Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı

10.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58656

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

Bu makalede

Özet

Decellularized kıkırdak elde edilen iskele osteokondral doku yeniden oluşturmak için kılavuz kıkırdak onarım için bir iskele ve bir araç olarak kullanılabilir. Bu yazıda ayrıntılı decellularization işlemini açıklar ve bu iskele tüp bebek ayarları'nda kullanmak için öneriler sunar.

Özet

Osteokondral kusurları işlevsel olarak ses kemik ve kıkırdak doku yeniden oluşturmak için yeterli iç onarım kapasitesi değildir. Bu ölçüde, kıkırdak araştırma rejeneratif iskele geliştirilmesi üzerinde odaklanmıştır. Bu makale tamamen doğal kıkırdak hücre dışı matriks, at bir donörün geliyor türetilir iskele gelişimi anlatılmaktadır. İskele potansiyel uygulamalar allogrefler kıkırdak onarım, mühendislik ve doku oluşumu çalışmaya tüp bebek modelleri sağlayarak osteokondral doku için bir iskele olarak hizmet için üreten içerir. Doku decellularizing tarafından donör hücreleri kaldırılır, ancak birçok doğal biyoaktif sopasıyla korunabilmesi için düşünce. Sentetik üretilen bir iskele ile karşılaştırıldığında doğal bir iskele kullanmanın ana avantajı yok daha fazla functionalization polimerlerin sürücü osteokondral doku rejenerasyonu için gerekli olmasıdır. Kıkırdak kaynaklı matris iskele içinde vivo ve tüp bebek ayarlarında kemik ve kıkırdak doku rejenerasyonu için kullanılabilir.

Giriş

Travmatik olaylardan kaynaklanan diz eklem kıkırdak kusur rahatsızlık için yol açabilir ve her şeyden önce genç ve aktif nüfus1,2,3hayatlarını üzerinde büyük bir etkisi olabilir. Ayrıca, Genç yaşta kıkırdak hasarı daha hızlı başlangıçlı osteoartrit hayatı4sonraki bölümlerinde yer alan neden olabilir. Şu anda, sadece Hurda tedavi Genelleştirilmiş osteoartrit diz eklem replasmanı cerrahidir. Kıkırdak hypocellular, aneural ve avasküler doku olduğu için yeniden üretim kapasitesini ciddi sınırlıdır. Bu nedenle, rejeneratif tıp yaklaşımları sonra yardımcı olmak ve yerel doku Yenileyici kapasiteli uyarmak için aranır. Bu amaçla, iskele tasarlanmış ve farklılaşma ve doku rejenerasyonu kışkırtırız endüktif bir malzeme olarak ya da ya da bir hücre taşıyıcı olarak vücudun doğal hücreleri5tarafından kullanılabilir.

Decellularized iskele rejeneratif tıp6içinde yaygın olarak inceledik. Bu bir başarı, örneğin, cilt7, karın yapıları8ve tendon9rejenerasyon yardım elde etti. Decellularized iskele kullanmanın avantajı doğal kökenlerine ve hem çekmek ve hücre farklılaşması doku onarım6,10için gerekli uygun lineage içine neden biyoaktif ipuçlarını korumak için kendi kapasitesi var. Ayrıca, hücre dışı matriks (ECM) doğal bir biomaterial ve decellularization hücresel veya genetik içeriği kaldırarak potansiyel bir bağışıklık yanıtı engeller olduğundan, biyouyumluluk ve biodegradability ile ilgili konular üstesinden vardır.

Kıkırdak kaynaklı matris (CDM) iskele büyük chondrogenic ile mezenkimal stromal hücre11numaralı seribaşı zaman tüp bebek deneylerde potansiyel göstermiştir. Buna ek olarak, bu iskele ektopik konumlardaki içinde vivo ayarları12formu kemik doku ile endochondral ossifikasyon potansiyeline göstermiştir. CDM iskele oluşumu rehber olarak her ikisi de kemik ve kıkırdak doku, bu iskele osteokondral defekt tamir yanı sıra kıkırdak onarım için potansiyel tutabilir.

