Kapsül tutarı kesintili yoğunluk Gradient kullanarak bakterilerin ayıran

Birçok bakteri türü bakteriyel hücre çeşitli fiziksel vurguluyor ve tanıma ve öldürme koruyan bağışıklık sistemi tarafından bir polisakkarit kapsülü üretmek. Klebsiella pneumoniaeiçinde kapsül üretim enfeksiyon^1,2için mutlak bir gerekliliktir. K. pneumoniae kapsül direnç antimikrobiyal peptidler, direnç kompleman aracılı öldürme, fagositoz önlenmesi ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı³bastırılması için aracılık eder. Fazla kapsül üretim artan virülans ve toplum-(yerine nozokomiyal) infeksiyonları⁴ile ilişkilidir.

Nicel ve nitel testlerden kapsül üretim araştırmak kullanılabilir. Klebsiella türleri için bu bir koloni için dokundu bir kürdan yukarı doğru çekilir ve üretilen dizenin uzunluğu ölçülür, dize testi⁵ve, yavaş Santrifüjü içerir mucoviscosity tahlil⁶, içerir süpernatant optik yoğunluk ölçme tarafından takip bir kültür. Bu yöntem basit ve hızlı ancak klasik Klebsiella üzerinde kullanıldığında duyarlılık suşları kapsül overproducing suşları yerine. Başka bir kapsül miktar teknik olarak zordur ve konsantre sülfürik asit¹kullanımını gerektirir uronic asit tahlil yöntemidir. Son olarak, kapsül doğrudan mikroskobu (Şekil 1A) tarafından görülür. Bu yöntemlerden yalnızca mikroskobu farklı birleştıirme Birleşik tek bir nüfus içinde gözlemlemek Kullanıcı sağlar ve bu yöntemlerden hiçbiri capsulated ve capsulated bakteri fiziksel ayrılması sağlar.

Yoğunluk tabanlı renk ayrımları degrade Santrifüjü tarafından rutin olarak hücre biyolojisi farklı ökaryotik hücre türleri⁷arındırmak için kullanılır, ancak nadiren mikrobiyolojik araştırmada kullanılır. Mucoviscosity tahlil Klebsiella için son derece capsulated bakteriler tarafından Santrifüjü cips için daha fazla zaman ayırın ve bu capsulated hücreleri azaltılmış genel yoğunluğu nedeniyle olabilir gerekçeli gözlem temel alır. Burada gösterilen yöntem K. pneumoniae nüfus ayırmak için fiziksel olarak yoğunluk gradient Santrifüjü (Şekil 1) kullanarak kapsül tutarını tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem diğer bakteriyel türler için geçerli olduğunu belirten Streptococcus pneumoniae, başarıyla uygulandı. Doymuş transposon mutant kitaplığa ayrılması yoğunluğu-gradient transposon-ekleme sıralama ile birleştiğinde (yoğunluk-TraDISort) genleri kapsül üretim ve düzenleme⁸' de yer alan tanımlamak için kullanılır. Benzer şekilde, bu yöntem bireysel kolonileri Başbakan rasgele polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile birlikte capsulated K. pneumoniae ayırmak için kullanılan mutantlar. Bu yöntem kapsül üretim farklı popülasyonlar ve koşullar arasında veya karmaşık örnekleri (Şekil 1B) capsulated bakterilerden arındırmak için hızlı karşılaştırmalar için de kullanılabilir. Son olarak, yoğunluğu, hücre boyutunu veya toplama gibi etkiler diğer fenotipleri tahlil için seçeneği vardır.

Bu el yazması yeni bakteriyel türler veya zorlanma yordamı optimize etmek gösterilmiştir ve inşaat ve hiper-capsulated, capsulated ve capsulated bakteri ayırmak için kesintili yoğunluğu geçişin çalışan gösterir.

Not: Herhangi bir risk değerlendirmesi için bakteri suşları geçerli kültür ve örnekleri tutarken uyduğunu emin olun. Bu kadar çok fazla degradeler aynı anda ayarlama kas-iskelet bozuklukları basınç nedeniyle yavaş pipetting gelen eklem dahil yol açabilir unutmayın. İş planı ve yaralanmayı önlemek için önlemler almak.

