Hücre yapışma teşvik içinde tamamlayıcı protein C1q ve Hyalüronik asit arasındaki Interplay değerlendirilmesi

Özet

Tamamlayıcı bileşen C1q, doku mikroortamında yüksek derecede ifade edilen, hücre dışı matriks ile etkileşimde bulunan, Pro-inflamatuar bir molekül. Burada, biz nasıl C1q hyaluronik asit etkileri hücre yapışma bağlı test etmek için bir yöntem tarif.

Özet

Tümör mikroortamın neoplazi büyümesi ve metasrat içinde aktif rol oynadığını giderek ortaya koymuştur. Farklı yollar sayesinde, tümör hücreleri etkili bir şekilde stromal, bağışıklık ve endotel hücreleri uyarıcı faktörler, kemokinler ve sitokinlerin salgılar tarafından işe. Buna göre, bu hücreler, yüksek proliferasyonu ve metastatik yetkinliği sürdürmek için büyüme teşvik sinyalleri, metabolitleri ve ekstrasellüler matris bileşenlerini serbest bırakarak mikroortamın sinyalizasyon özelliklerini değiştirebilir. Bu bağlamda, biz tamamlayıcı bileşen C1q, yüksek ölçüde insan malign tümörlerin bir dizi tarafından yerel olarak ifade, ekstraküler matris hyaluronik asit ile etkileşim üzerine, güçlü insan tümöründen izole primer hücrelerin davranışını etkiler tespit Örnek. Burada, biz nasıl C1q hyaluronik asit (HA) etkileri tümör hücre yapışması bağlı test etmek için bir yöntem açıklamak, gerçekte temel bileşenlerin biyolojik özellikleri (Bu durumda HA) ekstrasellüler matrisin temel bileşenlerinin tümör doğru biyoaktif sinyaller şeklinde olabilir Ilerleme.

Giriş

Tümör mikroçevre (TME), hücre hayatta kalma, büyüme ve istilası için karşı bir niş sağlayabilmesi için kanser gelişimini ve ilerlemesini etkiler. TME 'deki yeni anahtar oyuncularının tanımlanması, hedef terapi için yeni moleküler araçların keşfi için yararlı olabilir. TME, endotel hücreler, fibroblastlar ve bağışıklık sisteminin hücreleri gibi Malign olmayan hücrelerin karmaşık ve dinamik ağını içerir ve bu da collagens, Laminins, fibronektinler dahil olmak üzere çevredeki ekstrelüler matris (ECM) bileşenlerine gömülür. Proteoglikanlar ve hyaluronans. Hem tümör hem de tümör içermeyen hücreler, TME 'nin fiziksel, kimyasal ve sinyalizasyon özelliklerini genel olarak değiştiren sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve inflamatuar ve matris remodeling enzimleriyle ECM bileşenlerini sentezleyen ve salgılar. Bu bileşenler arasında, hyaluronik asit (HA) tümör biyolojisinde önemli bir rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Basit kimyasal bileşimine rağmen, HA, onun HA-bağlayıcı molekülleri ile birlikte (hyalyapışlar), anjiyogenezi modüle edebilir, bağışıklık sistemi yanıt ve ECM bir boyut ve konsantrasyon bağımlı şekilde yeniden modelleme¹.

Tamamlayıcı (C) sistemi de yakın zamanda artan ilgi aldı yerel TME, bir parçasıdır. C sistemi, non-Self-hücrelere, istenmeyen konak elemanları ve patojenlere karşı savunma ilk satırında yer alan çözünür ve membran bağlı proteinleri bir dizi kapsar. İşlevsel olarak, C, doğal ve adaptif sistemlerin iki efektör kollarını doğrudan hücre öldürme ya da bir inflamatuar yanıt²montaj teşvik etmek bağlar. C aktivasyon kanser hücrelerini yok ederek veya onların büyüme inhibe ederek, tümör büyümesini bastırmak, ama giderek bu kronik inflamasyon sürdürülmesi tarafından bir tümör teşvik aktivitesi sahip olabilir açık hale gelmiştir, bir kurulması teşvik immünosupresif çevre, anjiyogenez inducing, ve kansere bağlı sinyalizasyon yolları aktive³. Bu bağlamda, C1q, c sisteminin klasik yolunun ilk tanıma molekülü, C aktivasyonu⁴' ten bağımsız olarak tümör mikroortamındaki önemli fonksiyonları ortaya çıkartmıştır. C1q, anjiyogenezi ve metasjen⁵' e ek olarak kanser hücresi yapışma, göç ve proliferasyon lehine olabilir insan malign tümörlerin bir dizi yerel olarak ifade edilmesi gösterilmiştir. İlginçtir C1q ECM gibi büyük bir kurucu ile etkileşime girer.

