Method Article

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

DOI:

10.3791/58731

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVs), exosomes, dahil olmak üzere özel membranöz nano ölçekli veziküller yapısal birçok hücre türlerinden serbest bırakılır ve hücre-hücre iletişim ve çeşitli bir yelpazede düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır vücut sıvıları bulundu vardır biyolojik süreçleri. EVs karakterizasyonu için birçok farklı yöntem tarif edilmiştir. Ancak, bu yöntemlerin çoğu hazırlanması ve karakterizasyonu örnekleri çok zaman alan, ya da ilgi ve ayrık eksikliği nedeniyle kendi küçük boyutu nedeniyle belirli işaretleri analiz son derece zordur bu dezavantajı var nüfus. Önemli ölçüde son on yıl içinde gelişmiş yöntemlerle EVs çözümlenmesi için orada iken hala tek EVs. karakterizasyonu için standart bir yöntemi yoktur Burada, floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile tek EVs karakterizasyonu için yarı otomatik bir yöntem gösterilmektedir. Sunulan protokolü bu alanda pek çok araştırmacı ortak sorunu giderir ve hızlı yalıtım EVs ve PKH67, bir genel hücre zarı bağlayıcı yanı sıra belirli yüzey işaretleyicileri böyle karakterizasyonu için eksiksiz iş akışı sağlar CD63, CD9, vimentin ve ilişkili lizozomal membran proteini 1 (lamba-1). Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik, yüksek düzeyde Western Blot gibi diğer yöntemler tarafından onaylandı olarak gösterir. Yapılan deneylerde, sadece insan serum örnekleri izole EVs kullanılan, ancak bu yöntem aynı zamanda plazma veya diğer vücut sıvıları için uygundur ve EVs karakterizasyonu hücre kültür supernatants üzerinden için ayarlanabilir. Ne olursa olsun gelecek ilerleme EV Biyoloji araştırma burada sunulan Protokolü belirli işaretleri ile hızlı tek EVs karakterizasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EVs), exosomes, dahil olmak üzere belirli birleşimleri lipidler, yapışma ve hücreler arası sinyal molekülleri yanı sıra gibi diğer fonksiyonel sitozolik bileşenleri içeren özel membranöz nano ölçekli veziküller (20-150 nm) vardır mikroRNA (miRNA) ve mRNA ve hücre-hücre iletişim1,2düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. EVs onların ortamında birçok farklı hücre tipleri, Örneğin, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve tümör hücreleri serbest bırakılır ve vücut sıvıları serum meni, idrar, anne sütü, tükürük veya beyin omurilik sıvısı3, gibi algılandı 4. artan sayıda çalışmalar vurgulayın EVs çeşitli katkı çeşitli hastalıkların erken tanı ve/veya hastalık ilerlemesi5,6tahmin için potansiyel biyolojik olarak. Exosomes kez onlar7türetmek hücre türü ne olursa olsun ile özellikle ilişkili olan moleküller varlığı ile açıklanmıştır. Örneğin, exosomes farklı tetraspanins (CD9, CD63, CD81) içeren, Binbaşı MHC kompleksi sınıf ben (MHC ı) molekülleri, çeşitli transmembran proteinler, tipik sitozolik protein (tübülin ve aktin), moleküller multivesicular vücut (dahil MVB) Dipnotlar (TSG101 ve alix), Isı şok proteinleri (HSP 70 ve HSP 90) ve katılmak proteinler sinyal iletim (protein kinaz)8.

