Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Yeni ilaç veya kimyasal probları gözlenen farmakolojik etkisi veya fonksiyonel okuma hedef doluluk veya nişan canlı hücreleri^1,2,3' te ölçülerini çift esastır geliştirirken. Bu veriler küçük molekül aslında istenen hedefine ulaştığından emin olmak için ve protein hedef seçimi^4,5arkasında biyolojik hipotez doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, ilaç geliştirme sırasında artan karmaşıklık model sistemleri seçin ve bir ipucu klinik öncesi bileşik teyit için kullanılır. Bu preklinik sistemleri arasında çeviri biyoloji onaylamak için uyuşturucu-hedef nişan izleme ve biyoloji bu gelişim süreci boyunca eşlik eden kritik yöntemlerdir.

Uyuşturucu-hedef nişan geleneksel unfunctionalized küçük moleküller ve protein, uzaysal çözünürlük^6,7ile tek hücre düzeyinde özellikle canlı hücrelerdeki izlemek için zor olmuştur. Bir son yöntem arasındaki etkileşim gözlemlemek için uyuşturucu değiştirilmemiş ve canlı hücrelerdeki protein olduğunu ligand kaynaklı istikrar yanıt bir ısı meydan okuma olarak yerli protein quantified^{8olduğu hücresel termal kayması tahlil (CETSA), 9,10}. Bu süre bir ısı meydan okuma maruz kalan çözünür protein miktarının tarafından gerçekleştirilir. CETSA ilk açıklanması Batı leke tespiti için kullanıldı. Tarama kampanyalarını etkinleştirmek ve daha büyük bileşik koleksiyonları önceliklendirmek vurmak için çabaları CETSA deneyler iş çıkarma yeteneğini artırmak için birkaç homojen, mikroplaka tabanlı deneyleri^10,11gelişmesine yol var. Ancak, bir bu yöntemler ile Şu anda en iyi hücre süspansiyonlar bileşik tedavi uygundur ve hücre lizis, mekansal bilgi kaybına yol önde gelen algılama gerektirir kısıtlamadır. CETSA-ebilmek var olmak deneysel olarak termal toplama sıcaklık (T_agg) ligand kaynaklı vardiyada küçük molekül tek bir konsantrasyon veya ligand konsantrasyonu protein tek bir ısıda dengelemek gerekli uygulanan. İkinci izotermal doz yanıt parmak bağımlılık belirli deneysel koşullar üzerinde bu ölçümlerin belirtmek için (ITDRF) olarak adlandırılır.

Bu iletişim kuralı CETSA immünfloresan (Eğer) antikor algılama yüksek içerikli mikroskobu¹²ile yapışık hücreleri kullanarak hedef nişan ölçmek için hedeftir. Bu yordamı hücre altı yerelleştirme korunması ile hedef angajman tek hücreli miktar için izin vermek için orijinal CETSA platform uzanır. Özellikle, önceki raporların çoğu, bu yordamda yüzey dekolmanı veya çamaşır böylece biz¹³ölçmek amacıyla kurulan bağlama dengeyi koruyarak ısı meydan okuma önce geçmeden canlı yapisan hücrelerde bileşik tedavi yapılır. Şu anda, yöntem bir hedef protein p38α için doğrulanır (MAPK14) içinde birkaç satır hücre ve bu yordamı paylaşarak teknik geniş erime Proteom uygulanabilir olduğunu umuyoruz. Biz bu protokolü tarama ilaç geliştirme boru hattı boyunca adapte edilebilir, aracılığıyla hedef nişan vivo içindeizleme için önceliklendirme vurmak tahmin.

1. tohum hücrelerinin

Not: İş akışı genel bakış için bkz: Şekil 1. Tablo malzemelerimalzemeler ve Kimyasalları ait ayrıntılı bir liste mevcuttur.