1. bakteri suşları veya Mutant kitaplıkları hazırlanması

1. Çizgi uygun ağar kaplamalar üzerinde test edilecek suşları dışarı. Bu deney için hisse senedi plakaları vardır.
   1. Plakayı gecede istenilen sıcaklıkta tek kolonileri ulaşmak için kuluçkaya. Bu deneme için, K. pneumoniae (NTUH-K2044 ve ATCC43816 suş) kan agar 37 ° C'de oksijen mum kavanozda üzerinde Luria suyu (LB) agar 37 ° C ve S. pneumoniae (23F vahşi türü ve 23F Δcps) Tarih kültür
2. Bir koloni 10 mL aşılamak için bir hisse senedi plaka (adım 1.1) bir kısır döngü veya kokteyl çubuğu kullanarak uygun suyu al. Rasgele mutant kitaplıkları ile taranması için et suyu ile (TraDIS Kütüphane) rastgele mutant Kütüphane stokunun 10 µL aşılamak.
   1. K. pneumoniae suşları 37 ° C'de sallayarak ile düşük tuz LB medyada ve S. pneumoniae suşları beyin kalp infüzyon (BHI) ortamda, statik olarak 37 ° C'de kuluçkaya
   2. Gecede kültür 15 mL tüp ve 3200 x g hızıyla kova 15 mL tüp ekler ve aerosol sıkı kapakları ile dışarı de 10 min için bir tezgah üstü santrifüj santrifüje aktarın.
   3. Süpernatant atın ve pelet 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 2 ml resuspend.
      Not: Süpernatant ile uygun sıvı biyolojik atık rota laboratuvarda atın. Santrifüjü ve resuspension adım (1.2.2 ve 1.2.3) amacı bakteri geçişin üzerinde kolay görüntüleme için konsantre etmektir. Bakteriyel kültürlerde doğrudan degrade tercih yüklenebilir. Ağır capsulated suşları sıkı bir Pelet oluşturabilir değil. Bu durum ortaya çıkarsa, çok süpernatant mümkün olduğu herhangi bir bakteri hücreleri çıkarmadan kaldırın 5 mL son bir hacim için 1 x PBS ekleyin ve Pelet resuspend. Adım 1.2.5 protokolüyle devam.
   4. Sigara mukoid suşları için 2. adıma geçin.
   5. Tüpler santrifüj kapasitesi 1.2.2. adımda açıklandığı gibi.
   6. Süpernatant atın ve Pelet 2 mL 1 x PBS resuspend. Şimdi kullanıma hazır hücrelerdir.
      Not: Bakteri hücre süspansiyon yoğunluğu önemli değil ama degradedeki görselleştirme için yeterli olması gerekir. En az bir OD₆₀₀ (optik yoğunluk 600 nm) 4 / önerilmektedir.

2. degrade Dilutions ve mini degrade Test hazırlanması

1. Degrade dilutions hazırlayın.
   Not: Yoğunluk gradyanlar içinde iyi ayırma ulaşmak için gereken tam konsantrasyonları yoğunluk gradient Orta (Örneğin, Percoll) kullanılan bakteriyel zorlanma ve büyüme koşullarına bağlı olarak değişir. Mini degrade testler ilk olarak, en iyi ayrılık verecektir konsantrasyonları tanımlamak için uygulanmaktadır. Bunlar 2 mL tüp içinde tek bir seyreltme 500 µL oluşturmaktadır. Bakteri degrade çıkarılan ve aşağı akım uygulamaları için subcultured, aşağıdaki adımları aseptik koşullar altında yapılmalıdır.
   1. Yoğunluk gradient Orta yoğunluk gradient dilutions yapmak için 1 x PBS ile birleştirin. Dilutions % 20, % 30, % 40, % 50, % 60, % 70 ve % 80 yapmak (örneğin, 2 mL yoğunluğu degrade orta artı 8 mL 1 x PBS 10 mL % 20 yoğunluk gradient orta =).
   2. % 20 degrade seyreltme için test edilecek her zorlanma 2 mL tüp içine aliquot 500 µL (örneğin, 4 suşları 4 tüpler % 20 degrade seyreltme 500 µL içeren =).
   3. 2.1.2 degrade dilutions geri kalanı için yineleyin.
2. Bakteri için degrade uygulayın.
   1. Bakteriyel hücre aşağıdaki adımları izleyerek her degrade seyreltme tepesine 1.2.3 ve 1.2.6 adımda hazırlanan 100 µL uygulanır.
      1. Hücreleri 200 µL pipet kullanarak 100 µL alın ve hemen altında mini geçişin menisküs tüp tarafında pipet ucu yerleştirin.
      2. Böylece onlar herhangi bir arayüz karıştırma olmadan bir katman geçişin, üst formu geçişin üzerine bakteri hücreleri son derece yavaş Aspire edin.
      3. Adımları 2.2.1.1–2.2.1.2 test edilecek tüm suşları için yineleyin.
   2. Sabit açılı rotor bir aerosol sıkı kapaklı kullanarak, bir microcentrifuge 8000 x g, 10 min için hazırlanan tüplerde santrifüj kapasitesi.
   3. Santrifüjü sonra tüpler katmanının aralıklarla takip sadece degrade hücreleri korumak için gereken minimum degrade seyreltme görselleştirmek için bir raf aktarın.
   4. Sonuçları net değildir, Mini degrade testi %5 yoğunluk gradient orta dilutions yukarıdaki artışlarla yineleyin ve tanımlanan konsantrasyonları aşağıda 2.1.1 adım (% 30 sonuç belirsiz ise örneğin, % 25 ve % 35 dilutions test edilmelidir).
      Not: Şekil 2A tipik sonuçları bir tek yoğunluk gradient orta seyreltme için bkz.
   5. Adımları 2.2.3–2.2.4 sonuçlarından ayrı hücreler daha büyük ölçekli iş öğelerinin sürekli olmayan gradyanlar içinde kullanmak için ideal degrade dilutions belirlemek için kullanın.

3. ana deneme için hücreleri hazırlanması

1. Taze gecede kültür 1.2 adımda anlatıldığı gibi uygun suyu 10 mL aşı hazırlayın.
   1. Uygun koşullar gecede kültürlerde 1.2.1 adımda anlatıldığı gibi kuluçkaya.
   2. Gecede kültür 1.2.2. adımda açıklandığı gibi cips.
2. Hücreleri 1.2.3. adımda açıklandığı gibi yıkayın.
3. Süpernatant atın ve pelet 1 mL 1 x PBS resuspend. Zorlanma mukoid ise ve kolayca cips değil, Pelet PBS veya kalıntı ortam ilâ 2 mL resuspend. Şimdi kullanıma hazır hücrelerdir.

4. sürekli yoğunluk gradyanlar hazırlanması

Not: Alternatif bir Yöntem (az yoğun bir pipet kullanarak) üst (en yoğun) alttan degrade hazırlanması 7. adımda anlatılan.

1. Pipet 1 mL 5 mL polipropilen içine en seyreltik yoğunluk gradient seyreltme yuvarlak alt tüp geçişin en iyi, en seyreltik, katman oluşturmak için.
   Not: sonraki kat daha yoğun degrade dilutions katmanları kesintiye uğratmak değil için bir iğne kullanarak bu katmanın altında eklenecektir. İki en az ve en fazla üç degrade katman 1 ml sağlam ayrımı ve bakterilerin kolay görüntüleme için önerilir.
   1. 1 mL tek kullanımlık şırınga bağlı bir 1,5 inç iğne ile kullanarak, sonraki en yoğun yoğunluk gradient orta seyreltme şırınga içine 1 mL al. Kabarcıklar degrade katmanları bozabilir gibi herhangi bir hava kadar almaktan kaçının.
   2. İğne sonuna ilk katman içeren tüp altındaki yer. Şırınga içeriği çok yavaş arayüz karıştırma önlemek için Aspire edin.
      Not: Daha yoğun degrade seyreltme eklendikçe iki dilutions arabiriminin artacak. Arabirimin kadar ışık veya bir dış pencere tutarak gözlemlemek. Farklı bir arabirim gözlem yapılırsa, degradenin atın ve yeniden başlatın.
      1. İğne degrade farklı degrade dilutions arasında arayüz rahatsız etmek çok yavaşça çıkarın. Tüp dik tutmak için uygun bir rafa yerleştirin.
   3. Üç farklı dilutions kullanıyorsanız, en yoğun seyreltme altındaysa adımları 4.1.1–4.1.2.1 yineleyin. Geçişin başarılı bir şekilde inşa edilmiştir, hiçbir arabirimleri karıştırma ile üç farklı katmanları olacak.

5. degradeler ve ayrılık Santrifüjü tarafından hazırlanan hücre ekleme

1. Hazırlanan hücre 600 µL 3.3 adımından üst tüp geçişin çok yavaş ve belgili tanımlık arayüzey, karıştırma olmadan 2.2. adımda açıklandığı gibi ekleyin.
2. Tüpler tüp bağdaştırıcıları'nda yeri ve kombine bağdaştırıcıları ve tüpler onlar dengeli emin olmak için tartmak.
   1. Bir sabit açılı rotor içinde bir tezgah üstü santrifüj tüpü bağdaştırıcıları yerleştirin. Santrifüj 3000 x gde 30 dk için.
   2. Santrifüjü sonra dikkatlice tüpler kaldırın, onlara uygun bir rafa yerleştirin ve sonuçları bir kayıt olarak fotoğraf.
3. Bakteriyel fraksiyonları uronic asit miktar için yeniden elde etmek veya takip ederek DNA ekstraksiyon adım 6.
   1. Örnekleri/degradeler yolu ile aşağı akım uygulamaları gerekli değilse, uygun sıvı biyolojik atık rota laboratuvarda atın.
      Not: Bakteri yeni türler/suşları için ayrılması doğrulanması önemlidir. Degrade gelen bireysel kesirler mikroskobu, uronic asit tahlil (adım 8) veya başka bir uygun nicel tahlil her kesir kapsül fenotip onaylamak için tarafından incelenmesi gerekir. Amaç toplama veya hücre boyutuna göre ayırmak için ise, bağımsız uygun deneyleri kullanılmalıdır.

