Method Article

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

DOI:

10.3791/58697

⸱

January 3rd, 2019

 ,  , 
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun yıllar boyunca, biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü ve hızlı bir şekilde biçimlendirilmiş etkileşim başarılı bir şekilde biyolojik olarak önemli RNA/protein kompleksleri kısmi saflaştırılması için kullanılmıştır. Ancak, bu strateji daha geniş kullanımı sınırlayan bir büyük dezavantaj muzdarip: biotin/streptavidin etkileşimi sadece denaturing de bu nedenle iyileştirmelerden eluted kompleksleri bütünlüğünü bozmaya koşullar altında bölünebilecek onların sonraki fonksiyonel analiz ve/veya diğer yöntemlerle daha fazla arıtma. Buna ek olarak, eluted örnekleri sık sık streptavidin boncuklar, gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından arıtılmış kompleksleri analizini komplike nonspecifically ilişkilendirmek arka plan proteinler ile kontamine. Biotin/streptavidin strateji biotin bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı üzerinden bir RNA substrat eklenen ve streptavidin boncuk üzerinde immobilize kompleksleri seçerek çözüm için eluted bir türevi geliştirdiğimiz bu sınırlamalarını aşmak için bir yerli forma göre uzun dalga UV, arka plan proteinlerin üstündeki bırakarak. Daha uzun RNA yüzeylerde iki grup ile tamamlayıcı oligonükleotid tarafından sağlanabilir, ancak daha kısa RNA bağlama yüzeylerde kimyasal olarak biotin ve kovalent bağlı 5' ucuna RNA, fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ile sentezlenmiş. UV-elüsyon yöntemi bu iki çeşidini histon pre-mRNA'ların 3' sonunda ayırmak U7 snRNP bağımlı işleme kompleksleri arınma için test edildi ve olumlu diğerine daha önce karşılaştırmak için arıtma yöntemleri geliştirilmiş ispatlayamadılar. UV eluted örnekleri büyük protein kirletici içermez ve fonksiyonel deneyleri ve kütle spektrometresi ile doğrudan analiz için uygun U7 snRNP kolayca saptanabilir miktarda yer. Açıklanan yöntemi kolayca diğer RNA bağlama kompleksleri arıtma için uyarlanmış ve DNA-spesifik proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri arındırmak için tek ve çift iplikçikli DNA bağlayıcı siteleri ile birlikte kullanılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotlarda RNA polimeraz II tarafından oluşturulan mRNA öncüleri (pre-mRNA) çekirdek birkaç olgunlaşma olayları sitoplazmada protein sentezi için tamamen işlevsel mRNA şablonlar olmadan önce tabi. Bu olaylar, 3' uç işleme biridir. Pre-mRNA'ların büyük çoğunluğu için 3' uç işleme için Poliadenilasyon birleştiğinde bölünme içerir. Bu iki aşamalı reaksiyon nispeten bol kompleksi tarafından katalizlenir 15'ten fazla protein1/ oluşan. Hayvan çoğaltma bağımlı histon pre-mRNA'ların 3' sonunda göre U7 snRNP, düşük bereket U7 snRNA ~ 60 nukleotid ve birden fazla protein2,3 oluşan karmaşık kilit rol oynadı farklı bir mekanizma tarafından işlenir . U7 snRNA baz çifti ile histon pre-mRNA ve U7 snRNP alt birimleri biri belirli bir sırada tromboksan bölünme tepki, Olgun histon üreten mRNA olmadan bir poli(a) kuyruğu. histon pre-mRNA son işlem 3' de sap-ilmik bağlayıcı Protein (korunmuş bir sap-ilmik bulunan bağlayan SLBP), gerektirdiği bölünme sitesinin ters yönde ve U7 snRNP substrat2,3istihdamı artırır. U7 snRNP tek tek bileşenlerini tanımlayan amaçlayan çalışmalar U7 snRNP hayvan hücrelerinde düşük konsantrasyon ve ayırmak veya kısmi proteolizis kullanarak bir sonucu olarak arıtma sırasında geçmesi için karmaşık eğilimi nedeniyle zorlu olmuştur Hafif Deterjan4,5,6, yüksek tuz yıkar ve/veya birden fazla kromatografik adımları7,8,9