1. Hücreleri tohum önce siyah 384-şey görüntüleme tahlil tabak tabak altında daha sonra Isıtma adımı sırasında yakalanan hava kabarcıkları önlemek için çerçeve içinde bir standart matkap ile delik. Plastik parçacıklar kuyuları bu adımı sırasında girerek önüne geçmek ve steril koşullar korumak için bir yapışkan alüminyum folyo ile plakalarının veya doku kültürü mahallede delme önce plaka kapak. Genellikle, her yan plaka (kısa kenar) bir 3, 5 mm çapında 3 delik yeterli.
2. Laminar akış tezgah % 70 etanol ile temizleyerek hazırlayın. Standart aseptik doku kültürü teknikleri, medya cep şişesi veya çanak kaldırmak. 5-10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren hücreleri yıkayın ve 2 mL tripsin şişesi için ekleyin. A-431 hücreleri ayırmak kadar 37 ° C'de şişeye kuluçkaya. Ya da bir haemocytometer veya hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 50. 000 hücre/mL kültür ortamında bir hücre süspansiyon hazırlamak.
3. Bir toplu reaktif dağıtıcı veya deneme ölçeğini bağlı olarak bir çok kanallı damlalıklı kullanarak bir tahlil plaka her kuyuya hücre süspansiyon (iyi başına 2.000 hücre son hücre yoğunluğu veren), 40 µL dağıtmak. Kısa bir süre için hücreler eşit kalenin dibinde dağıtmak için yan plaka taşımak.
4. Plaka-kenar etkileri en aza indirmek için laminar akış kapağın arkasında oda sıcaklığında 20 dakika tahlil kalenin dibinde razı hücrelere izin. O zaman, nemli bir ortam sağlamak için nemli kağıt havlu ile plastik bir kapta plaka yer. Kullanımdan önce % 70 etanol ile Plastik Konteyner silin.
5. 2-3 gün 37 ° C ve % 5 CO₂ geleneksel bir oksijen kuluçka için tahlil plaka kutusuyla kuluçkaya. Confluency hücrelerin 50-%75 kadar bir ışık mikroskobu ile görsel denetim tarafından değerlendirildi izlemeniz.

2. bileşik tedavi

1. Deneme günü, her şey bir plaka çamaşır makinesi kullanarak orta Aspire edin. Plaka plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin ve aspirasyon programı seçin. Bir tabak yıkama yoksa, sıvı atık tepsi ya da lavabo üzerinde bir hızlı el twist ile plaka ters çevirme tarafından kaldırılabilir. Sıvı tamamen kaldırılması için iyi bir performans esastır. Herhangi bir aşırı sıvı sonra kağıt havlu ile dabbing tarafından kaldırılır.
2. Hücre kültür otomatik dağıtımı kullanarak orta veya çok kanallı pipet deneme ölçeğini bağlı olarak yürüttüğü konsantrasyonu seyreltilmiş bileşiklerin 30 µL ekleyin. Her tahlil plaka üzerinde birkaç wells (DMSO) negatif ve pozitif (bilinen ligand) denetim eklemek için emin olun. Çünkü bu bir termal üst karakter tahlil, bileşik toplama protein sabitleme gözlemlemek için ayrışma sabiti aşıyor gereklidir. Böylece, kaba bir kılavuz bileşik toplama için 50 - 100 kez IC₅₀, ama daha ayrıntılı açıklamaları için bileşik konsantrasyonları tartışma bölümünde bulunur.
   Not: DMSO tolerabilite hücre hatları deneme önce test edilmelidir.
3. Nefes alabilen bir plaka ile bileşik tedavi tahlil plaka mühür ve 37 ° C ve % 5 CO₂ oksijen kuluçka 30 dakika boyunca kuluçkaya mühür.

3. ısı Challenge

1. İlk olarak, su banyosu istenilen sıcaklığa ayarlayın. Tahlil plaka kuyu içinde ulaştığı son sıcaklık su banyosu içinde son sıcaklık farklı olabileceğini unutmayın. Uzaklık önceden bir sahte plaka ve ısıl termometre ile araştırmak. Genellikle banyo istenilen sıcaklıkta stabilize etmek için 30 dakika sürer.
2. İstenen sıcaklık Isıtma adımı sırasında tahlil plaka wells ulaştığını doğrulayın mühürsüz bir kukla plaka orta aynı birim olarak tahlil plaka içeren hazır olun.
3. Tahlil plakaları kuluçka makinesi kaldırın. Solunabilir mühür almak ve yeniden su kuyu su banyosu içinde sonraki Isıtma sırasında sızıntısı olmayacak emin olmak için sıkı yapışkan alüminyum folyo ile bileşik tedavi hücreleri içeren tahlil plaka mühür. Plaka çerçevesi içinde delik erişilebilir olduğundan emin olun.
4. Tahlil plaka ve sahte plaka su banyosunda altından plakalar dışında kalan herhangi bir hava kuvvetleri için su yüzeyine doğru açılı plaka dibine yerleştirin.
5. Isıl termometre kullanarak yeni bir kukla plaka kuyu içindeki sıcaklık izlemek.
6. Sıcak su banyosu 3 dakika için tahlil plaka. Hemen tahlil ve sahte plaka başka bir su banyosu için 5 dakika soğumasını Oda temperli su ile aktarın. Tahlil plaka artık daha fazla işlem için hazırdır.

4. fiksasyon

1. 10 µL % 16 (w/v) paraformaldehyde (PFA) doğrudan bir toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak tahlil plakasına dağıtmak. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya.
   Not: Bazı fiksajlar kanserojen olarak sınıflandırılır ve kurumsal güvenlik kurallarına uyulmalıdır.
2. İngiltere'de yılın çözüm Aspire edin ve hücreleri bir tabak yıkama 300 µL PBS ile yıkayın. Plaka plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin ve aspirasyon programı seçin.
   Not: Bu yordam içinde sıvı aynı anda reçete kaldırıldı ve plaka contalara bir taşma protokolünü kullanarak optimize edilmiştir. Bir tabak yıkama veya benzer yordam kullanılabilir değilse, çamaşır adım alternatif olarak el ile yapılabilir.
3. Yordam yıkama el ile: Sıvı atık tepsi ya da lavabo üzerinde bir hızlı el twist ile plaka ters çevirme tarafından kuyulardan kaldırın. Sıvı tamamen kaldırılması için iyi bir performans esastır. PBS 80 µL bir çok kanallı pipet ile eklemek ve yukarıda açıklandığı gibi yeniden plaka ters çevir, iki kez çamaşır yordamı yineleyin. Son yıkama sonra plaka karşı herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak için temiz kağıt havlu leke.

5. permeabilization

1. 20 µL % 0.1 (v/v) NP-40 için çok kanallı damlalıklı Wells'le ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. (Yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak hücreleri yıkayın.
2. Alternatif olarak, uygun olduğunda, Örneğinbir antijen alma protokole uygulanır:
   1. 20 µL % 1 SDS wells ile çok kanallı damlalıklı ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya ve göre (yukarıdaki adım 4.2) açıklanan yordamın aynısını yıkayın.
   2. 10 mM glisin 80 μL pH 7.2 ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya. Glisin çözüm plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirerek ve aspirasyon Protokolü seçerek bir plaka çamaşır makinesi kullanarak Aspire edin. Bir tabak yıkama yoksa 2.1 ve 4.2 Notlar'a bakın.

6. engelleme

1. %1 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) 15 µL PBS içinde toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak wells ekleyin. Plaka 1 saat oda sıcaklığında veya gecede bir alüminyum folyo plaka mühür ile 4 ° C'de kuluçkaya.

7. birincil antikor

1. Plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirerek ve aspirasyon Protokolü seçerek bir plaka çamaşır makinesi kullanarak engelleme çözüm Aspire edin. Bir tabak yıkama yoksa 2.1 ve 4.2 Notlar'a bakın.
2. Birincil antikor buna göre seyreltilmiş 10 µL eklemek %1 (w/v) BSA PBS bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için. Plaka 1 saat oda sıcaklığında veya gecede bir alüminyum folyo plaka mühür ile 4 ° C'de kuluçkaya.

8. ikincil antikor

1. Birincil antikor çözüm Aspire edin ve aynı yordam göre wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi yıkayın.
2. Alexa 488 ikincil antikor buna göre seyreltilmiş 10 µL eklemek %1 (w/v) BSA PBS içinde. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya. Işıktan korumak için bir yapışkan alüminyum folyo mühür ile plaka mühür.
   Not: Bu sırasında ışık plaka ve sonraki adımları korumak.

9. nükleer boyama ve cep maskesi

1. 0,05 mg/ml bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için PBS içinde seyreltilmiş nükleer boya 10 µL ekleyin. Oda sıcaklığında ek 10 dakika boyunca kuluçkaya.
2. İkincil antikor ve Höchst çözüm Aspire edin ve wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak yıkayın.
3. 10 µL 200 ng/ml PBS içinde bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için seyreltilmiş cep maskesi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya.
4. Cep maskesi çözüm Aspire edin ve wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak yıkayın.
5. PBS 60 µL tabak yıkama, toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak bütün kuyuları için vazgeçmek ve bir yapışkan alüminyum folyo ile plakalarının.