Bu makalede, Yang sayfasından uyarlanmış bir protokol et al. (2010)13 üzerinden atlar decellularized CDM iskele imalatı için diz kıkırdak. Bu iskele kollajen tip II ve hücreleri yoksun zengindir ve herhangi bir glikozaminoglikan (GAG) decellularization sonra içermez. Tüp bebek ve içinde vivo deneyler (osteo) kıkırdak defekt tamir bu iskele kullanarak yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu iletişim kuralı için at bastırmak kıkırdak diğer nedenlerle daha osteoartrit ölmüştü atlar üzerinden elde edildi. Doku kurumsal etik kuralları doğrultusunda sahiplerinin izni ile elde edildi.

Not: Bu iletişim kuralı içinde vitro doku kültürü platformlar gibi uygulamalar için veya rejeneratif tıp stratejileri içinde vivo implantasyonu için kullanılabilir decellularized at kıkırdak üzerinden iskele imalatı açıklar. Enzimatik tedavi adımların açıklandığı kronolojik olarak gerçekleştirilmesi gerekir.

1. donör (kadavra) eklem gelen eklem kıkırdak hasat

  1. Devam Çözüm yıkama, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve %1 (v/v) amfoterisin b ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu tuz (PBS), oluşan kıkırdak 1 L hasat adımında, hazırlamak
  2. Donör patojenler taşıyabilen bu yana tüm toplama işlemi sırasında eldiven ve önlük giymek.
  3. Bir sağlam (kadavra) eklem kıkırdak yalıtım için edinin.
    Not: Bu noktada, eklem çevresindeki deri dokunulmamış olarak kalmışsa. At bastırmak kıkırdak attan elde edilen bu protokol için kullanılan, ancak diğer eklem diğer türlerden de kullanılabilir.
  4. Bir neşter ve cerrahi bir cımbız kullanarak ilgi ortak alan bulunan deri kaldırmak. Buna ek olarak, gerekirse, aşırı yağ ve kas dokusu temel ortak zarar vermeden kaldırmak. İsteğe bağlı olarak, hazırlanan kadavra bir biyolojik güvenlik kabin aktarın.
  5. Bir ayrılık eklem, bir arthrotomy, yani gerçekleştirmek için ilk olarak nerede uzantısı ve fleksiyon eklem yaparak ortak dile konum tanımlayın.
  6. Yağ, kas ve tendon eklem alanını açmak için cerrahi cımbız bir neşter ile daha fazla katman dikkatli bir şekilde çıkarın.
  7. Eklem boşluğu ulaşmak için bir kesi yapmak.
    Not: Eklem boşluğu boşluğundan doğru bir kesi işlemi sırasında damla synovial sıvı ile doldurulur.
  8. Ortak bir arada tutmak tendonlar ile kesme tarafından ortak kadar tamamen açmaya devam edin.
  9. Kıkırdak makroskopik herhangi bir zarar için kontrol edin.
    Not: Eklem kıkırdak parlak ve pürüzsüz bir görünüme sahip değilse veya belirgin kabarma, clefts veya kusurları varsa, kıkırdak atmak.
  10. Steril neşter subchondral kemik kıkırdak kaldırmak için kullanın. Ayrıca kıkırdak (Şekil 1) derin bölgesini kaldırmak için ta subchondral kemiğine kadar kesti. Kıkırdak kurumasını önlemek için düzenli olarak çözüm üzerinde kıkırdak yıkama kıkırdak damla.
    Not: Şu anda, kıkırdak dilimleri boyutu önemli değildir.
  11. Kıkırdak dilimleri önceden hazırlanmış kıkırdak çözüm (Şekil 2A) yıkama içeren 50 mL tüpler toplamak.
  12. Kıkırdak ilgi tüm alanları topladıktan sonra ek dondur kıkırdak dilimleri 5 min için sıvı azot.
  13. Kıkırdak dilimleri 50 mL tüpler içine aktarmak ve hemen bir donma kurutma makinesi kıkırdak dilimler için 24 saat lyophilize. Buz kondansatör-51 ° C (Şekil 2B) ise donma kurutma makinesi yaklaşık 0,090 mbar ayarlayın.
  14. Kıkırdak dilimleri kadar daha fazla kullanmak, oda sıcaklığında kuru bir yerde saklayın.
    Not: İskele oluşumu noktaya kadar çözümler ve kıkırdak hazırlanacak ve steril bir şekilde tedavi gerekmez.