6. örnek kesirler ve isteğe bağlı akıbet adım kurtarma

1. Kesirler bir degrade kaldırma ve bu katman içinde hiçbir bakteriyel kesir varsa üst seyreltme herhangi bir sıvı atarak kurtarmak.
   1. Üst kısmını kaldırmak için P200 pipet kullanın ve yavaşça kesir için pipet ucu geçişin üzerinden geçmek ve kesir götür. Kesir 1,5 mL tüp içine yerleştirin ve uygun şekilde etiketleyin.
   2. Hala P200 pipet kullanarak daha fazla kesirler kurtarmak için ucu hafifçe kesir degradeye aracılığıyla ekleme ve kesir bir taze 1,5 mL tüp için yeniden elde etmek. Degrade alt kesirler erişildiği gibi Aşırı degrade kaldırın.
   3. Eğer DNA çekme--dan çok düşük hücre sayıları içeren bir kısmını (örneğin, için yoğunluğu-TraDISort), gerekli alt kültür kesir adım 6.2 daha fazla hücre elde etmek isteğe bağlı akıbet için iletişim kuralı takip ederek.
      Not: Kesirler yukarıdan aşağıya doğru kaldırılır olarak ertelenmiş gradyan alt kesirler, içine üstündeki hücrelerden düşük düzeyde olacak. Bu dikkatli bir şekilde çalışarak en aza indirmek çok degrade alt kesirler kaldırmak için bir iğne kullanarak ve çok düşük bereket örnekleri yeniden arıtma nerede ertelenmiş sonuçları etkileyebilecek gerçekleştirme karıştırmak değil.
2. Adımları 6.1.1–6.1.2 uygun sıvı ortam 5 mL kurtarılan düşük-bereket kesir hücrelerden transfer. Bir kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C'de 2 h için büyümek
   1. Büyüme veya ne zaman örnek 1 OD₆₀₀ ulaştı 2 h sonra kültür 15 mL tüp aktarın. Santrifüj tüpü 10 dk santrifüj salıncak kovalar ve aerosol sıkı kapakları ile 3200 x g az için kapasitesi. Süpernatant atmak
   2. Hücre pelet 1 mL 1 x PBS resuspend.
3. 5 mL polipropilen boru taze tek-konsantrasyon yoğunluğu Gradyanda hazırlayın. Degrade konsantrasyon üzerinden hemen üstünde orijinal degradedeki kesir konumunu (örneğin, arıtma gösterilen Şekil 2' de D, % 15 yoğunluk gradient orta kullanılacak ΔslyA mutant için) kullanın.
   Not: bu yeniden arıtma isteğe bağlı bir adımdır.
   1. Hücrelerin üst degrade ve 2.2 ve 5.1 adımlarda açıklandığı gibi santrifüj uygulanır.
   2. Tüpler santrifüj çıkarın ve uygun bir rafa yerleştirin. Degrade fotoğrafını çekip 6.1 – 6.1.2 içinde açıklandığı gibi DNA ekstraksiyon fraksiyonu kurtarmak.
      Not: Örnek şimdi DNA ekstraksiyon veya aşağı akım diğer uygulamalar için hazırdır.

7. alternatif Yöntem (az yoğun bir pipet kullanarak) üst (en yoğun) alttan degrade kursları

1. 2.2.3. adımda belirlenen degrade dilutions kullanın. 1000 µL pipet kullanarak, en yoğun degrade seyreltme 1 mL 5 mL tüp ekleyin.
   1. 200 µL pipet kullanarak, sonraki yoğun degrade seyreltme 200 µL çok yavaş arabirimi karıştırmayın tüpü, katmanda tepesine ekleyin. Başka bir 200 µL ve sonra son 600 µL verir daha pipetting hızından kontrol ve arayüzü karıştırma engeller birden çok daha küçük birim ekleme. ekleyin. Arabirimi karışımları, silmek ve yeniden başlatın.
   2. Üç dilutions kullanılıyorsa, 7.1.1 üçüncü, az yoğun degrade konsantrasyon ile adımları yineleyin. Tüp artık gradyanlar 2 mL veya adım 2.2.3 sonuçlarından bağlı olarak 3 mL olmalıdır.
   3. Hücre Ekle ve deneme devam etmek için iletişim kuralı 5 adıma geçin.

8. Uronic asit tahlil kapsül miktar ölçümü

1. 4.0 için kurtarılan her kesir OD₆₀₀ seyreltme PBS ile ayarlayın. Daha önce yayımlanmış¹olarak uronic asit miktar ile devam edin.

Temsilcisi sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Kesin sonuç beklemek bakteriyel türler, yoğunluk gradyanlar up bağlıdır ve kullanıcının tek bir zorlanma veya havuzu mutantların inceleyerek olduğunu. Çoğu suşları Şekil 2A gösterildiği gibi bir degrade içindeki tek bir konuma geçireceği ve 2D. Bir bakteri mutasyona uğramış Kitaplığı'na yöntemi uygulayarak degrade, degrade ve küçük acapsular kesir (Şekil 2B) altındaki en üst katmanı yoluyla dağıtılan daha az yoğun bir grup yukarıda büyük bir grup ortaya çıkmasına. Bu kesirler kapsül tutarı uronic asit (Şekil 2B) için bir tahlil tarafından gösterildiği gibi farklı. Transposon ekleme sıralama bireysel kesirler, sonuçları farklı degrade kesirler içinde belirli mutantların açık yerelleştirme K. pneumoniae ATCC43816 kapsül biyosentezi odağı için gösterildiği gibi (Şekil 2C). K. pneumoniae NTUH-K2044 ve S. pneumoniaeve farklı kapsül biyosentezi veya düzenleyici mutantlar, saf kültürler için temsilcisi sonuçları Şekil 2' deDgösterilir.

Resim 1 : Bakterileri kapsül ve uygulamaları göre ayırmak için yoğunluk Santrifüjü yönteminin şematik. (A) capsulated Klebsiella pneumoniae elektron mikroskobu görüntüsü hücre. Kapsül hücrenin dış yoğun bir katman olarak görülür. Capsulated bakteri yoğunluğu Santrifüjü çalışma için (B) uygulamaları. (Bı) Yoğunluk ayrılık yüksek - düşük- ve no-kapsül kesirler transposon mutant kütüphane oluşturmak için kullanılan ve kapsül üretim etkisi genlerin tanımlamak için transposon ekleme sıralama tarafından takip. (Bıı) Karmaşık bir örnek capsulated bakterilerden arıtma. (Bill) Örnekler arasındaki kapsül miktarın hızlı karşılaştırmalar için kullanım yoğunluğu tabanlı ayrılık. Bu yöntem ayrıca hànzú kapsül üretim görselleştirme bakteriyel nüfus (Billiçinde) gösterildiği gibi sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Temsilcisi sonuçları. Mini degrade testleri(a)örnek çıktı. İki farklı K. pneumoniae suşları 1 mL % 15 yoğunluk gradient orta centrifuged. (Daha az kapsül kılan) ATCC43816 katmanın altına geçirir iken hypermucoviscous NTUH-K2044 zorlanma yoğunluk gradient orta katmanın üzerinde korunur. (Bı) Transposon mutant Kütüphane üç kesirleri ayırmak için yoğunluk degrade kullanımı. Not alt kesir mutantlar düşük bir oranda içerir ve bu resim görünür değil. (Bıı) Üst, orta ve alt kesirler bir tahlil uronic asitler için kullanarak farklı kapsül miktarlarda doğrulaması. Kesirler izole ve PBS içinde bir OD600 / 4, resuspended üst, orta ve geçmek alt hücrelerden sonra çıkarılan polisakkaritler kapsül ve uronic asitler1ölçülür. (C) örnek yoğunluk-TraDISort sonuçları. Mutasyon konumlar tespit kromozom diyagram üzerinde mavi çizgilerle gösterilir. Kapsül eksik mutantlar bu giriş kütüphanede mevcut olan, ancak alt kesir zenginleştirilmiş ise en iyi kesir kapsül biyosentezi locus8için aşağıda gösterildiği gibi tükenmiş olarak tespit edilebilir. (D) kapsül vahşi türü ve K. pneumoniae NTUH-K2044 ve S. pneumoniae 23F mutant suşları arasında karşılaştırmak için yoğunluk gradient Santrifüjü kullanarak bir örnek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa etmek hiçbir mali çıkarları var.