10. görüntü toplama ve Analizi

1. Yüksek bir içerik Imager 3 floresan kanallarını kullanarak görüntüleri yakalama: DAPI (387/447), GFP (472/520) ve TexasRed (562/624). 4 adet 10 X amacı istimal şey başına elde etmek. Otomatik Lazer otofokus kullanabilir ve satın alma sırasında binning 2 uygulayabilirsiniz. Görüntüler 16 bit, gri ölçek TIFF dosyaları meta veriler ile birlikte olarak saklar.
2. Mevcut yazılım kullanarak görüntüleri analiz. Hücre kenarlıklarını DAPI (çekirdek) ve TexasRed (sitoplazma) ile hücre Puanlama bir algoritma kullanarak tanımlayın.
3. Ortalama yoğunluk elde edilen dalga boyu daha fazla veri analiz için ayıklayın.
4. Tahlil sağlamlık sağlamak için Z-faktör hesaplayın.
5. % Sabitleme aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: 100 * (1-(iyi yoğunluğu-ortalama iyi yoğunluğu negatif kontrol) / (ortalama yoğunluğu olumlu denetim-ortalama yoğunluğu negatif kontrol)). Burada negatif kontrol DMSO ve olumlu denetim başvurusu maddedir. Maksimum istikrar bileşikler arasında farklılık gösterir ve hatta olumlu denetim ITDRF eğriler için daha büyük beri her bileşik için maksimum ve minimum sabitleme yoğunluklarda bazen kontrol wells yoğunluk değerleri yerine kullanılır .

Şekil 1 ' de özetlenen protokolünü CETSA deneyleri tarafından yüksek içerik görüntüleme kalan çözünür protein tespiti ile yapışık hücreleri üzerinde çalıştırmak için temel iş akışını açıklar. Bu iş akışı bileşikleri veya reaktifler14plaka yerleşimini değiştirerek tüm gelişimin tahlil için kolayca adapte edilebilir. Birkaç beklenen kullanım örnekleri aşağıda için beklenen sonuçlar ayrıntı.

Antikor kimlik ve tahlil geliştirme. Birincil bir antikor veya seçime bağlı olarak oluşan ısı sırasında toplanan ve zarlarını protein huzurunda protein yerli şeklinde tanır diğer uygun benzeşim reaktif kimliği başarılı sonuçlar için bir önkoşuldur 3. adımda meydan. Burada açıklanan CETSA görüntüleme tahlil oluşturmak için bir panel 9 antikorların pozitif ve negatif denetimler arasındaki sinyal penceresi için 52 ° C'de p38α hedefleme tarandı. Daha sonra en iyi antikor titre ve Şekil 2 A, B temsilcisi ile ayirt görüntüler bilinen ligand (pozitif kontrol) ve DMSO (negatif kontrol) tarafından stabilize p38α için gösterilen koşullara yerleşti. Antikor tanıma da (Şekil 2C) bağlama ligand tarafından indüklenen hedef proteinin konformasyon değişikliklerden kesintiye değil. Örnek olarak, BIRB796 bir uzun oranı kapalı olan ve sadece bir antijen alma adım (5.2; uygulayarak hedef angajman miktar mümkün Şekil 2B). Birincil antikor performansı bilinen ligandlar farklı bağlayıcı siteleri hedef protein varsa kapsayan doğrulanması önemlidir. Antijen alma adım olmadan ve ile antikor doğrulama tercihen yapılır.

Tagg ve ITDRF eğrileri. Yukarıda belirtildiği gibi CETSA deneyler iki farklı mod, Tagg eğrileri ve ITDRF deneyler çalıştırabilirsiniz. Her iki değişik Şekil 1 ' deki ve protokol bölümünde özetlenen aynı temel iletişim kuralını kullanır. İlk kurulumunda bir sıcaklık gradyanı hücrelerle meydan ve Tagg eğrileri ligand tek bir konsantrasyon ile karşılaştırmak için amacıdır. Bir Tagg eğrisi gerçekleştirmek için ayrı levhalar sıcaklık aralığında 3 dakika ısıtılır. Bu deney gerçekleştirirken, su banyosu için yeni sıcaklık stabilize etmek için gereken zamanı ile her plaka için bileşik tedavi uzunluk zaman önemlidir. Bu bağlamda, ısı meydan adım su banyosunda peforming PCR makinesi tüplerde Isıtma daha fazla zaman alıcı. Deneysel bir ligand ITDRF eğriler oluşturmak için sabit bir sıcaklık sonraki çalışma konsantrasyonu yanıt eğrileri için yoludur. Genel olarak, birden çok bileşikleri sınarken, tahlil hazır kaplamalar, bileşik toplama için en tekrarlanabilir veri elde etmek için otomatik sıvı işleme kullanarak hazırlanır. Bileşikler seri olarak DMSO içinde seyreltilmiş ve hücre kültür medya istenen konsantrasyonları çözünmüş. Genellikle 50-100 µM 3 ya da 4 kat seyreltme başlayan 11 nokta toplama serisi test ettik, ama bu kullanılan ligandlar potens bağlıdır. Bu ilk Tagg eğrisi devamsızlık ve bir ligand varlığı hem de kurmak ve eğriler arasındaki bir kayma nerede gözlenen sıcaklık sonraki izotermal deneyler için seçmek için tavsiye edilir. Seçili sıcaklığı çevresinde veya Tagghemen üstünde olmalıdır. Her ikisi oluşum hedef nişan onay için izin ancak bileşik benzeşim ITDRF sıralaması için deneyler çoğu kez daha uygun. Tipik bir ITDRF denemenin sonuçları Şekil 3B quantifies ve Şekil 3A Tagg eğriye ait beklenen quantified sonuçlarının bir örnek gösterir.