2. oluşturma kıkırdak parçacıklar Decellularized

  1. Sıvı azot liyofilize kıkırdak dilim submerse.
  2. Doğrudan örnekleri el ile veya bir freze tezgahı eziyet. Kıkırdak dilimleri el ile bileme, harç ve havaneli kullanın ve bunlar toz (Şekil 2C ve 2D) kadar yaklaşık 45 dakika için dilimleri eziyet. Otomatik olarak taşlama, freze makinesi ek donmuş kıkırdak dilimleri toz haline kadar bir dakika kadar birkaç saniye için önceden ayarlanmış kendi hızda kullanın.
    Not: Harç veya Freze taşlama bölmesinin sıvı azot ekleyerek önceden ne yapıyorsun? Freze makinesi kullanırken, tüm parçacıklar zemin vardır ve hiçbir parçacıklar taşlama bölmenin alt kısmında kalmak emin olun.
  3. Daha büyük bölümlerini bir elek ile 0,71 mm kafes boyutu kullanarak kurtulmak için kıkırdak parçacıklar elek.
  4. Parçacıklar, oda sıcaklığında kuru bir yerde saklayın.

3. tripsin ile enzimatik Decellularization 0.25%-EDTA

  1. % 0.25 tripsin 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve %1 (v/v) Amfoterisin B. mağaza 4 ° C'de çözüm ile takıma EDTA ile oluşan sindirim çözüm hazırlamak
    Not: Trypin ikamet eden kıkırdak dokusunda proteinleri alçaltır bir proteaz var. Enzimatik bu adımı yoğun kıkırdak yapı açılır.
  2. 50 mL tüpler yaklaşık 7.5 mL tüp başına hacmi kadar toz kıkırdak parçacıkları ile doldurun.
  3. Kıkırdak parçacıkları ile hazırlanan sindirim çözüm için toplam 24 h 37 ° C'de sindirim çözüm her 4 h yenilenirken kuluçkaya.
    1. İlk olarak, 30 mL sindirim çözeltisi kıkırdak parçacıklar içerir her 50 mL tüp ekleyin.
    2. O zaman, parçacıklar böylece tüm parçacıklar enzimatik solüsyona maruz kalan bir girdap ya da damlalıklı kullanarak resuspend.
    3. Örnekleri bir rulo üzerinde 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.
    4. Sindirim çözüm yenilemek için sedimantasyon kıkırdak parçacıkların neden 3113 x g de 20 dk için tüpler santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
      Not: Süpernatant her tripsin kuluçka süresi ile daha net olacak.
    5. Adım 3.3.1–3.3.4 4 h 6 devredir parçacıklar sindirim çözüm ile inkübe kadar yineleyin.
  4. Son döngüsü sonra süpernatant centrifuging sonra kaldırmak ve parçacıkları 30 mL çözüm iki kez yıkama kıkırdak yıkayın. Parçacıklar 3113 x g her yıkar bir de 20 dk santrifüj kapasitesi.

4. enzimatik Decellularization nükleaz tedavi ile

  1. 10 mM Tris-HCl çözüm pH 7.5 deiyonize su hazırlamak.
  2. 50 U/mL deoksiribonükleaz ve 1 U/mL ribonükleaz A nükleaz çözüm elde etmek için Tris-HCl tampon için ekleyin.
    Not: Bu adım, özellikle deoksiribonükleazlar ve ribonükleazlar aşağılamak için gerçekleştirilir.
  3. Kıkırdak parçacıklar (adım 3.4) çözümden yıkama kıkırdak kaldırmak için 3,113 x gde 20 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
  4. Kıkırdak parçacıkları 30 mL nükleaz çözeltisi ekleyin ve tüm parçacıklar nükleaz çözüm maruz kalır emin çözümü üzerinden parçacıklar karıştırın.
  5. Örnekleri için 4 h 37 ° C'de bir rulo üzerinde kuluçkaya
  6. 20 dk 3,113 x g de kıkırdak parçacıklar centrifuging tarafından nükleaz çözümü kaldırmak ve süpernatant atın.
  7. Örnekleri kıkırdak parçacıklar 10 mM Tris-HCl çözüm deoksiribonükleaz ve ribonükleaz A olmadan 30 mL ekleyerek yıkayın. Parçacıklar resuspend ve örnekleri bir rulo için oda sıcaklığında 20 h bırakmaktır.