Son zamanlarda, U7-bağımlı işleme makineleri kompozisyonu belirlemek için kısa bir parçası histon pre-mRNA içeren biotin 3' ya veya 5' nükleer bir özü ile inkübe ve birleştirilmiş kompleksleri streptavidin kaplı üzerinde ele geçirildi Özel boncuk5,6,10. Biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim nedeniyle streptavidin boncuk üzerinde immobilize proteinler koşullar altında denaturing içinde SDS kaynatılarak eluted ve gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından analiz etti. Bu basit yaklaşım U7 snRNP bileşenleri bir dizi tespit ederken, genellikle çok sayıda potansiyel olarak bazı bileşenleri maskeleme streptavidin boncuk için nonspecifically bağlı arka plan proteinler ile kirlenmiş nispeten ham örnekleri vermiştir işleme makineleri ve gümüş onların algılamayı engelliyor jelleri5,6,10lekeli. Önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda herhangi bir fonksiyonel çalışmalar izole malzeme ve homojenliği için daha fazla onun arıtma ile ek yöntemler tarafından durdurulmasını emretti.

Biotin/streptavidin etkileşimi, etkileşimi de zayıflamaya veya kimyasal olarak yarilabilir spacer kolundan sağlamak için tasarlanmış olan çoğu hemen hemen geri dönüşü olmayan doğa yönelik olarak zaman içinde değişiklikler bir dizi teklif edildi biotin içeren reaktifler11,12. Tüm bu değişiklikler olumsuz önemli ölçüde bütünlüğü veya etkinlik arıtılmış proteinlerin tehlikeye elüsyon adımı sırasında Yöntem ve/veya sık sık gerekli fizyolojik olmayan şartlarda verimliliğini azaltmak oldu.

Burada, içsel sorun gidermek için farklı bir yaklaşım tarif RNA kullanarak biotin/streptavidin stratejisinin yüzeylerde içinde biotin kovalent bağlı 5' üzerinden bir fotoğraf yarilabilir 1-(2-nitrophenyl) son olduğunu etil yan duyarlı uzun dalga UV13,14. Drosophila bu yaklaşımdan sınırlayıcı U7-bağımlı işleme makineleri arıtma için test ettik ve15memeli nükleer ayıklar. Histon pre-mRNA içeren biotin kısa kuluçka nükleer bir özü ile fotoğraf yarilabilir bağlayıcı, birleştirilmiş işlem kompleksleri streptavidin boncuk üzerinde immobilize, iyice yıkanmış ve yavaşça bir yerli çözüm için serbest form tarafından ~ 360 nm UV ışığa maruz kalma. UV-elüsyon çok verimli, hızlı ve doğru sözlü, U7 snRNP özü15kadar az 100 µL boyama gümüş tarafından bileşenlerinden görselleştirmek için yeterli miktarda verimli yöntemdir. UV eluted ücretsiz arka plan proteinlerin ve doğrudan kütle spektrometresi analizi, ek arıtma adımları ve enzimatik deneyleri için uygun bir malzemedir. Yöntemin kısa RNA bağlayıcı siteleri gerektiren diğer RNA/protein kompleksleri arıtma için kabul edilebilir. Biotin ve fotoğraf yarilabilir bağlayıcı da kovalent için tek - ve çift iplikçikli DNA, potansiyel olarak çeşitli DNA/protein kompleksleri arıtma için UV-elüsyon yöntemi uzanan iliştirilebilir.

Kovalent içeren RNA yüzeylerde kimyasal sentez biotin bağlı ve fotoğraf yarilabilir bağlayıcı pahalı ve verimsiz önemli ölçüde uzun serileri için sadece ~ 65 nükleotit, fazla olamaz sıralarıyla pratik oluyor. Bu sorunu çözmek için Ayrıca daha fazla RNA bağlayıcı hedefler için uygun olan alternatif bir yaklaşım geliştirmiştir. Bu yaklaşımda, RNA herhangi bir uzunluk ve nükleotid sırası T7 veya SP6 transkripsiyon tarafından oluşturulan vitro olduğunu ve kısa bir tamamlayıcı oligonükleotid komplementer biotin ve sonunda 5' (trans fotoğraf yarilabilir bağlayıcı içeren yapılandırma). Sonuç çift yönlü daha sonra bireysel proteinler veya makromoleküllerin kompleksleri streptavidin boncuk kovalent bağlı fotoğraf yarilabilir biotin içeren RNA yüzeyler için açıklanan aynı protokol sonrası üzerinde arındırmak için kullanılır (CIS yapılandırma). Bu değişiklik ile fotoğraf yarilabilir biotin, nükleotit, UV-elüsyon yöntemi, bir geniş aralığı RNA/protein arıtma uzanan yüzlerce içeren oluşturulan vitro tutanaklar ile birlikte kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. yüzey hazırlama

Not: RNA yüzeylerde ~ 65 nükleotit kimyasal olarak biotin (B) ve kovalent bağlı RNA 5' ucuna (CIS yapılandırma) (birlikte fotoğraf yarilabilir biotin veya pcB olarak anılacaktır) fotoğraf yarilabilir (pc) bağlayıcı ile sentezlenmiş daha kısa. Önemli ölçüde uzun bağlayıcı siteleri içeren RNA yüzeylerde T7 (veya SP6) transkripsiyon tarafından oluşturulan vitro olmak gerekir ve daha sonra pcB yan vasıl belgili tanımlık son 5' (trans içeren bir kısa tamamlayıcı adaptör oligonükleotid ona komplementer yapılandırma) (Şekil 1).

  1. Az ~ 65 nükleotit ile oluşan bağlayıcı siteleri kullanmak için ticari üretici (Tablo reçetesi) kimyasal olarak ilgi RNA sentez için pcB ile kovalent RNA 5' sonuna kadar (Şekil 1A ve Şekil 2A) bağlı. İstenen konsantrasyonu elde etmek ve küçük aliquots-80 ° C'de depolamak için steril su dağıtılması
  2. Bağlayıcı siteleri için önemli ölçüde ~ 65 nükleotit, formu daha uzun bir vitro kısmi bir dubleks RNA faiz ve pcB yan vasıl belgili tanımlık son 5' (Şekil 3A) içeren bir tamamlayıcı adaptör oligonükleotid oluşturulan.
    1. T7 transkripsiyon Doğrusallaştırılmış plazmid DNA ya da uygun bir PCR şablon RNA ile 3' sonunda ~ 20-nükleotid rasgele dizisi tarafından genişletilmiş ilgi bağlama sitesi oluşturmak için gerçekleştirin.
    2. Ticari üretici (Tablo reçetesi) kimyasal olarak 3' uzantı T7 tarafından oluşturulan RNA olarak tamamlayıcı ve pcB (Şekil 3A) 5' sonunda içeren bir adaptör oligonükleotid sentezlemek için kullanın.
      Not: Sonunda 5' potansiyel steric engel ilişkili karmaşık ve streptavidin boncuklar arasında azaltmak için oligonükleotid iki 18-atom çubukları ve 2-3 sigara-tamamlayıcı nükleotit yerleştirilebilir. Bu da oligonükleotid düzgün bir 2' O-metil grubu çift yönlü gücünü artırmak için ve çeşitli enzimler karşı direnç sağlamak üzere ile olarak tercih edilir.
    3. PcB adaptör oligonükleotid için T7 tarafından oluşturulan RNA tavlamak.
      1. Tüp bağlama arabellek ile aşağıdaki oluşturma içeren 100 µL Mix 20 pmol RNA'ın ve 1,5 ml adaptör pcB oligonükleotid (1:5 molar oranı) 100 pmol: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, % 15 gliserol, 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA).
        Not: Bir çift yönlü tavlama tepki olarak kullanılan çoğu (hepsi değilse de) pre-mRNA substrat ile birlikte oluşturmak yeterli adaptör oligonükleotid az miktarda kullanılması önemlidir. Bu uygun RNA yüzey vasıl belgili tanımlık son 5' 32P, artan adaptör oligonükleotid kullanımının tutarları ile etiketlenmiş substrat tavlama ile etiketleme tarafından çeşitli koşullar ve tutma izleme arabellek tespit edilemedi streptavidin boncuk boncuk bağlama arabellek ile birkaç yıkamadan sonra radyoaktif işaretimle.
      2. Tüp 5 min için kaynar suda koyun.
      3. Su oda sıcaklığında soğumasını sağlar.

2. karmaşık derleme

  1. Bir fare nükleer özü (veya seçtiğiniz başka bir özü) 1 mL 80 mM EDTA pH 8 son konsantrasyonu hulâsa içinde var olan belirsiz metal bağlı enzimler engellemek için 10 mm ile ek.
    Not: Bu bağlama arabellek olarak bu kompozisyon aynı özü arabellekte ayarlayarak neden olur (bkz. Adım 1.2.3.1). EDTA histon pre-mRNA'ların işlenmesi vitro etkilemez ama proteinler veya magnezyum bağımlı bir şekilde bir araya protein kompleksleri arındırıcı zararlı olabilir. Bu gibi durumlarda, EDTA kaçınılmalıdır.
  2. 5-10 pmol pcB yan CIS içinde tagged RNA substrat olarak ekleyin (bkz. Adım 1.1) veya trans (bkz. Adım 1.2.3.3) 10 mM EDTA içeren ekstresinin 1 ml.
    Not: RNA miktarı bir dizi deneme deney dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Belki de ters, nonspesifik RNA proteinler arka plan belirli proteinlerin verim üzerinde herhangi bir etkisi kalmadan artan önemli bir sınırlayıcı kompleks arıtma çok fazla RNA substrat kullanarak.
  3. RNA substrat 5 min buz üzerinde zaman zaman örnek karıştırma için özü ile kuluçkaya.
    Not: Hem zaman ve sıcaklık, kuluçka ampirik olarak kurulacak gerekir ve önemli ölçüde, RNA/protein kompleksi özel niteliğine bağlı olarak değişebilir.
  4. Herhangi bir potansiyel precipitates kaldırmak ve dikkatle süpernatant Pelet aktarma kaçınarak toplamak için 10.000 x g, 10 min için önceden soğutulmuş bir microcentrifuge kuluçka karışımı spin.

3. RNA/protein kompleksleri Streptavidin boncuk üzerinde immobilizasyon.

  1. ~ 100 µL streptavidin özel boncuk süspansiyon, ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) 1,5 mL tüp aktarmak ve bağlama arabellek (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, % 15 gliserol, 10 mM EDTA) ile hacmi artar.
    Not: Bu arabellek aynı kompozisyon tavlama karışımı ve karmaşık derleme (adım 2.1) için kullanılan özü bu kadar olmalıdır.
  2. 2-3 dk 25 x g de iplik tarafından tüpün dibinde boncuk toplamak ve süpernatant Aspire edin.
  3. 2 - 3 kez aynı çamaşır/iplik yordamı yineleyin boncuk bağlama arabellek ile equilibrate için.
    Not: Bu adımın sonunda boncuklar Pelet hacmi olmalıdır ~ 30 µL.
  4. Montajı karmaşık (adım 2.4) içeren süpernatant dengelenmiş streptavidin özel boncuk üzerinde yük.
  5. 4 ° C'de RNA ve ilişkili kompleksleri boncukları üzerinde hareketsiz için 1 h döndürün.
  6. 2-3 dk 25 x g de iplik tarafından tüpün dibinde boncuk toplamak.
    Not: bir salıncak rotor dışarı açısal rotor tüpte tarafına uygun eğilimi varsa boncuk önemli kaybı önlemek için kullanın.
  7. Süpernatant Aspire edin ve boncuk iki kez aynı aralıklarla koşullar kullanarak bağlama arabellek 1 mL ile durulayın.
  8. Bağlama arabellek 1 mL ekleyin ve örnek 4 ° C'de 1 h döndürün
    Not: yüzey üzerinde oluşan karmaşık ayırmak eğilimi varsa bu adımı kısaltılmış.
  9. Spin aşağı 2-3 dk 25 x g, boncuk, arabellek 1 mL ekleyin ve süspansiyon için yeni bir tüp transfer.
  10. İçin ek bir 1 saat veya daha kısa, karmaşık istikrarlı değilse döndürmek, 2-3 dk 25 x g de spin aşağı ve bağlama arabellek 200 µL 500 µL tüpte boncuk aktarmak.

