1. İmmunohistokimyasal ve Mallory yukarıda açıklanan7olarak boyama trichrome gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İçme suyundaki DSS yinelenen yönetim tarafından indüklenen deneysel kronik kolit bağırsak iltihabı yakından benzeyen insan IBD8,9fare bir modeldir. Şekil 1 kısalma iki nokta üst üste (Şekil 1A), DSS kaynaklı inflamasyon varlığı ve pro-inflamatuar genlerin CXCL10 dahil olmak üzere kolon ifade puanı için yaygın olarak kullanılan parametre de dahil olmak üzere DSS tedavi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histopatolojik analiz için fare doku hazırlanması sırasında farklı otomatik adımları kullanmak. Bu iletişim kuralı tekrarlanabilirlik ve böylece son histopatolojik değerlendirme genel kalitesini arttırmak tüm süreç standardizasyonu artırmak için teknik ipuçları sunmayı amaçlamaktadır. Biz otomatik aletler ve hazırlık ve rutin olarak insan örneklerin incelenmesi için patoloji çekirdek tesislerinde kullanılan dokuların katıştırma yöntemleri hayata.

Bu yöntemin potansiyel uygulanabilirliği göster...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz IRCCS Policlinico hastane, Milan için teknik destek ve yardım için IEO hayvan tesisi patoloji bölümü Hayvancılık içinde teşekkür ederim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mutlak Etanol susuzCarlo Erba414605reaktifi
Mutlak ETOHHoneywell02860-1Lreaktif
Alüminyum Potasyum SülfatSIGMAA6435reaktifi
Anilin BlueSIGMA415049reaktifi
karbol FuchsinSIGMAC4165reaktifi
CD11b (klon M1/70)TONBO biosciences35-0112-U100antikoru
CD20 IHC (klon SA275A11)Biolegend150403antikoru
CD3 (17A2)TONBO biosciences35-0032-U100antikoru
CD4 (GK1.5)BD Biosciences552051antikoru
CD45.2 (klon 104)BioLegend109837antikoru
CD8 (53-6.7)BD Biyolojik bilimler553031antikor
Sitrat Tamponu pH 6 10xSIGMAC9999reaktifi
DabVektör LaboratuvarlarıSK-4100reaktifi
DPBS 1xMicrogemL0615-500reaktif
DSSTdB DanışmanlığıDB001reaktifi
EDTASIGMAE9884reaktifi
EnVision Flex Peroksidaz Bloke Edici ReaktifGV80011-2'de DAKOcompreso GV80011-2'de
EnVision Flex SubstrateDAKOcompreso GV80011-2'de
EnVision Flex/HRPDAKOcompreso
EnVision Flex+ Rat LinkerDAKOcompreso GV80011-2'de
EosinVWR1.09844reaktifi
F4/80 (klon BM8)BioLegend123108antikoru
FormalinPanReac2,529,311,215reaktif
buzlu asetik asitSIGMA71251reaktif
Keçi-anti-Sıçan-HRPAgilent DAKOP0448antikoru
HematoksilenDIAPATHC0303reaktifi
LEICA Döner mikrotom (RM2255)LeicaRM2255ekipman
Ly6g (klon 1A8)BD Biosciences551459antikoru
Cıva II OksitSIGMA203793reaktifi
Omnis Clearify Temizleme AjanıDAKOCACLEGALreaktifi
Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2reaktifi
Turuncu GSIGMAO3756reaktifi
ParafinSakura7052reaktifi
PelorisLEICAekipmanı
PercollSIGMAP4937reaktifi
RPMI 1640, L-GlutaminMicrogemL0501-500reaktifi
olmadan STS020Leicaekipmanı
Doku-Teck Paraform Bölünebilir KasetSAKURA7022ekipmanı
Tissue-Tek Otomatik parafin gömücüSakuraekipmanı
XyleneJTbaker8080.1000reaktif

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
  7. Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Tags

Robotic Tissue ProcessingMurine Sample EmbeddingHistological Analysis ProtocolAutomated Paraffin EmbeddingColonic Murine TissueIntestinal Inflammation ModelH E Staining ValidationImmunohistochemical StainingTissue Cassette PreparationAutomated Processor Operation

Related Articles