Kampanya eleme. İletişim kuralı da kampanyaları hedef protein roman ciltleri tanımlamak için eleme için adapte edilebilir. Bu durumda, izotermal ısı zorluklar çok sayıda bileşikler, ITDRF deneyler için tanımlanan teskin bileşikler ardından tek bir konsantrasyon için uygulanır. Tahlil hazır tarama plakaları hazırlayacak ve Kültür medya otomatik sıvı işleme kullanarak tahlil plakaları seyreltilmiş bileşikler transfer. Tüm termal kararlılık deneyleri ile protein sabitleme gözlemlemek için ayrışma sabiti aşmak gereklidir ve böylece küçük molekül kitaplıkları isabet kimlik kolaylaştırmak için 50 µM, uyguladığınız gibi. ITDRF kullanarak, şarkıları önceliklendirmek daha sonra sıralama ve öncelik belirlemesi bu bileşiklerin izin verir. Şekil 4 tarama plaka temsilcisi bir sonucu gösterir.

Resim 1 . Bu makalede açıklanan protokol şematik bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Antikor geliştirme kimlik ve tahlil. A) insan p38α A-431 hücrelerdeki tespiti için örnek veri. Pozitif temsilcisi görüntüler (1 µM AMG548) ve negatif (DMSO) kontrol eder. Kırmızı - nükleer Höchst boyama, boyama yeşil-p38α. 10 X büyütme ile çekilen görüntüler; Beyaz ölçek çubuğu 73 µm. B temsil eder) Ortalama Yoğunluk/hücre ifade edilen quantified veri örneği. Hata çubukları standart hatası 6 ayrı levhalar için 16 çoğaltır ortalamasını temsil eder. Her plaka hücreleri, permeabilization ve sonraki immunostaining fiksasyonu tarafından takip bir su banyosunda 52 ° c sıcak olduğu. C) ayirt sinyal yoğunluğu ölçülür A-431 hücreleri tedavi sonra 1 µM ile BIRB796 veya DMSO yukarıda açıklandığı gibi doğrudan fiksasyon tarafından takip. Bir Isıtma adım yokluğunda, BIRB796 sinyal BIRB796 p38α bu antikor ile tespiti bozan düşündüren DMSO sinyal daha düşüktür. D) ITDRFCETSA eğrileri hücreler için tedavi BIRB796 ile ikisinden biri (mavi üçgen) ile veya olmadan (gri üçgen) antijen alma protokolü. Bu rakam Axelsson vd. 201812den değiştirildi. Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Termal toplama ve ITDRF deneyler. A) termal toplama eğrisi deneyler hücreler için tedavi ile pozitif (1 µM AMG548, turuncu) ve negatif (DMSO gri) kontrol eder. Hata çubukları standart hatasını 32 veya 464 çoğaltır ortalamasını temsil eder. B) ITDRFCETSA deney 52 ° c hücreler için yapılan tedavi ile seri halinde dilutions SB203580 mavi, Skepinone-L yeşil ve kırmızı RWJ67657. Hata çubukları standart hatası 6 çoğaltır ortalamasını temsil eder. Quantified veriler Ortalama Yoğunluk/hücre ifade edilen ve ilgili bileşik en yoğun karşı normalleştirilmiş. Bu rakam Axelsson vd. 201812den değiştirildi. Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 . 10 X büyütme bir tarama plaka temsilcisi bakış. Pozitif denetimleri (1 µM AMG548) 2 ve 24 sütun biçimidir ve negatif denetimleri (DMSO) sütun 1 ve 23 vardır. Diğer wells 50 µM ile belirtilen birden fazla bulunan ile tarama için kullanılan kitaplık bileşikleri içerir. İç metin rakamlar beyaz satır sağ alt köşesinde, 200 µm temsil eder. Bu rakam Axelsson vd. 201812den değiştirildi. Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar hiçbir açıklamaları rapor var.