Primer kanser hücrelerini tümör kütlesine izole etmek için bir teknik geliştirdik. Ayrıca, biz, özellikle C1q ve yüksek moleküler ağırlık hyaluronik asit arasındaki etkileşimi tümör mikroçevre teşvik edebilir matris oluşturdu. C1q bağlı HA tümör hücrelerinin yapışmasını ikna edebildi.

Protokol

Hastadan gelen doku örnekleri, Italya 'nın Trieste Üniversitesi Hastanesi kurumsal Kurulu tarafından etik hususları onayladıktan sonra bilgilendirilmiş onay sonrasında toplandı.

1. tümör hücre yalıtımı ve Kültür (gün 1)

1. İnsan mezotelyoma hücrelerini MPM katı örneklerden yalıtın. Yaklaşık 2-3 mm² boyutunda parçalar elde etmek ve 0,5 mm CA^{2 +}/mg^{2 +}, 0,5% tripsin ve 50 μg/ml ile desteklenen Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ' den oluşan 5 ml sindirim çözeltisi içinde inkük olan dokuyu bir kesici ile ince bir şekilde kıyma DNase ı, gece 4 °C ' de.
2. Tümör hücresi yalıtımı ve kültürü (2. gün)
   1. Gece inkübasyon sonrası, sindirilmiş dokusu 37 °C ' de 30 dakika boyunca hafifçe sallama ile yerleştirin.
   2. Santrifüjleme üzerine sindirim çözeltisi değiştirin (250 x g) ile 3 mg/ml kolajenaz tipi 1 çözünür 5 ml Orta 199 HBSS ile ve daha fazla inkük 30 dakika için 37 °c hafif sallayarak ile.
   3. Enzimatik reaksiyonu% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek engelleyin. Hücrelerin çoğunun dokudan serbest bırakıldığından emin olmak için 5 mL pipet ile hücreleri çok dikkatlice resuspend. Ardından, hücre süspansiyonunu 100 μm gözenek filtresine göre filtreleyin.
   4. Bir 12,5 cm² Flask ve kültür onları 37 °c ' de insan endotel hücreleri ile serum-serbest Orta (hesf),% 10 FBS ve egf (10 ng/ml), temel fgf (20 ng/ml), ve 1% penisilin-streptomisin ile Takviyeler.
      Not: her 2-3 gün taze orta ile değiştirin.

2. HA kaplama (gün 1)

1. 1 mg/mL⁶konsantrasyonunda çift distile su içinde yüksek moleküler ağırlık HA (1,5 kDa) resuspend.
2. 50, karbonat/bikarbonat tamponunda (0,1 M, pH 9,6), nazik pipetleme ile dilute HA stok çözümüdür.
3. 96-kuyu plakasını, 4 °C ' de gece başına 100 μL dilüt HA stok çözeltisi ile kat.
   Not: hyaluronik asit Profesör Ivan Donati, Yaşam Bilimleri Bölümü, Trieste Üniversitesi⁷bir tür hediye oldu.

3. C1q kaplama (gün 2)

1. Gece kuluçkının ardından, vakum tedavi edilen kuyuları Aspire ve 96-kuyu plakasını aynı zamanda 100 μL, Dulbecco 'nun PBS 'si (dpbs) ile yıkayın.
2. 100 μL dPBS + 0,5% BSA ve 0,7 mM CA²+/mg 2 + ' da 25 μg/ml 'lik bir konsantrasyonda bu proteinlere inkük ederek plastik immobilized-ha ' y a bağlamak için C1q (25 μg/ml veya doz tepkisi denemeleri için farklı konsantrasyonlar) veya BSA (negatif kontrol olarak) izin verin. . Sonra gece 4 °C ' de inkübe.
3. Vakum, kuyuları Aspire ve 100 μL/iyi dpbs ile 96-kuyu plakasını yıkayın.