5. deterjan Decellularization

  1. Deterjan solüsyonu octoxynol-PBS içinde 1 %1 (v/v) çözülerek olun.
  2. Tris-HCl çözüm 3,113 x g de 20 dakika centrifuging ve süpernatant atarak kıkırdak parçacıklar kaldırın.
  3. Hazırlanan % 1 deterjan solüsyonu 30 mL kıkırdak parçacıkları ekleyin. Yavaşça çözümü köpük önlemek için kıkırdak parçacıkları resuspend.
    Not: Bu adım hücresel zarları tatili.
  4. Bir rulo üzerinde oda sıcaklığında 24 h için bir rulo üzerinde örnekleri kuluçkaya.
  5. Santrifüjü 3,113 x g de 20 dk için deterjan solüsyonu kaldırmak ve süpernatant atın.
  6. Tüm decellularization çözümleri kalıntıları kaldırmak için Çözüm yıkama kıkırdak 30 ml 8 h 6 döngüleri kıkırdak parçacıklar yıkayın. Oda sıcaklığında bir rulo üzerinde çamaşır gerçekleştirin.
    1. Sonraki yıkamaya değiştirmek için süspansiyon 3,113 x gde 20 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve taze kıkırdak Çözüm yıkama ekleyin.
  7. Son yıkama tüplerde bırakın ve decellularized kıkırdak parçacıklar-80 ° C'de depolayın

6. Decellularized parçacıkları iskele oluşturma

  1. Parçacıklar-80 ° C'de depolanan, iskele oluşturmadan önce sıcak suda kıkırdak parçacıkları içeren kapalı tüpler çözülme.
  2. Kıkırdak parçacıkların küçük bir kepçe ile silindirik bir kalıp, örneğin, bir plastik şişe 8 mm çapında ve 2 cm yüksekliği ile aktarın.
  3. Kıkırdak parçacıklar plastik kalıp içine yerleştirirken, iskele içinde boşluklar önlemek için tüm hava-kabarcıklar dışarı basın ve kalıp kenarına kadar doldurun.
    Not: İskele çatlaklar yol açabilir iskele kuruluşundan sonra iskele metal bir kalıp dışarı çekmek daha zor olacak.
  4. Kalıpları kıkırdak parçacıklar-20 ° C'de 10 dakika ile dondurma
  5. Kıkırdak iskele 24 h için onların kalıplar içinde bir donma kurutma makinesi lyophilize.
  6. Lyophilization sonra İskele kalıp (Şekil 3) dışarı almak ve onları ultraviyole (UV) ışık 30 cm mesafe ve 365 ile bölünmelerini gecede nm.
  7. İn vitro hücre kültür veya içinde vivo implantasyon için iskele kullanabilmek için örneğin, etilen oksit (EtO) gaz ile iskele sterilize.
    Not: EtO Sterilizasyon harici bir şahıs tarafından gerçekleştirilir.

7. Decellularized iskele histolojik Stainings ile karakterizasyonu

Not: Tam decellularization emin olmak için ve geri kalan doğal karakter kıkırdak görselleştirmek için birkaç histolojik stainings iskele Hematoksilen ve eozin (H & E) emin olmak için boyama da dahil olmak üzere herhangi bir deneyde, kullanmadan önce gerçekleştirmek decellularization, Safranin-O kalan GAG varlığı görselleştirmek için boyama, kollajen tip ı kollajen içerik ve kollajen tip II immünhistokimya kollajen içerik arasında ayırt etmek için birbirinden ayırmak için immünhistokimya.

  1. İskele bir neşter ile yaklaşık 3 mm ince dilimler kesin.
    Not: İskele daha büyük veya daha küçük boyutlarda kesilir, dehidrasyon devir sürelerini adapte gerekir.
  2. İskele %4 (w/v) aljinat bir düşüş katıştırmak ve 20 mM CaCl2içeren % 3.7 sigara tamponlanmış formalin benzer bir hacmi ekleyerek cross-linking teşvik.
    Not: Aljinat katıştırma iskele dilimleri daha sert parafin katıştırma önce çamaşır adımları göre yapar. İskele bileşimi nedeniyle ECM birleşme hücreleri tarafından yeterince dayanıklı olarak iskele hücre-tohumlari durumda veya implante vivo içinde aljinat katıştırma çok gerekli değildir.
  3. Örnekleri kurutmak kademeli etanol serideki yerleştirerek, bir saatlik döngüleri ile başlayan % 70, % 96, ksilen iki 1s döngüsü tarafından takip ve parafin 60 ° C'de iki 1s döngüleri ile biten % 96, % 100 ve % 100 etanol,
  4. Dehidratasyon sonra parafin katıştırmak-örnekler bir kalıp içine ve örnekleri soğuması.
  5. Örnekleri ile bir microtome 5 mikron kalın dilim içinde kesmek.
  6. Örnekleri boyama önce döndürülen kademeli etanol serideki yerleştirerek suyla temasa. Ksilen 2 yıkama yıkama başına 3 min için % 100, % 95 ve % 70 etanol ardından 5 min için iki yıkama başlayın. Son olarak, örnekleri 3 kez suda 2 dakika yıkayın.
    Not: Parafin katıştırma için örnekleri işlemek için aljinat kullanmadan durumunda, Sıvı parafin bölümlerin önce 10 mM sitrik asitle aljinat kapalı yıkamak emin olun.
  7. Hematoksilen ve eozin, örnekleriyle leke Safranin-O, kollajen ben ve kollajen önceki açıklanan11olarak II.

8. Decellularized iskele kantitatif analizleri ile karakterizasyonu

  1. Daha önce11açıklandığı gibi iskele papain digests edinin.
  2. Bir tahlil tam decellularization emin olmak için iskele iki iplikçikli DNA içeriği ölçmek için floresans tabanlı DNA miktar kiti ile gerçekleştirin. Üretici tarafından sağlanan iletişim kuralı izleyin. DNA'ın iskele kuru ağırlığının başına miktar hızlı.
  3. GAGs iskele içinde kalan11daha önce açıklandığı gibi ölçmek için bir dimethylmethylene mavi tahlil gerçekleştirin. GAG DNA ücret tutarı hızlı.