Birçok farklı yöntem EVs9karakterizasyonu için tarif edilmistir. Akış Sitometresi10scanning elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM)11, EV çözümlemesi için kullanılan en yaygın ve yaygın olarak karşılaşılan bazı yöntemler vardır. Best-established ve yaygın olarak kullanılan EV içeriğinin biyokimyasal karakterizasyonu için Western blot12,13yöntemidir. Tüm boyutu yelpazesinde EVs tespiti için SEM ve TEM izin verirken, belirli yüzey proteinleri çok sınırlı tanımlaması bu yöntemlerin belirli bir dezavantajdır. Buna ek olarak, akış sitometresi belirli EV yüzey işaretleyicileri tanımlanması için güçlü bir araçtır, ancak bu yöntem eşiğinde EVs analiz 500'büyük boyutta sınırlar nm. Bu nedenle, izole EVs analizi belirli yüzey işaretleyicileri tespiti ile Şu anda herhangi bir bu üç köklü Yöntem erişilebilir değil. Görselleştirme ve EVs, nanopartikül izleme analizi (NTA)14analizi için başka bir son derece hassas yöntemi daha önce açıkladığımız. Kısaca, bu yöntem iki farklı fiziksel prensipleri birleştirir. İlk olarak, parçacıklar ışık lazer ışını ile ışınlanmış ve Albert hareket bilinen ikinci ilke difüzyon sıvı süspansiyon farklı parçacıkların büyüklükleri için ters orantılı olduğunu ima dağılım. Sıvı örnekleri için yarı otomatik masaüstü nanopartikül çözümleme araç nerede dağınık ışık saçılan tek dijital görüntü kaydedilir analyzer bir yazılım tabanlı analiz ile izleme parçacık oluşur. Parçacıklar ve parçacıkların hareketi tarafından lazer saçılma mikroskop bir video kamera ile tespit edilir. Optik eksen yatay ve örnek ile dolu hücre kanal içine odaklanmış iken lazer ışını dikey aydınlatmaktadır. Dağınık ışık noktalar ve araziler ve onların hareket hızını tarafından sağlanan veri toplam parçacık sayısı ve büyüklüğü dağılımı tayini etkinleştirin. Lazer ışınlama sonra parçacıkları olan ışık, dağılım bir dijital video kamera ile tarafından mikroskop14kaydedildi. İlerleme bizim eski yöntem lazer arasında 500 nm uzun dalga-pas (HS) kesme filtre ekleme olduğunu (dalga boyu 488 nm) ve floresan etiketli parçacıkların (Şekil 1) doğrudan çözümleme sağlar hücre kanal. Bizim Protokolü tek EVs, Örneğin, ebeveyn kökenlerine göre hızlı bir karakterizasyonu için birçok Araştırmacılar bu alandaki talep ortak adresleri. Bu protokol için floresans tabanlı nano tanecikleri izleme analizi ile EVs insan tam kan üzerinden hızlı yalıtım ve belirli işaretleri hızlı karakterizasyonu için tam iş akışı açıklanmaktadır. EVs PKH67, genel hücre zarı bağlayıcı yanı sıra belirli exosomal işaretleri, Örneğin, CD63, CD9, ve vimentin boyama tarafından tespit edilebilir. Bizim iletişim kuralı EDTA ve citrated plazma, aynı zamanda diğer vücut sıvıları ve hücre kültür supernatants için uygundur.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düsseldorf Üniversitesi Kurumsal Etik Kurulu Bu çalışmada sunulan deneyler onayladı (referans numarası: 3381).

1. EV izolasyon insan tam kan

  1. EVs eksozom yağış çözüm ile izole et.
    1. 2 mL tüpler (SST) iz yolu ile serum ayıran insan bütün kan toplamak ve koagülasyon tamamlanana kadar 15 dakika oda sıcaklığında (RT) tüp kuluçkaya.
    2. SST 1.700 x g RT serum ayrı hücreler ve 1 mL serum 1,5 mL tepki tüp aktarmak için 10 min için de santrifüj kapasitesi. Trombosit açısından zengin plazma (PRP) santrifüj kapasitesi 3000 x g 15dk 4 ° C'de trombosit kaldırmak ve yeni bir 1,5 mL tepki tüp 100 μL trombosit-yoksul plazma (PPP) aktarmak için de.
    3. Ya yağış çözüm (4 parça PPP, 1 ölçü eksozom yağış çözüm) ve girdap 25 µL iyice ekleyin. Buz üzerinde 30 dk için örnek kuluçkaya. Tüp dik tutmak ve döndürmek veya tüp kuluçka döneminde karıştırın.
    4. 1500 x g 4 ° C'de EVs cips için 30 dk için de örnek santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sonra EVs bej veya beyaz Pelet geminin alt kısmında görünür. Süpernatant Aspire edin ve 1.500 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi
    5. Çıkarmak tüm izini sürmek-sıvı ve Pelet fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 100 µL içinde sık sık yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma. Ne zaman Analizi hemen gerçekleştirilmez EV süspansiyon-80 ° C'de depolayın.
      Not: EVs plazma izole zaman, fibrinojen ve fibrin verimli kurtarma engelleyebilir ve resuspension daha ağır ve daha fazla zaman alır.
  2. EVs ultrasantrifüj ile izole et.
    1. (TLA-55 sabit-açılı) önceden soğutulmuş rotor buzdolabı ve ultracentrifuge kullanmadan önce soğumasını al.
    2. PPP (1.1 adımda hazırlanan) 1,25 mL kap ile uygun 1,5 mL ultrasantrifüj tüp transfer ve 110.000 x g 4 ° C'de 90 dk da örneğine santrifüj kapasitesi Rotor yükleme başlamadan önce dengelenir emin olun.
    3. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve yer tüp başaşağı 2 dakika süreyle bir kağıt havlu üzerinde Pelet PBS 500 μL içinde yeniden askıya alma ve 110.000 x g 4 ° C'de 90 dk da örneğine santrifüj kapasitesi
    4. Süpernatant Aspire edin ve Pelet PBS 50 μL içinde yeniden askıya alma.
      Not: sadece rotor ve kullanılmakta olan ultracentrifuge için tasarlanmış aksesuarları kullanın. Rotor tüplerde tüpler gücü arasında birçok düzeyinde değişiklik yapabileceğiniz için su kullanarak gerçekleştirilmediğinin.

2. boyama örnekleri

  1. Örnekleri ile PKH67 leke.
    1. Boyama çözüm 50 μL Dilüent c (kit ile birlikte) PKH67 ethanolic boya çözüm 1 μL ekleyerek bir 1,5 mL tepki tüp ve karışımı iyice hazır olun.
    2. İyice karıştırın ve karanlıkta RT, 5 min için kuluçkaya boyama çözüm 10 μL (1.1 adımda hazırlanan) EV süspansiyon tepki tüp için 20 μL transfer.
    3. 15 mL tepki tüp içinde 2.5 mL distile su ile lekeli EV süspansiyon 50 μL sulandırmak, iyice karıştırın ve bu son süspansiyon partikül ölçüm için kullanın.
      Not: diğer seyrelticiler (Örneğin, PBS) ölçüm zarar olabilir çünkü bu su için EV süspansiyon, eritici kullanmak önemlidir. Kullanarak EV-süspansiyon depolandıklarında, buz üzerinde örnekleri çözülme ve boyama önce iyice karıştırın.
  2. Örnekleri belirli antikorlar ile leke.
    1. (1.1 adımda hazırlanan) EV süspansiyon 10-20 μL 50 μL bir 1,5 mL tepki tüp ve karıştırmak içinde distile su ile iyice oranında seyreltin.
    2. İyice karıştırın ve RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya spesifik antikor (Tablo 1) 2.5-5 μL tepki tüp ekleyin.
    3. Lekeli EV süspansiyon 50 μL 2.5-10 mL distile su (Tablo 1) 15 mL tepki tüp içinde transfer, iyice karıştırın ve bu son süspansiyon partikül ölçüm için kullanın.
      Not: bazı durumlarda kullanılan antikor konsantrasyon olması gerekir (Tablo 1) ayarlanır.