4. hızlı dıı ile hücre etiketleme

1. 10 μg/mL floresan boya hızlı dıı içeren dPBS 500 μL 'de resuspend 1 x 10⁵ tümör hücreleri. 5 dakika aralıklarından sonra el ile karıştırma, etiketleme için 5% v/v CO₂ kuluçko Içinde 37 °c 15 dakika boyunca inkübe.
   1. Aşırı hızlı dıı kaldırmak için, 10 mL dPBS eklemek, yavaşça yukarı ve aşağı pipet ve 7 dakika için 250 x g Santrifüjü 1 ml insan endotel serum ücretsiz orta içeren hücre pelet 0,1% BSA (hesf + 0,1% BSA).

5. HA/C1q matrisler üzerinde hücre yapışma (gün 1)

1. Vakum, farklı matrisler ile kaplı kuyuları Aspire (kuyular adım 3,2 kaplı).
2. Etiketli hücre süspansiyonunun 100 μL 'ini kaplanmış kuyulara dağıtın ve% 5 v/v CO₂ inkükoplinde 37 °c ' de 35 dakika için plakası kuluçd.
3. Supernatant duman çekiş olmayan-yapışmaz hücreleri çıkarın. % 0,5 BSA, 0,7 mM CA^{2 +} ve 0,7 mm MG^{2 +}içeren dpbs ile bir kez yıkayın_.
4. 10 mm Tris-HCL, pH 7,4 +% 0,1% v/v SDS 200 μL/Well ekleyerek yapışan hücreleri Lyse ve hemen bir floresan okuyucu (544 Nm, emisyon 590 Nm) ile 96-Well plaka okuyun etiket artan sayıda lizis ile oluşturulan bir kalibrasyon eğrisi kullanarak Hücre.

Sonuçlar

HA, tekrarlayan (β, 1-4)-D-glukuronik asit-(β, 1-3)-N-asetil-D-glukolin disakkarid üniteler (Şekil 1B)⁷' den oluşan, negatif olarak şarj edilmiş yüksek molekül ağırlığı polizakkaridin. 96-Well plaka üzerinde ha bağlayıcı oluşumu yanı sıra onun immobilizasyon verimliliği biyotinlenmiş ha yararlanarak test edildi (Bio-ha). 10 μg/mL 'den 1 mg/mL 'ye kadar farklı biyo-HA konsantrasyonları, 100 mM karbonat/bikarbonat-buffer pH 9,6 ' de yeni...

Tartışma

Biz nasıl tamamlayıcı bileşen C1q, hyaluronik asit ile etkileşim, insan tümörü dokularından izole primer hücrelerin davranışını modüle edebiliyoruz araştırmak için kolay bir yöntem açıklanmaktadır. Hem HA hem de C1q, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda, çeşitli hücre biyolojik süreçlerine katılan doku mikroortamında oldukça mevcuttur. Örneğin, C1q plasentanın mikroortamında mevcut olduğu görüldüğü için, plasentasyon⁸' de maternal decidua 'nın ekstrıillous trofoblast istilasını sunar. C1q Ay...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 < &mikro; m gözenek filtresi	BD Falcon	352360
Amfoterisin B çözeltisi (mantar zonu)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
temel FGF	İmmünolojik Bilimler	GRF-15595
Kalsiyum Klorür	Sigma-Aldrich	C-4901
Kollajenaz tip I	Worthington Biyokimya Şirketi, DBA	MX1D12644
D-Glikoz	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNaz I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
EGF	İmmünolojik Bilimler	GRF-10544
FAST DiI	Moleküler problar, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Fetal sığır serumu	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronektin	Roche	11051407001
Şişesi	Corning	430639	Steril, havalandırmalı
Gentamisin çözeltisi	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
Çile' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	EDTA, Glikoz, penisilin-streptamisin, gentamisin ve fungizon ile desteklenmiş
Yüksek moleküler ağırlıklı hyaluronik asit	Prof. Ivan Donati'den
İnsan endotel serumu ücretsiz ortam	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	EGF ile takviyeli (5  ng/mL), temel FGF (10  ng/mL) ve  % 1 penisilin– streptomisin (Sigma-Aldrich)
Magnezyum Klorür	Carlo Erba	13446-18-9
Orta 199 Hank' ile s tuzu	Sigma-Aldrich	M7653
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Aldrich	P0781
Hızlandırılmış mikroskopi	Nikon	Görüntüleme Sistemi BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Okuyucu	Akış Laboratuvarları
Tripsin	Sigma-Aldrich	T4674

Hücre kültürü için nazik hediye Serisi