Yöntem makalesi

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

DOI:

10.3791/58655

⸱

8 Mart 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı ve dolaşımdaki RNA'ların (exRNA) birçok hücre türü vücut tarafından üretilen ve tükürük, plazma, serum, süt ve idrar gibi çok sayıda vücut sıvısı bulunmaktadır. Bu RNA'ların bir alt kümesidir posttranscriptional regülatör – mikroRNA (miRNAs). Belirli hücre tipleri tarafından üretilen miRNAs betimlemek için tüp bebek kültür sistemleri hasat için kullanılabilir ve hücre bir alt grubunu profil exRNAs türetilmiş. Mezenkimal Kök hücre salgılanan faktörler çok sayıda hastalıkları ortadan kaldırılmasına karıştığı ve burada tüp bebek modeli sistemi olarak kullanılır. Bu kağıt toplama işlemi, küçük RNA arınma ve Kütüphane üretimi için sıra ekstraselüler miRNAs açıklanır. ExRNAs kültür ortamından hücresel RNA düşük RNA giriş örnekleri, için en iyi duruma getirilmiş yordamları çağıran kalarak farklı. Bu iletişim kuralı her adım kalite kontrol noktalarında exRNA arıtma ve sıralamanın sırasında gösterilen için kapsamlı bir rehber küçük exRNA sıralama kültür ortamından sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı ve RNA'ların (exRNAs) dolaşan mevcut çeşitli vücut sıvıları ve dirençli doğru RNases1,2. Onların yüksek bereket, istikrar ve rahatlık-in erişilebilirlik tanılama ve prognostik işaretçileri3olarak klinik değerlendirmesi için caziptir. ExRNAs için ulaşım modu dahil hücre dışı veziküller (EVs), (örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein; lipoproteinler ile dernek HDL) ve Ribonükleoprotein kompleksleri (gibi Argonaute2 kompleksleri ile)4.

ExRNAs bir alt kümesidir yaklaşık 22 kodlamayan RNA'ların, küçük mikroRNA (miRNAs), posttranscriptional gen ekspresyonu düzenleyen nt. Eski miRNAs hücre-hücre iletişim ve hücre homeostazı5Yönetmeliği karıştığı olmuştur. Örneğin, HDL endotel hücre adezyon molekül 1 (ICAM-1) bastırmak için eski-miR-223 sunar ve inflamasyon6. İlginçtir, miR-223 da ekstrasellüler lökosit akciğer kanseri hücreleri, onları bir daha invaziv fenotip7üzerinde almak programlama veziküller tarafından taşınan görülmektedir. Böylece, ex-miRNAs çeşitli vücut sıvıları ve hücre kültür orta transcriptome büyük ölçüde eski miRNA sinyal anlayışımızı geliştirir.

Küçük RNA (küçük RNA seq) sıralama küçük RNA'ların transcriptomics anlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Sadece farklı örnekleri arasında differentially ifade bilinen RNA'ların karşılaştırılabilir ama roman küçük RNA'ların da tespit ve karakterize. Sonuç olarak, farklı koşullar altında differentially ifade miRNAs belirlemek de sağlam bir yöntemdir. Ancak, bir küçük RNA seq engel üzerinden düşük exRNA giriş sıvı serebrospinal sıvı, tükürük, idrar, süt, serum ve kültür medya gibi küçük RNA seq kütüphaneler üreten zor olmasıdır. Illumina TruSeq küçük RNA Kütüphane hazırlık kuralından yaklaşık 1 µg kaliteli toplam RNA'ın gerektirir ve New England Biolabs NEBNext küçük RNA Kütüphane hazırlık ayarla iletişim kuralından 100 ng-1 µg RNA8,9gerektirir. Oftentimes, bu örnekler üzerinden toplam RNA vardır geleneksel UV-VIS Spektrofotometreler için algılama sınırı altında.