3. işleme örnekleri

Not: Bu yöntem temelleri kapsamlı daha önce ve protokol odaklanır aşağıda floresans etiketli EVs14analizi için belirli adımları üzerinde tarif edildi.

  1. Başlatma yordamı gerçekleştirin.
    1. Floresan filtre mikroskop ve kamera optik yol itin. Programı başlatın ve otomatik uygulama için ekrandaki yönergeleri izleyin.
    2. Doğru telefon numarası (Z158_C1149_Fluor) Floresan ölçüm için "Hücre kontrol" sekmesinde (hücre tanımı) seçin. Lazer ve mikroskop ortak odak (lazer ve otomatik olarak bu konuma taşımak mikroskop) olduğundan emin olmak Optik için başvuru konumu seçin.
    3. 10 mL distile su ile dolu bir şırınga ile hücre Kanal Temizleme. Ölçüm hücre hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun ve hava kabarcıkları sisteme enjekte değil.
    4. Karboksilat grupları kendi yüzeyinde olan Tekdüzen 200 nm boyutlu floresans etiketli polistren parçacıkları içeren bir kalibrasyon süspansiyon hazırlamak. 990 μL distile su ile parçacıkların 10 μL sulandırmak. O zaman bu parçacık çözümü 15 mL tüp içinde 10 μL 10 mL gerekli konsantrasyonu elde etmek için distile su ile oranında seyreltin.
    5. 2.5 mL hücre kanaldaki seyreltilmiş parçacık çözeltisi enjekte edip "odak en iyi duruma getirme" tıklatın kamerayı ayarlamak için.
  2. Örnek ölçmek.
    1. Hücre Kanal 10 mL her örnek ölçü önce distile su ile dolu bir şırınga ile birden çok kez yıkayın. (2. adımda hazırlanan) lekeli EV süspansiyon hücre kanal enjekte.
    2. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "Hücre kontrol" sekmesinde aşağıdaki ana kamera parametrelerini gerekli (Tablo 2) ayarlayın. Başvuru konumu kullanın veya 0.41193 parametreleri ayarlamak için konum.
      1. "Sayısı parçacıklar vs duyarlılık" butonuna basarak için duyarlılık, en iyi ışık hassasiyet değerleri bulmak farklı duyarlılık düzeyi için ekran başına ölçülen parçacıkların bir eğri görüntülemek için.
        Not:
      2. Çekim için kamera ışık için kararlı bir aralığı geçmek sağlar süreyi ayarlayın.
      3. Sonrası satın alma parametrelerini için 20, 20 en az boyutu en az bir parlaklık seçin nm ve bir en büyük boyutu 500 nm ölçüm için.
    3. Algılanan parçacıkların görüntü görme alanı içinde sayılan sayısını not edin. Saçılma bar yeşil turuncu aralığına (50-300 parçacıklar) olması gerekir. Saçılma bar kırmızı ise, dağılım bireysel parçacıkların sigorta ve böylece yanlış sonuçlar için önde gelen bir tek parçacık olarak sayılır. Böyle bir durumda, daha fazla parçacıkların örtüşen önlemek için örnek seyreltik veya duyarlılığı azaltmak.
    4. Ölçüm başlamadan önce "Onay parçacık drift at 0 V" "Hücre kontrol" sekmesinde tıklayın. Drift 5 mikron/s yüksekse, ölçüm devam etmek için akan örnek duruncaya kadar bekleyin.
      Not: drift ölçüm başında çok yüksek ise, tekrarlanan ölçüler ve farklı sonuçlar sophisticate. NTA temel ilkeleri nedeniyle, ilgili bir drift yazılım tarafından hesaplanan olarak kararlı partikül büyüklüğü bir etkiye sahip.
    5. Tıkırtı üstünde "Koşmak Video edinme" içinde "Ölçü" sekmesini seçin deneyler (3-5) sayısı ve onları (0 dak) arasındaki gecikme süresi.
    6. (Bireysel subvolume-) konum (11) sayısı ve nerede parçacıklar analiz edilmelidir her ölçüm konumundaki (ölçüm) döngüsü (10) sayısını tanımlamak
    7. Bir klasör seçin, yeni bir dosya adı oluşturun ve tıkırtı "OK" ölçüm başlatmak için.