9. Decellularized iskele tohum

  1. Steril iskele adım 6,7 içine 3 mm kalın dilimler kesin.
  2. 6-şey plaka ayrı Wells iskele aktarın.
  3. Hücre kültür orta ile iskele tarafından orta iskele üstüne pipetting 1 mL suyla temasa ve 30 dk. için emmek izin kondrosit veya mezenkimal kök hücre (MSC) genişleme orta kullanın.
    Not: aynı orta numaralı seribaşı hücreleri hücre kültürü gelince iskele rehidrasyon için kullanın. Kondrosit genişleme orta % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 10 ng/mL fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2) ile Dulbecco'nın değiştirilmiş medya (DMEM) oluşur. Yüksek lisans genişleme orta oluşur en az % 10 ile temel orta alpha (a-MEM) ısı-inaktive FBS, 0.2 mM L-askorbik asit 2-fosfat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 10 ng/mL FGF-2.
  4. 3 x 106 hücrelerde her iskele çapı 8 mm ve 3 mm yüksekliğe için gerekli birim orta 100 μL hazırlayın.
    Not: Birden çok hücre tipleri farklı türlerden tohum için kullanılabilir. Kondrosit veya mezenkimal stromal hücre kullanırken, yukarıda açıklanan11hücreleri izole. Kondrosit kullanırken, onlar P1 geçit dediferansiye kondrosit sayısını en aza indirmek için genişletilmiş değil emin olun. Mezenkimal stromal hücre kullanırken, onlar yukarıda açıklanan14olarak çoklu soy ayırt etme yeteneklerini üzerinde test edilmelidir.
  5. Damlalıklı 50 μL, hazırlanan hücre süspansiyon öncesi iskele üstüne ve 37 ° C'de 1 h için iskele kuluçkaya
  6. Dikkatlice ters iskele aşağı, damlalıklı kalan 50 μL hücre süspansiyon bu iskele tarafında açmak ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  7. Kuluçka sonra orta 3 mL wells için ekleyin ve 37 ° C'de hücre numaralı seribaşı iskele kültür Yavaşça dekolmanı hücrelerin önlemek için kültür plaka başa.
  8. Deney için gerekli olan süre için iskele kültür ve Orta 2-3 kez bir hafta değiştirin. Damlalıklı yavaş yavaş ve çok uzak gelen mümkün olduğunca iskele.
  9. Hücre numaralı seribaşı iskele kültür sonra iskele yarım kesilmiş ve onları Histoloji ve biyokimyasal analizler için süreç.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CDM iskele decellularization her zaman histolojik stainings kullanarak hem de DNA'sı kalıntıları miktarını ölçmek için DNA miktar kullanarak onaylanması gerekmektedir. Yetersiz decellularization içinde vivo ayarları15,16,17sonuçlarında etkileyen istenmeyen immünolojik yanıt-e doğru yol açabilir. Bu belirli decellularization Yöntem için 13,6 ± 2.3 ng/mg DNA/Kuru ağırlık başladı algılama mesafesi a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Eklem kıkırdak ECM çok yoğun ve farklı enzimatik tedavi için oldukça esnek. Bu makalede açıklanan multi-step decellularization iletişim kuralı böyle direnç giderir ve başarılı bir şekilde decellularized matrisler oluşturur. Bunu başarmak için birkaç gün içinde işlem yayılmıştır. Birçok decellularization süreçleri doku18farklı türleri için önerilen ve kıkırdak decellularization için uygun bir protokol bu makalede. Bu protokol için bu, ancak, tüm hücreleri kaldırmak için deterjan adımlarla enzimatik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar W. önyükleme için iskele imalatı yardım kabul etmek istiyorum. K.E.M. su bükücüler Alexandre Suerman Stipendium Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından desteklenmektedir. R. Levato ve J. Malda Hollandalı Artrit Vakfı tarafından desteklenmektedir (CO-14-1-001 ve LLP-12, sırasıyla vermek).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kadavra eklemi: Bu, yerel kasap veya veterinerlik merkezinden dinlenme materyali olarak temin edilebilir.
Steril fosfat tamponlu salin (PBS)
Penisilin-StreptomisinGibco15140
Amfoterisin BThermo Fischer Scientific15290026
Sıvı nitrojen
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısıThermo Fischer Scientific25200072
Tris-HCl pH 7.5
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz ISigma-AldrichDN25
Sığır pankreasından Ribonükleaz ASigma-AldrichR6513
Triton X-100 (okoksinol-1)Sigma-AldrichX100
PapainSigma-AldrichP3125
Trisodyum sitrat dihidratSigma-AldrichS4641
AljinatSigma-Aldrich180947
Formalin
CaCl2
Etanol
Ksilen
Parafin
Etilen oksit sterilizasyonuSinerji Sağlık, Venlo, Hollanda
multipotent Stromal hücreler / kondrositler, MSC'ler ve kondrositler, yerel kasap veya veterinerlik merkezinden gelen dinlenme materyali olan donör eklemlerinden izole edilebilir.
MEM alfaThermo Fischer Scientific22561
L-askorbik asit 2-fosfatSigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
Isı ile inaktive edilmiş sığır serum albüminiSigma-Aldrich10735086001
Fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2)R & D Systems233-FB
DNA miktar tayin kiti (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reaktifi)Thermo Fischer ScientificP7581
1,9-Dimetil-Metilen Mavisi çinko klorür çift tuzSigma-Aldrich341088
Dondurarak kurutucuSALMENKIPPALPHA 1-2 LD plus
Analitik değirmenIKAA 11 temel
havan/tokmakHaldenwanger 55/0A
Makaralı plakaCATRM5
Santrifüj (50 mL tüpler için)Eppendorf5810R
Kapsül (silindirik kalıp)TAAB8 mm düz
Superlite S UVLumatec2001AV
İnkübatör
Mikrotomu
Elek (ağ boyutu 0,71 mm)VWR34111229
Neşter
Neşter tutucu
Küçük eyer
At donörlerinden gelen

Kaynaklar

  1. Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
  2. Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
  3. Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
  4. Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
  5. Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
  6. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  7. Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
  8. Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
  9. Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
  10. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  11. Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
  12. Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
  13. Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
  14. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  15. Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
  16. Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
  17. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  18. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  19. Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683(2013).
  20. Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
  21. Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
  22. Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cresizle tirilmi K k rdak skelesiK k rdak zolasyonuDokunun H cresizle tirilmesiskele FabrikasyonuK k rdak Rejenerasyonuskele apraz Ba lanmasskele RehidratasyonuH cre Ekimiskele KarakterizasyonuBiyokimyasal Analiz
Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.