Yöntem makalesi

Hücre yapışma teşvik içinde tamamlayıcı protein C1q ve Hyalüronik asit arasındaki Interplay değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/58688

⸱

15 Haziran 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tamamlayıcı bileşen C1q, doku mikroortamında yüksek derecede ifade edilen, hücre dışı matriks ile etkileşimde bulunan, Pro-inflamatuar bir molekül. Burada, biz nasıl C1q hyaluronik asit etkileri hücre yapışma bağlı test etmek için bir yöntem tarif.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör mikroortamın neoplazi büyümesi ve metasrat içinde aktif rol oynadığını giderek ortaya koymuştur. Farklı yollar sayesinde, tümör hücreleri etkili bir şekilde stromal, bağışıklık ve endotel hücreleri uyarıcı faktörler, kemokinler ve sitokinlerin salgılar tarafından işe. Buna göre, bu hücreler, yüksek proliferasyonu ve metastatik yetkinliği sürdürmek için büyüme teşvik sinyalleri, metabolitleri ve ekstrasellüler matris bileşenlerini serbest bırakarak mikroortamın sinyalizasyon özelliklerini değiştirebilir. Bu bağlamda, biz tamamlayıcı bileşen C1q, yüksek ölçüde insan malign tümörlerin bir dizi tarafından yerel olarak ifade, ekstraküler matris hyaluronik asit ile etkileşim üzerine, güçlü insan tümöründen izole primer hücrelerin davranışını etkiler tespit Örnek. Burada, biz nasıl C1q hyaluronik asit (HA) etkileri tümör hücre yapışması bağlı test etmek için bir yöntem açıklamak, gerçekte temel bileşenlerin biyolojik özellikleri (Bu durumda HA) ekstrasellüler matrisin temel bileşenlerinin tümör doğru biyoaktif sinyaller şeklinde olabilir Ilerleme.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör mikroçevre (TME), hücre hayatta kalma, büyüme ve istilası için karşı bir niş sağlayabilmesi için kanser gelişimini ve ilerlemesini etkiler. TME 'deki yeni anahtar oyuncularının tanımlanması, hedef terapi için yeni moleküler araçların keşfi için yararlı olabilir. TME, endotel hücreler, fibroblastlar ve bağışıklık sisteminin hücreleri gibi Malign olmayan hücrelerin karmaşık ve dinamik ağını içerir ve bu da collagens, Laminins, fibronektinler dahil olmak üzere çevredeki ekstrelüler matris (ECM) bileşenlerine gömülür. Proteoglikanlar ve hyaluronans. Hem tümör hem de tümör içermeyen hücreler, TME 'nin fiziksel, kimyasal ve sinyalizasyon özelliklerini genel olarak değiştiren sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve inflamatuar ve matris remodeling enzimleriyle ECM bileşenlerini sentezleyen ve salgılar. Bu bileşenler arasında, hyaluronik asit (HA) tümör biyolojisinde önemli bir rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Basit kimyasal bileşimine rağmen, HA, onun HA-bağlayıcı molekülleri ile birlikte (hyalyapışlar), anjiyogenezi modüle edebilir, bağışıklık sistemi yanıt ve ECM bir boyut ve konsantrasyon bağımlı şekilde yeniden modelleme1.

Tamamlayıcı (C) sistemi de yakın zamanda artan ilgi aldı yerel TME, bir parçasıdır. C sistemi, non-Self-hücrelere, istenmeyen konak elemanları ve patojenlere karşı savunma ilk satırında yer alan çözünür ve membran bağlı proteinleri bir dizi kapsar. İşlevsel olarak, C, doğal ve adaptif sistemlerin iki efektör kollarını doğrudan hücre öldürme ya da bir inflamatuar yanıt2montaj teşvik etmek bağlar. C aktivasyon kanser hücrelerini yok ederek veya onların büyüme inhibe ederek, tümör büyümesini bastırmak, ama giderek bu kronik inflamasyon sürdürülmesi tarafından bir tümör teşvik aktivitesi sahip olabilir açık hale gelmiştir, bir kurulması teşvik immünosupresif çevre, anjiyogenez inducing, ve kansere bağlı sinyalizasyon yolları aktive3. Bu bağlamda, C1q, c sisteminin klasik yolunun ilk tanıma molekülü, C aktivasyonu4' ten bağımsız olarak tümör mikroortamındaki önemli fonksiyonları ortaya çıkartmıştır. C1q, anjiyogenezi ve metasjen5' e ek olarak kanser hücresi yapışma, göç ve proliferasyon lehine olabilir insan malign tümörlerin bir dizi yerel olarak ifade edilmesi gösterilmiştir. İlginçtir C1q ECM gibi büyük bir kurucu ile etkileşime girer.

Primer kanser hücrelerini tümör kütlesine izole etmek için bir teknik geliştirdik. Ayrıca, biz, özellikle C1q ve yüksek moleküler ağırlık hyaluronik asit arasındaki etkileşimi tümör mikroçevre teşvik edebilir matris oluşturdu. C1q bağlı HA tümör hücrelerinin yapışmasını ikna edebildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastadan gelen doku örnekleri, Italya 'nın Trieste Üniversitesi Hastanesi kurumsal Kurulu tarafından etik hususları onayladıktan sonra bilgilendirilmiş onay sonrasında toplandı.

1. tümör hücre yalıtımı ve Kültür (gün 1)

  1. İnsan mezotelyoma hücrelerini MPM katı örneklerden yalıtın. Yaklaşık 2-3 mm2 boyutunda parçalar elde etmek ve 0,5 mm CA2 +/mg2 +, 0,5% tripsin ve 50 μg/ml ile desteklenen Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ' den oluşan 5 ml sindirim çözeltisi içinde inkük olan dokuyu bir kesici ile ince bir şekilde kıyma DNase ı, gece 4 °C ' de.
  2. Tümör hücresi yalıtımı ve kültürü (2. gün)
    1. Gece inkübasyon sonrası, sindirilmiş dokusu 37 °C ' de 30 dakika boyunca hafifçe sallama ile yerleştirin.
    2. Santrifüjleme üzerine sindirim çözeltisi değiştirin (250 x g) ile 3 mg/ml kolajenaz tipi 1 çözünür 5 ml Orta 199 HBSS ile ve daha fazla inkük 30 dakika için 37 °c hafif sallayarak ile.
    3. Enzimatik reaksiyonu% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek engelleyin. Hücrelerin çoğunun dokudan serbest bırakıldığından emin olmak için 5 mL pipet ile hücreleri çok dikkatlice resuspend. Ardından, hücre süspansiyonunu 100 μm gözenek filtresine göre filtreleyin.
    4. Bir 12,5 cm2 Flask ve kültür onları 37 °c ' de insan endotel hücreleri ile serum-serbest Orta (hesf),% 10 FBS ve egf (10 ng/ml), temel fgf (20 ng/ml), ve 1% penisilin-streptomisin ile Takviyeler.
      Not: her 2-3 gün taze orta ile değiştirin.

2. HA kaplama (gün 1)

  1. 1 mg/mL6konsantrasyonunda çift distile su içinde yüksek moleküler ağırlık HA (1,5 kDa) resuspend.
  2. 50, karbonat/bikarbonat tamponunda (0,1 M, pH 9,6), nazik pipetleme ile dilute HA stok çözümüdür.
  3. 96-kuyu plakasını, 4 °C ' de gece başına 100 μL dilüt HA stok çözeltisi ile kat.
    Not: hyaluronik asit Profesör Ivan Donati, Yaşam Bilimleri Bölümü, Trieste Üniversitesi7bir tür hediye oldu.

3. C1q kaplama (gün 2)

  1. Gece kuluçkının ardından, vakum tedavi edilen kuyuları Aspire ve 96-kuyu plakasını aynı zamanda 100 μL, Dulbecco 'nun PBS 'si (dpbs) ile yıkayın.
  2. 100 μL dPBS + 0,5% BSA ve 0,7 mM CA2+/mg 2 + ' da 25 μg/ml 'lik bir konsantrasyonda bu proteinlere inkük ederek plastik immobilized-ha ' y a bağlamak için C1q (25 μg/ml veya doz tepkisi denemeleri için farklı konsantrasyonlar) veya BSA (negatif kontrol olarak) izin verin. . Sonra gece 4 °C ' de inkübe.
  3. Vakum, kuyuları Aspire ve 100 μL/iyi dpbs ile 96-kuyu plakasını yıkayın.

4. hızlı dıı ile hücre etiketleme

  1. 10 μg/mL floresan boya hızlı dıı içeren dPBS 500 μL 'de resuspend 1 x 105 tümör hücreleri. 5 dakika aralıklarından sonra el ile karıştırma, etiketleme için 5% v/v CO2 kuluçko Içinde 37 °c 15 dakika boyunca inkübe.
    1. Aşırı hızlı dıı kaldırmak için, 10 mL dPBS eklemek, yavaşça yukarı ve aşağı pipet ve 7 dakika için 250 x g Santrifüjü 1 ml insan endotel serum ücretsiz orta içeren hücre pelet 0,1% BSA (hesf + 0,1% BSA).

5. HA/C1q matrisler üzerinde hücre yapışma (gün 1)

  1. Vakum, farklı matrisler ile kaplı kuyuları Aspire (kuyular adım 3,2 kaplı).
  2. Etiketli hücre süspansiyonunun 100 μL 'ini kaplanmış kuyulara dağıtın ve% 5 v/v CO2 inkükoplinde 37 °c ' de 35 dakika için plakası kuluçd.
  3. Supernatant duman çekiş olmayan-yapışmaz hücreleri çıkarın. % 0,5 BSA, 0,7 mM CA2 + ve 0,7 mm MG2 +içeren dpbs ile bir kez yıkayın.
  4. 10 mm Tris-HCL, pH 7,4 +% 0,1% v/v SDS 200 μL/Well ekleyerek yapışan hücreleri Lyse ve hemen bir floresan okuyucu (544 Nm, emisyon 590 Nm) ile 96-Well plaka okuyun etiket artan sayıda lizis ile oluşturulan bir kalibrasyon eğrisi kullanarak Hücre.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HA, tekrarlayan (β, 1-4)-D-glukuronik asit-(β, 1-3)-N-asetil-D-glukolin disakkarid üniteler (Şekil 1B)7' den oluşan, negatif olarak şarj edilmiş yüksek molekül ağırlığı polizakkaridin. 96-Well plaka üzerinde ha bağlayıcı oluşumu yanı sıra onun immobilizasyon verimliliği biyotinlenmiş ha yararlanarak test edildi (Bio-ha). 10 μg/mL 'den 1 mg/mL 'ye kadar farklı biyo-HA konsantrasyonları, 100 mM karbonat/bikarbonat-buffer pH 9,6 ' de yeni...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz nasıl tamamlayıcı bileşen C1q, hyaluronik asit ile etkileşim, insan tümörü dokularından izole primer hücrelerin davranışını modüle edebiliyoruz araştırmak için kolay bir yöntem açıklanmaktadır. Hem HA hem de C1q, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda, çeşitli hücre biyolojik süreçlerine katılan doku mikroortamında oldukça mevcuttur. Örneğin, C1q plasentanın mikroortamında mevcut olduğu görüldüğü için, plasentasyon8' de maternal decidua 'nın ekstrıillous trofoblast istilasını sunar. C1q Ay...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir ilgi çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda gerçekleştirildiğini beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ivan Donati 'ye, HA, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (ıRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italya) ve Andrea Romano (operatif klinik anatomisi ve patolojik Histoloji Anabilim Dalı, Cattinara Hastanesi, Trieste, Italya ) doku numune toplama için. Biz video hazırlama ve Alex Coppola, ses yardım için de Nicolò Morosini teşekkür ederiz. Bu çalışma anne ve Çocuk Sağlığı Enstitüsü, ıRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italya (RC20/16) ve Fondazione Cassa di risparmio Trieste 'den R. bulla 'dan hibe tarafından destekleniyordu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 < &mikro; m gözenek filtresiBD Falcon352360
Amfoterisin B çözeltisi (mantar zonu)Sigma-Aldrich 1397-89-3
temel FGFİmmünolojik BilimlerGRF-15595
Kalsiyum KlorürSigma-Aldrich C-4901
Kollajenaz tip IWorthington Biyokimya Şirketi, DBAMX1D12644
D-GlikozSigma-Aldrich 50-99-7
DNaz I Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich 60-00-4
EGFİmmünolojik BilimlerGRF-10544
FAST DiIMoleküler problar, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
Fetal sığır serumuGibco,  Thermo Fisher Scientific10270-106
FibronektinRoche11051407001
ŞişesiCorning430639Steril, havalandırmalı
Gentamisin çözeltisiSigma-Aldrich G1397-10ML
Çile' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) Sigma-Aldrich H6648EDTA, Glikoz, penisilin-streptamisin, gentamisin ve fungizon ile desteklenmiş
Yüksek moleküler ağırlıklı hyaluronik asitProf. Ivan Donati'den
İnsan endotel serumu ücretsiz ortam Gibco,  Thermo Fisher Scientific11111-044EGF ile takviyeli (5  ng/mL), temel FGF (10  ng/mL) ve  % 1 penisilin– streptomisin (Sigma-Aldrich)
Magnezyum KlorürCarlo Erba13446-18-9
Orta 199 Hank' ile s tuzuSigma-Aldrich M7653
Penisilin-StreptomisinSigma-Aldrich P0781
Hızlandırılmış mikroskopi Nikon Görüntüleme Sistemi BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA OkuyucuAkış Laboratuvarları
TripsinSigma-Aldrich T4674
Hücre kültürü için nazik hediye Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Complement Protein C1qHyaluronic AcidCell AdhesionExtracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

İlgili makaleler