4. UV-elüsyon.

  1. Yüksek yoğunluklu UV lambası tam parlaklık ulaşmadan önce 5-10 dk için 365 nm UV ışık yayan açın.
    Not: Bu başında UV emisyon radyoterapi maksimum enerji elde etmek için önemlidir.
  2. Sıkıca paketlenmiş buz ile Petri kabına (100 mm x 15 mm) alt doldurmak ve çanak'ın kapağı yığını.
  3. Kısaca girdap immobilize kompleksi içeren tüp yere yatay olarak buz ve kapak üzerinde önceden ısıtılmış lambalı sağlanması örnek ampul ve yüzey 2-3 cm mesafe içinde yer alır.
    Not: mesafe çok büyükse, ek Petri yemekler veya uygun diğer nesneleri ampul için örnek daha yakın getirmek için kullanın.
  4. Toplam 30 dk, sık sık ters çevirme ve vortexing için tek tip süspansiyon maruz UV sağlamak ve aşırı ısınmayı önlemek için tüp ışınlatayım.
    Not: ek soğutma sağlamak için UV-elüsyon adım soğuk bir odada yürütülen olabilir. Bir petri aşırı buz erime durumunda taze buz ile geçin.
  5. Spin aşağı 2-3 dk 25 x g de boncuk ve süpernatant toplamak.
  6. Aynı koşul kullanma süpernatant yeniden spin ve süpernatant toplamak.
    Not: alt kısmında kalan boncuk aktarılmasını önlemek için az miktarda süpernatant bırak.

5. numune analizine gümüş boyama tarafından kütle spektrometresi tarafından takip.

  1. Kullanım SDS/polyacrylamide jel elektroforez UV eluted süpernatant bir kısmını ve UV elüsyon takip boncuk artan malzeme aynı kısmını ayırmak için.
    Not: Analiz de bir aliquot örnek UV-elüsyon önce geri boncuk içerebilir.
  2. Ayrılmış proteinlerin boyama seti piyasada bulunan gümüş kullanarak içeren jel leke.
  3. UV-elüsyon verimliliğini proteinlerin süpernatant UV eluted ve UV-ışınlama takip boncuk kalanların mevcut yoğunluklarda karşılaştırarak değerlendirin.
  4. Protein bantları ilgi tüketim ve kütle spektrometresi tarafından standart protokolleri10,15kullanarak kimliklerini belirlemek.

6. UV eluted örnek kütle spektrometresi tarafından küresel analizi.

  1. Doğrudan UV eluted süpernatant bir kısmını arıtılmış malzemenin tüm Proteom tarafsız bir şekilde belirlemek için kütle spektrometresi tarafından analiz.
    Not: Bu standart kütle spektrometresi iletişim kuralları oluştur peptidler10,15kimliğini belirlemek için tarafından takip tripsin ile arıtılmış örnekleri çözüm tedavi ile yapılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UV-elüsyon yöntemi iki kimyasal olarak sentezlenmiş RNA yüzeylerde kovalent bağlı 5' sonunda pcB yan (CIS yapılandırma) ile test edildi: pcB-SL (Şekil 1) ve pcB-dH3/5 m RNA'ların (Şekil 2). 31-nükleotit pcB-SL RNA bir 5-nükleotit tek telli kuyruk tarafından takip bir sap-ilmik yapısını içerir ve kendi sırasını 3' sonuna olgun histon aynıdır mRNA (i.e., bölünme histon pre-mRNA göre U7 snRNP sonra). İki protein me...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan yöntem basit ve bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ekleme yanı sıra ve UV-elüsyon adım biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim yararlanmak sık kullanılan yöntemlerden farklı değildir. UV-elüsyon adım çok etkilidir, genellikle immobilize RNA % 75'den fazla serbest ve streptavidin boncuklar, boncuklar için özel olarak sigara bağlayan proteinler yüksek bir arka plan geride bırakarak gelen proteinler ilişkili. Bu arka plan ortadan kaldırarak, UV-elüsyon adım gümüş boyama, kütle spektrometr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim iş için bizim meslektaşları ve işbirlikçileri katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIH tarafından desteklenen GM 29832 verin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Streptavidin-AgaroseSigmaS1638-5ML
Yüksek yoğunluklu, uzun dalga UV lambasıCole-ParmerUX-97600-00
Yedek ampulCole-ParmerUX-97600-19100 Watt Cıva H44GS-100M ampul 366 nm UV ışığı yayan (Sylvania)
cisDharmacon (Lafayette, CO) veya Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)Dharmacon
Beckman GH 3.8 salıncak kova rotorundaBeckman
RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemleri (T7 polimeraz)PromegaP1300
RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemleri (SP6 polimeraz)PromegaP1280
Pierce Gümüş Leke KitiThermoFisher Bilimsel24612
bir alıntı isteyin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Protein Complex PurificationBiotin Streptavidin InteractionPhoto cleavable LinkerUV Elution MethodStreptavidin Agarose BeadsMass Spectrometry AnalysisSilver StainingHistone Pre mRNA ProcessingU7 snRNP ComplexSingle step Purification

Related Articles