EX-miRNAs vücut sıvıları türetilmiş potansiyel olarak iyi prognostik ve tanılama işaretleri vardır. Ancak, fonksiyonel etkilerini incelemek için veya belirli eski miRNAs kökenini belirlemek için hücre kültür sistemleri genellikle bunun yerine kullanılır. Onların EVs miyokard infarktüsü, Alzheimer hastalığı ve Greft versus host hastalığı10dahil olmak üzere birçok hastalığın ortadan kaldırılmasına karıştığı olmuştur çünkü Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Burada, biz eski miRNAs arınma kemik iliği türevi MSCs (BMSCs) ve küçük RNA Kütüphane yapılar, sıralama ve veri analizi (şekil 1) en iyi duruma getirmek için kullanılan belirli adımları göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Mezenkimal Kök hücre büyüme orta (MSC medya) Malzemeler tablobelirtildiği gibi önceden hazırlanır.

1. hücre kültürü

Not: İnsan Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, yağ dokusu veya diğer kaynakları11elde edilebilir. Alternatif olarak, hMSCs bir tedarikçi ile satın alınabilir. Bu protokol için kullanılan BMSCs hastaların kemik iliği elde edilen ve bir şirketten satın aldı.

  1. 1 x 106 BMSCs 20 mL MSC medya içeren bir T175 şişesi içine çözülme. %5 CO2 37 ° C'de hücreler kuluçkaya ve her 2-3 gün öncesine kadar % 80 confluency ortamı değiştirin.
  2. 5 mL 1 x PBS de hücrelerle yıkayın ve PBS atın.
  3. 5 mL % 0.05 de ekleyerek hücreleri ayırma tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçka Dekolmanı kolaylaştırmak için balonun kenarlarında dokunun.
  4. Tripsin devre dışı bırakabilirsiniz, yüzey ve yukarı ve aşağı tek hücre süspansiyonlar elde etmek için pipet hücrelerden ayırmak için MSC medyasının 15 mL ekleyin.
  5. 50 mL tüp ve hücreleri cips için 300 x g de 5 min için aşağı spin hücrelerde toplamak.
  6. MSC medya 1 mL hücrelerde resuspend ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    Not: 2 x 10-6 hücre birincil insan ilik MSCs % 80'i confluency bir T175 şişesi içinde de var.
  7. 2.000 hücreler/cm2 5 T175 şişeler taze MSC medyada'de plaka hMSCs. %5 CO2 37 ° C'de hücrelerin büyümesine ve her 2-3 gün kadar % 90 Konfluent T175 şişeler 5 şişe elde edilen ortamı değiştirin.

2. EVs ve biomolecules RNA ilişkili koleksiyonu

Not: EV toplama medya önceden hazırlanır (Dulbecco'nın modifiye kartal orta [DMEM] % 10 fetal sığır serum [FBS] ve % 1 penisilin/streptomisin [P/S] ile). EV toplama medya normal MSC ortam, ancak ticari EV tükenmiş FBS ile (Tablo reçetesi) hazır. Bu normalde EVs, ribonucleoproteins ve lipoproteinler ile ilgili exRNAs içeren FBS, kirlenme sığır exRNA kaçınmaktır. Küçük RNA Kütüphane hazırlık için MSCs 5 Konfluent şişeler türetilmiş exRNAs Kütüphane inşaat etkinleştirmek için gereklidir.

  1. 3 hücreleri yıkama x PBS 20 mL başına T175 şişesi ile. EV toplama medya MSCs Konfluent T175 şişe başına 20 mL ekleyin ve % 5 CO2 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Medya toplamak ve 300 x g , 10 min ve 4 ° c için medya santrifüj kapasitesi
  3. Süpernatant toplamak ve medya 2.000 x g de 20 dk ve 4 ° c için santrifüj kapasitesi
  4. Süpernatant toplamak ve medya 15,500 x g de 30 dk ve 4 ° c için santrifüj kapasitesi Daha sonra süpernatant toplamak.
  5. Ultracentrifuge tüpler için medya aktarmak ve 100.000 x g ve 4 ° c, 90 dakika exRNAs cips Sabit açılı rotor burada kullanılır ve Pelet tüp tarafına demir attı. Kapak tarafında işaretlemek ve Pelet nerede beklenen tüp tarafında bir daire çizin.
  6. Süpernatant kaldırırken, tüp içine tüp emici kağıt üzerine ters çevirme Makinası ve küçük parçalar halinde emici kağıt tüp içinde sıvı tüp alt dokunmadan kaldırmak için. PBS 200 μL vortexing 30 tarafından Pelet resuspend s ve aşağı yukarı 20 x pipetting.
  7. EVs ve biomolecules izleme çözümlemesi (NTA) (Şekil 2) nanopartikül ile değerlendirmek.
    Not: EVs ve biomolecules analizi (NTA), dinamik ışık saçılma (DL) veya iletim elektron mikroskobu (TEM)12izleme nanopartikül ile tespit edilebilir.
  8. EVs ve biomolecules-80 ° C'de daha da aşağı akım deneyler kadar saklayın.
    Not: EVs fonksiyonel çalışmaları için kullanılmak üzere kullanacaksanız, % 20 gliserol onları rüptür üzerinden korumak için eklenmiş olması gerekir. Hücreleri Standart prosedürler kullanarak toplanabilir.

3. EVs ve farklılaşmış hücreler topluluğu RNA ilişkili biomolecules

Not: EVs ve RNA biomolecules ilişkili hücrelere farklılaşma tabi iken aynı zamanda hücre kültür ortamından toplanan olabilir. Protokol olarak adı geçen örnek osteoblastik farklılaşma ve exRNA koleksiyonu gün 0 ve 7 farklılaşma açıklar. Hiçbir farklılaşma gerekiyorsa, atlamak Bölüm 3 ve Bölüm 4'e geçin.

  1. Osteoblastik farklılaşma ortam hazırlamak (DMEM % 10 ile FBS, % 1 P/S, 10 mM β-gliserofosfat, 10 nM deksametazon, 50 mikron askorbat-2-fosfat ve 10 mM 1,25-vitamin-D3) taze her zaman.
  2. MSCs % 80 birleşmesi olduğunda, MSC medya osteoblastik farklılaşma medyaya değiştirin.
  3. Osteoblastik farklılaşma medya 2-3 gün sonra doldurmak.
  4. Gün 5 farklılaşma, medyayı çıkarın ve hücreleri 3 yıkama x PBS 20 mL başına T175 şişesi ile.
  5. 10 mM β-gliserofosfat, içeren EV toplama medya 10 nM deksametazon, 50 mikron askorbat-2-fosfat ve 10 mM D vitamini 1.253 Konfluent T175 şişesi MSCs. Incubate emin olmak 48 saat için % 5 CO2 ile 37 ° C'de hücreler devam etti, başına 20 mL ekleyin farklılaşma EVs ve biomolecules toplarken.
  6. Günlük 7 medya toplamak ve EVs ve 2.2-2,6 adımlarda açıklandığı gibi biomolecules izole etmek için devam edin.
  7. Kalite kontrol için sırasıyla hücreleri 96-kuyu veya farklılaşma bir alkalen fosfataz (ALP) faaliyet tahlil kullanarak değerlendirmek için 6-kuyu veya nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ile tohum.
    Not: Resim 3 Osteojenik farklılaşma hücre gösteren bir örnektir.

4. RNA çıkarma ve kalite kontrol

  1. Adım 2.8 buz örneklerinden çözülme. Bir RNA izolasyon Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak RNA ayıklayın.
  2. RNA izolasyon Kiti (Tablo reçetesi) sağlanan sütun RNA RNase free su 100 μL içinde elute.
  3. RNA etanol yağış ile arıtılmış RNA 100 μL 1 μL glikojen, 2 M pH 5.5 sodyum asetat 10 μL ve önceden soğutulmuş % 99 etanol 250 μL ekleyerek konsantre.
  4. -20 ° C'de RNA çökelti gecede örnekleri kuluçkaya. RNA 16.000 x g ve 4 ° c, 20 dk centrifuging tarafından cips
    Not: Pelet glikojen ile ortak yağış nedeniyle beyazdır.
  5. Süpernatant kaldırmak ve RNA Pelet 1 mL % 75 etanol ile yıkayın. RNA 16.000 x g ve 4 ° c, 5 min için tekrar cips
  6. Etanol kaldırmak ve RNA tüp kapağını açık hava için 5-10 dakika için Kuru RNA Pelet bırakın. RNA Pelet RNase free su 7 μL içinde resuspend.
  7. Kütüphane inşaat önce üreticinin protokolüne göre RNA algılamak için bir Kapiler Elektroforez çip tabanlı makine kullanarak toplama ve RNA kalitesini kontrol edin.
    Not: RNA'ın bir temsilcisi boyut dağılımı şekil 4' te gösterilmiştir.
  8. Hücresel RNA bir ticari arıtma Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak ayıklayın.

5. Kütüphane inşaat ve kalite kontrol

Not: Küçük RNA kitaplıkları ayarlamalar nedeniyle giriş düşük RNA ile ticari kitleri (Tablo reçetesi) kullanılarak inşa edilir. Kütüphane inşaat soğutulmuş blokta gerçekleştirilir.

  1. Isıtma bloğu için 0.2 mL PCR tüpleri buz soğuk ve adım 4,6 0.2 mL RNase free PCR tüpleri içine soğuk bir blok üzerinde RNA'ın 5 μL pipet.
  2. 3' adaptörler (1:10) 0.2 mL RNase free PCR tüp RNase free suda oranında seyreltin. 0.5 μL seyreltilmiş bağdaştırıcısının ve 8 x ve santrifüj kısaca tüm sıvı tüp alt toplamak için yukarı ve aşağı pipetting tarafından RNA 5 μL ile karıştırın.
  3. 70 ° c ısıtılmış bir termal cycler 2 min için RNA ve 3' adaptör karışımı kuluçkaya ve örnek soğutulmuş blokta yerleştirin.
  4. 1 μL ligasyonu arabelleği, 0.5 μL RNase inhibitörü ve T4 RNA ligaz (silme mutant) 0.5 μL RNA ve 3' adaptör karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi.
  5. Tüp 28 ° c ısıtılmış termal cycler 1 h için kuluçkaya.
  6. Durmak eriyik 0.5 μL örnek tüp termal cycler kalan tüp içine eklemek, yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve 15 dakika 28 ° C'de kuluçkaya devam.
  7. 5' adaptörler (1:10) 0.2 mL RNase free PCR tüp RNase free suda oranında seyreltin. Bir ayrı RNase free 0.2 mL PCR tüp, ısı 5' adaptörü 70 ° c ısıtılmış termal cycler 2 min için içine 5' bağdaştırıcısının 0.5 μL ekleyin ve sonra örnek soğutulmuş blokta yer.
  8. 10 nM ATP, T4 RNA ligaz 5' adaptör Tube 0.5 μL 0.5 μL eklemek, yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca tüm sıvılar altına toplamak için santrifüj kapasitesi.
    Not: 5' adaptör soğutulmuş blokta mümkün olduğu kadar devam et.
  9. 5' adaptör karışımı 1,5 μL örnek için adım 5.6 ve çok yavaşça pipetting 8 x tarafından yavaş yavaş karıştırın. Örnek için Önceden ısıtılmış termal cycler 1 h 28 ° C'de kuluçkaya.
  10. RT bir RNase free 0.2 mL PCR tüp RNase free suda astar 1:10 oranında seyreltin. Seyreltilmiş RT astar 0.5 μL örnek adım 5,9, çok yavaşça yukarı ve aşağı 8 x yavaş yavaş pipetting tarafından mix ekleyin ve kısa bir süre santrifüj kapasitesi.
  11. 70 ° c ısıtılmış termal cycler 2 min için örnek kuluçkaya ve örnek bir soğutulmuş blokta yerleştirin.
  12. 5 x ilk strand arabellek, 0.5 μL 12,5 mM dNTP mix, 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL RNase inhibitörü ve transkriptaz 0.5 μL 0.5 μL 1 μL ekleyin. Çok yavaş yavaş yavaş aşağı yukarı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi.
  13. Örnek 50 ° c için 1 h cDNA elde etmek için Önceden ısıtılmış termal cycler kuluçkaya.
  14. 4.25 μL ultrasaf su, 12,5 μL PCR karışımı, 1 μL dizin astar ve evrensel astar 1 μL cDNA ekleyin. Yukarı ve aşağı 8 x pipetting tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi.
  15. Örnek bir termal cycler yerleştirin ve cycler aşağıdaki gibi ayarlayın: 30 98 ° C s; 15 devredir 10 98 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 15 s; ve son 10 dk 72 ° C ile çevriminde.
    Not: Hazır Kütüphane-20 ° C'de bir hafta boyunca saklanır.
  16. Bir DNA jel kitaplığı ayıran ve jel (jel ayıklama) 140 arasında kesme RNA Kütüphane arındırmak bp ve 160 bp ve Kütüphane inşaat kiti tarafından verilen protokol sonrası jel kitaplıktan eluting.
    Not: Bu çalışmada, ticari jel (Malzemeler tablo) ve 140 arasında kütüphane üzerine adım 5,15 hazır Kütüphane yüklenir bp ve 160 bp saf dışarı tarafından bir otomatik DNA boyutu fractionator (Malzeme tablo) göre üreticinin iletişim kuralı.
  17. Konsantre ve adım bir sütun tabanlı PCR arıtma Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak 5,16 kitaplığından yıkama ve 10 μL RNase free su kütüphanede sonunda elute.
  18. Üreticinin protokol sonrası Kütüphane boyutunu kontrol etmek için bir DNA çip (Tablo reçetesi) üzerine saf Kütüphanesi 1 μL yükleyin.
  19. 1 μL arıtılmış Kütüphanesi (1: 1000) 10 mM pH 8.0 içinde seyreltik Tris-HCl % 0.05 polysorbate 20 ile ve kit ile DNA Standartlar kullanılarak kütüphane konsantrasyon ölçmek için bir ticari Kütüphane miktar kit kullanarak qPCR tarafından Kütüphane ölçmek.
  20. Havuzu eşit miktarda kitaplıkları gereksinimlerine uygun sıralama makine ve sıralı olarak yüksek üretilen iş sıralama sistemi.
    Not: Hücresel RNA'ın Kütüphane inşaat yapılabilir Kit standart iletişim kuralı takip ederek aynı Kitleri kullanarak.

