Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Anirban Paul; Z. Josh Huang

doi:10.3791/58690

Yöntem makalesi

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

DOI:

10.3791/58690

⸱

26 Ekim 2018

Anirban Paul¹ , Z. Josh Huang¹

¹Cold Spring Harbor Laboratory

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı vitro transkripsiyon tabanlı mRNA amplifikasyon yüksek-derinlik tek hücreli RNA sıralama için ardından tek fluorescently etiketli nöronların izole etmek için yordam sıralama kılavuzu açıklanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) şimdi gen ekspresyonu raporlaması için yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Piyasada bulunan tek hücreli RNA-sıralama platformlar ayrım gözetmeksizin tüm giriş hücresi işlemek. Bazen, floresans aktif hücre (FACS) sıralama akıntıya karşı faiz özel olarak etiketlenmiş bir nüfusa izole etmek için kullanılır. Bir FACS önemli ölçüde etiketli kesirli sayıları, giriş hücresi sayısının fazlalığı için ihtiyaç hangi toplamak ve nadir veya seyrek etiketli nöron popülasyonları--dan fare beyin profil oluşturma zordur kısıtlamasıdır. Burada, el ile fluorescently tek neurons taze etiketli seyrek toplama fare beyin dokusu ayrışmış için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlem için esir alma tek etiketli nöronlar yüksek saflıkta ve endojen transkript oranları korur bir vitro amplifikasyon transkripsiyon tabanlı iletişim kuralı ile sonraki entegrasyon sağlar. Biz bireysel mRNA sayar oluşturmak için benzersiz molekül tanımlayıcıları (UMIs) kullanan bir çift doğrusal amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Yüksek derecede gen algılama tek hücre başına amplifikasyon sonuçlarında iki mermi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) transcriptomic çalışmalar dönüştürdü. Büyük ölçekli tek hücreli RNAseq damlacıkları¹^,², havacilik³, nanogrids⁴ve microwells⁵, gibi teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilir iken pek çok yöntem tanımlı hücre tipleri sıralama yapamazsınız genetik olarak kodlanmış fluorophores express. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama hücresini seçin popülasyon yalıtmak için sık sık etiketli hücreleri tek hücre modunda sıralama için kullanılır. Ancak, FACS bazı kısıtlamaları vardır ve titiz örnek işlem adımları gerekt....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları IACUC soğuk Spring Harbor Laboratuvarı, NY (IACUC #16-13-09-8) tarafından onaylanmıştır.

1. Manuel Fluorescently etiketli fare nöronlar sıralama

(Bkz: Malzemeler tablo) cam microcapillaries 10-15 µm çıkış çapı aşağıdaki ayarlara sahip bir kılcal çektirmenin kullanarak çekin: ısı: 508, çekme: boş, vel: boş, zaman: boş.
120-150 cm esnek silikon tüp (~0.8 mm iç çapı) 0.2 µm polivinilidin difluoride (PVDF) membran şırınga filtre ve uygun boru bağlayıcıları kullanarak iki yönlü boru Vana ekleyin.
Soğutulmuş (4 ° C) yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF,....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, GABAergic nöronlar el ile edildi (Şekil 1) sıralanmış ve RNA güçlendirilmiş sonra cDNA Kütüphanesi (Şekil 2) yaptım.. yüksek derinliği⁸' de sıralı. Güçlendirilmiş RNA (aRNA) ürünleri değişmekteydi arasında 200 – 4000 bp boyutunda bir tepe dağıtım biraz üzerinde 500 ile bp (Şekil 3A). Boncuk saf cDNA Kütüphanesi daha fazla boyutu.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıralama iletişim kuralı el ile de seyrek olan nüfus farelerin beyninde etiketli veya aksi takdirde geçerli yüksek üretilen iş hücre kullanarak çalışma mümkün değildir nadir hücre nüfusu temsil eden nöron bir denetimli RNA sıralama için uygundur sıralama ve güçlendirme yöntemleri. FACS için genellikle tabi hücreler kılıf ve örnek satır baskıların ~ 9 – 14 PSI, meme boyutuna bağlı olarak aralığında geçmesi ve olay oranları istenen. Ayrıca, meme üzerine çıkıp, hücreleri sert yüzey koleksiyonu tüp veya kuyu etkisi strese ne.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının vardır bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser NIH (5R01MH094705-04 ve R01MH109665-01 Z.J.H. için) gelen hibe, CSHL Robertson Neuroscience fon (Z.J.H.) ve NARSAD bulunan Bursu (için A.P.) tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası
ERCC RNA Spike-In Kontrol Karışımları	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA parçalanma tamponu	New England Biolabs	Cat # E6105S
RNA MinElute kiti	Qiagen	Cat # 74204
Antarktika fosfataz	New England Biolabs	Kedi # M0289
Poli nükleotid kinaz	New England Biolabs	Kedi # M0201
T4 RNA ligaz2, kesik	New England Biolabs	Kedi # M0242
Ampure Xp manyetik ve nbsp boncuk	Beckman Coulter	Kedi # A63880
SPRIselect boyut seçimi manyetik boncuklar	Thermo Fisher	Kedi # B23317
DL-AP5	Tocris	Kedi # 0105
CNQX	Tocris	Kedi # 1045
TTX	Tocris	Kedi # 1078
Streptomyces griseus'tan Proteaz	Sigma-Aldrich	Kedi # P5147
Mesaj Amp II kiti	Termo Balıkçı Kedi	# AM1751
Karbogen	Airgas	Cat # UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat # 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kiti	Illumina	Cat # RS-200-0012
Biyoanalizör RNA Pico çipi	Agilent	Cat # 5067-1513
Biyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA çipi	Agilent	Cat # 5067-4626
Biyoanalizör 2100	Agilent
DIC optikli floresan ve parlak alan aydınlatmalı diseksiyon mikroskobu. (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Cam mikrokılcal damar: Borosilikat kılcal borular 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, duvar= 0.21 mm, Uzunluk= 150 mm.	Warner aletleri	Model GC100-15, Sipariş # 30-0017
Kılcal pipet çektirme	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratom	Thermo Microm	HM 650V
Vibratom doku soğutma ünitesi	Thermo Microm	CU 65

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryoni....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Floresan aretli N ronlar Manuel H cre Ay klama DIVA Seq Y ntemi Fare Beyin Dokusu Kapiler Mikrodiseksiyon UMI Tabanl Amplifikasyon H cre Ba na Gen Tespiti

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler