Method Article

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

DOI:

10.3791/58697

⸱

January 3rd, 2019

 ,  , 
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun yıllar boyunca, biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü ve hızlı bir şekilde biçimlendirilmiş etkileşim başarılı bir şekilde biyolojik olarak önemli RNA/protein kompleksleri kısmi saflaştırılması için kullanılmıştır. Ancak, bu strateji daha geniş kullanımı sınırlayan bir büyük dezavantaj muzdarip: biotin/streptavidin etkileşimi sadece denaturing de bu nedenle iyileştirmelerden eluted kompleksleri bütünlüğünü bozmaya koşullar altında bölünebilecek onların sonraki fonksiyonel analiz ve/veya diğer yöntemlerle daha fazla arıtma. Buna ek olarak, eluted örnekleri sık sık streptavidin boncuklar, gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından arıtılmış kompleksleri analizini komplike nonspecifically ilişkilendirmek arka plan proteinler ile kontamine. Biotin/streptavidin strateji biotin bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı üzerinden bir RNA substrat eklenen ve streptavidin boncuk üzerinde immobilize kompleksleri seçerek çözüm için eluted bir türevi geliştirdiğimiz bu sınırlamalarını aşmak için bir yerli forma göre uzun dalga UV, arka plan proteinlerin üstündeki bırakarak. Daha uzun RNA yüzeylerde iki grup ile tamamlayıcı oligonükleotid tarafından sağlanabilir, ancak daha kısa RNA bağlama yüzeylerde kimyasal olarak biotin ve kovalent bağlı 5' ucuna RNA, fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ile sentezlenmiş. UV-elüsyon yöntemi bu iki çeşidini histon pre-mRNA'ların 3' sonunda ayırmak U7 snRNP bağımlı işleme kompleksleri arınma için test edildi ve olumlu diğerine daha önce karşılaştırmak için arıtma yöntemleri geliştirilmiş ispatlayamadılar. UV eluted örnekleri büyük protein kirletici içermez ve fonksiyonel deneyleri ve kütle spektrometresi ile doğrudan analiz için uygun U7 snRNP kolayca saptanabilir miktarda yer. Açıklanan yöntemi kolayca diğer RNA bağlama kompleksleri arıtma için uyarlanmış ve DNA-spesifik proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri arındırmak için tek ve çift iplikçikli DNA bağlayıcı siteleri ile birlikte kullanılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotlarda RNA polimeraz II tarafından oluşturulan mRNA öncüleri (pre-mRNA) çekirdek birkaç olgunlaşma olayları sitoplazmada protein sentezi için tamamen işlevsel mRNA şablonlar olmadan önce tabi. Bu olaylar, 3' uç işleme biridir. Pre-mRNA'ların büyük çoğunluğu için 3' uç işleme için Poliadenilasyon birleştiğinde bölünme içerir. Bu iki aşamalı reaksiyon nispeten bol kompleksi tarafından katalizlenir 15'ten fazla protein1/ oluşan. Hayvan çoğaltma bağımlı histon pre-mRNA'ların 3' sonunda göre U7 snRNP, düşük bereket U7 snRNA ~ 60 nukleotid ve birden fazla protein2,3 oluşan karmaşık kili....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. yüzey hazırlama

Not: RNA yüzeylerde ~ 65 nükleotit kimyasal olarak biotin (B) ve kovalent bağlı RNA 5' ucuna (CIS yapılandırma) (birlikte fotoğraf yarilabilir biotin veya pcB olarak anılacaktır) fotoğraf yarilabilir (pc) bağlayıcı ile sentezlenmiş daha kısa. Önemli ölçüde uzun bağlayıcı siteleri içeren RNA yüzeylerde T7 (veya SP6) transkripsiyon tarafından oluşturulan vitro olmak gerekir ve daha sonra pcB yan vasıl belgili tanımlık son 5' (trans içeren bir kısa tamamlayıcı adaptör oligonükleotid ona komplementer yapılandırma) (Şekil 1).

  1. Az ~ 65 nükleotit ile oluşan bağlay....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UV-elüsyon yöntemi iki kimyasal olarak sentezlenmiş RNA yüzeylerde kovalent bağlı 5' sonunda pcB yan (CIS yapılandırma) ile test edildi: pcB-SL (Şekil 1) ve pcB-dH3/5 m RNA'ların (Şekil 2). 31-nükleotit pcB-SL RNA bir 5-nükleotit tek telli kuyruk tarafından takip bir sap-ilmik yapısını içerir ve kendi sırasını 3' sonuna olgun histon aynıdır mRNA (i.e., bölünme histon pre-mRNA göre U7 snRNP sonra). İki protein me.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan yöntem basit ve bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ekleme yanı sıra ve UV-elüsyon adım biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim yararlanmak sık kullanılan yöntemlerden farklı değildir. UV-elüsyon adım çok etkilidir, genellikle immobilize RNA % 75'den fazla serbest ve streptavidin boncuklar, boncuklar için özel olarak sigara bağlayan proteinler yüksek bir arka plan geride bırakarak gelen proteinler ilişkili. Bu arka plan ortadan kaldırarak, UV-elüsyon adım gümüş boyama, kütle spektrometr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim iş için bizim meslektaşları ve işbirlikçileri katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIH tarafından desteklenen GM 29832 verin.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Streptavidin-AgaroseSigmaS1638-5ML
Yüksek yoğunluklu, uzun dalga UV lambasıCole-ParmerUX-97600-00
Yedek ampulCole-ParmerUX-97600-19100 Watt Cıva H44GS-100M ampul 366 nm UV ışığı yayan (Sylvania)
cisDharmacon (Lafayette, CO) veya Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)Dharmacon
Beckman GH 3.8 salıncak kova rotorundaBeckman
RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemleri (T7 polimeraz)PromegaP1300
RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemleri (SP6 polimeraz)PromegaP1280
Pierce Gümüş Leke KitiThermoFisher Bilimsel24612
bir alıntı isteyin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Protein Complex PurificationBiotin Streptavidin InteractionPhoto cleavable LinkerUV Elution MethodStreptavidin Agarose BeadsMass Spectrometry AnalysisSilver StainingHistone Pre mRNA ProcessingU7 snRNP ComplexSingle step Purification

Related Articles