6. Biyoinformatik boru hattı

Not: Bu kurum içi bir boru hattı ve burada kullanılan programların listelenen tablo reçetesi.

  1. Dış görev düşük kaliteli okuma döşeme ve adaptör dizileri ham okuma kaldırın.
  2. Temiz okuma RNA'ların farklı türleri eşleştirin.
    1. TRNA ağırlıklı olarak tRNA dizileri sık temel misincorporation ters transkriptaz tarafından neden çünkü iki uyuşmazlıkları izin vererek açıklama.
    2. MiRNAs ile eşleştirerek sıfır duyarlıysa yanlış eşleşmeyi sağlayan insan miRNAs miRBase v21 dan açıklama ekleyin. Beri miRNAs A tabidir ve U nontemplated 3' son eklemeler, harita dizileri vardır 3' en çok üç A ve/veya T nts sonra okuma insan miRNAs ve diğer miRNAs miRBase v21 dan sıfır uyuşmazlıkları izin için eşleştirilir, kesilmiş.
    3. İlgili diğer küçük RNA'lar için (snRNA, snoRNA, piRNA ve Y RNA'ların) bir uyuşmazlığı izin vererek açıklama.
    4. Kalan eşlenmemiş okuma bozulması değerlendirmek için uzun RNA (rRNA, diğer RNA Rfam ve mRNA) veri kümeleri eşleştirin.
    5. İnsan Genomu dizileri açıklama ekleyin.
    6. Bakteriyel genom dizileri açıklama ekleyin.
    7. MiRNA ifade aşağıdaki formülü kullanarak normalize: miRNA sayar / toplam tüm eşlenen miRNAs sayar) x 106.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için açıklanan yöntemi sonraki nesil sıralama için MSC kültüründen exRNA toplamak için optimize edilmiştir. İş akışının genel düzeni şekil 1 ' solda ve sağda ilgili kalite kontrol denetim noktaları vardır.

Koleksiyon için gün hücre morfolojisi (şekil 3A) farklılaşmamış ve (şekil 3B) farklı hücreleri gösterilir. Ayrıca, 7 gün boy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biz fark ifade analizleri düşük giriş örneklerinden sağlar exRNAs, sonraki nesil sıralama için bir iletişim kuralı tanımlamak. Belirli bir iletişim kuralı için EV ve exRNA yalıtım yapıştırma miRNA13,14düzeyde ve hatta küçük değişiklikler (yani, ultrasantrifüj adım ya da bir değişiklik rotor tipi) transcriptome etkileyebilir çünkü önemlidir. Böylece, nasıl exRNA izole ne olursa olsun, bu sonuçları karşılaştırmak için bir deney tüm örnekleri aynı deneysel v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onların teknik destek için iNANO Bay Claus otobüs ve Bayan Rita Rosendahl için minnettarız. Onun ultracentrifuge sık sık bizim kullanımına izin veren Dr. Daniel Otzen sayesinde özel. Bu çalışmada yenilik Fonu Danimarka (kabul Projesi) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kemik İliği Kaynaklı Mezenkimal Kök HücrelerATCCPCS-500-012Bu protokolde kullanılan hücreler ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001'denMezenkimal Kök Hücre Büyüme Ortamı (MSC ortamı) olarak adlandırılır
Eksozom tükenmiş FBSGibcoA2720801
ExRNA toplama ortamı: MSCGM, ancak FBS, eksozom tükenmiş FBS
Tripsin-EDTAGibco25200056
T175 ŞişesiSarstedt833,912
Penisilin-StreptomisinGibco15140122
Fosfat Tamponlu SalinSigma806552
UltrasantrifüjBeckman Coulter
Kapaklı Polikarbonat Şişe Montajlı Beckman Coulter355618
Beckman Coulter Tip 60 TiRotor burada kullanılır
NucleoCounterChemometecNC-3000Hücre Sayacı
ve beta;-gliserofosfatCalbiochem35675Osteojenik farklılaşma ortamının bileşenleri
DeksametazonSigmaD4902-25MGOsteojenik farklılaşma ortamının bileşenleri
2-Fosfo-L-askorbik & asit trisodyum tuzuSigma49752-10GOsteojenik farklılaşma ortamının bileşenleri
1&alfa;,25-Dihidroksivitamin  D3SigmaD1530-1MGOsteojenik farklılaşma ortamının bileşenleri
miRNeasy Mini Kit,Qiagen217004miRNA ve adım 4.8 için toplam RNA saflaştırma kiti
Agilent RNA 6000 Pico KitiAgilent Technologies5067-1514RNA ve DNA analizi için çip bazlı kılcal elektroforez makinesi ve çipler
Agilent 2100 BiyoanalizörAgilent TechnologiesG2939BARNA ve DNA analizi için çip tabanlı kılcal elektroforez makinesi ve çipler
Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent Technologies5067-4626RNA ve DNA analizi için çip tabanlı kılcal elektroforez makinesi ve çipler
KAPA Kütüphanesi Miktar Belirleme KitleriRocheKK4824Burada kullanılan kütüphane miktar belirleme kiti
TruSeq Küçük RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti -Set A (24 rxns) (Set A: indeksler 1-12)IlluminaRS-200-0012Bu protokolde kullanılan küçük RNA kütüphanesi hazırlık kiti - 5. adımda kullanılır
Pippin HazırlıkAdaçayı BilimiBu protokolde kullanılan otomatik DNA jel çıkarıcı; manuel ekstraksiyon da yapılabilir
MinElute PCR Saflaştırma KitiQiagen28004Adım 5.17'de PCR saflaştırması
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor Lab6. adımda düşük kaliteli okumaların kırpılması
cutadapt6. adımda adaptör çıkarma
adımda temiz okumaların papyon
Samtools6. adımda ifade profilini oluşturmak için
Bedtools6. adımda ifade profilini oluşturmak için
satın alındı ile değiştirildi, , , 6. eşlemesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184(2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292(2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498(2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RNA IsolationNanoparticle Tracking AnalysisEthanol PrecipitationLibrary ConstructionQPCR QuantificationHigh Throughput SequencingQuality Control CheckpointsCulture Media Collection

İlgili makaleler