4. sonuçları yorumlanması

  1. Parametreleri ve sonuçları "Analiz" sonra ölçüm görüntüleyin. Hücre kanal temizlemeden önce analiz sonra aşağıdaki parametreleri denetleyin: parçacıklar pozisyon, izlenen parçacıklar ve parçacık konsantrasyonu, parçacıklar (x10, x50 ve x90 değerleri), dağıtım genişliğini toplam sayısı başına ortalama sayısı değeri Ortalama ve standart sapma. Ölçüm örnek gerekirse yineleyin.
    Not: Sonuçları bir .pdf veya .txt dosyası olarak da kaydedilir.
  2. "Analiz" sekmesinin boyutuna göre tespit edilen parçacıklar dağıtımını gösteren ölçü sonra hesaplanan grafiği görüntülemek için tıklatın. "Ekran" "Analiz" sekmesini tıklatın ve simgeleri ayarlamak ve belirli gereksinimleri grafik ayarlarını değiştirmek için kullanın.

5. doğrulama yolu ile EV algılama Western blot tarafından

  1. (1. adımda hazırlanan) EV Pelet RIPA lizis ve ayıklama arabelleği dağıtılması, iyice pipet ve lysate açıklamak ve süpernatant için yeni bir tüp aktarmak için 30 dakika santrifüj örneği 8.000 x g ' 4 ° C'de 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya.
  2. Toplam protein Lowry protein tahlil paketi tarafından ölçmek. İzole EV süspansiyon 1 μL 49 μL RIPA arabelleği ile sulandırmak ve 5 μL triplicates içinde çözümleme için kullanın. 2 x Laemmli yükleme arabelleğe 2 µg/μL ve ısı 95 ° C'de 10 dakika için son bir konsantrasyon ile EV süspansiyon sulandırmak
  3. Protein iyi başına 20 μg yükleyin. Ayrı ve proteinler polyacrylamide Jel Elektroforez ve tank kurutma göre standart iletişim kuralları tarafından aktarım.
  4. Membran (0,2 mikron polivinilidin difluoride) ile sığır süt tozu (% 5) RT, 1 h blok ve membran ile belirli birincil antikorlar (CD9, CD63 ve vimentin) gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    Not: 1:1,000 seyreltme birincil antikorlar kullanılır.
  5. Membran TBST ile yıkayın 3 x 5 min ve membran horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Konjüge ikincil antikor (1:20, 000 içinde TBST) 60 dk RT. az için
  6. Membran TBST ile yıkayın 3 x 5 min ve proteinler yüksek hassasiyet substrat çözeltisi bir görüntüleme sistemi ile Kemiluminesan saptamak.
    Not: CD63 antijen kapsamlı ve degisken glikozile, molekül ağırlığı değişebilir çünkü, ve gruplar arasında 40-65 kDa görünebilir.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz göstermek EVs yalıtım için detaylı bir protokol tam kan ve belirli yüzey işaretleyicileri hızlı karakterizasyonu floresans tabanlı izleme çözümlemesi nano tanecikleri ile. Yapılan deneylerde, biz sadece serum örnekleri izole EVs kullanılan, ama bu yöntem aynı zamanda ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve citrated plazma için uygun olan ve aynı zamanda idrar, anne sütü, tükürük gibi diğer vücut sıvıları için Genişletilebilir, beyin omurilik sıvısı ve meni. Ayrıca, bu iletişim kuralı için EVs karakterizasyonu hücre kültür supernatants üzerinden ayarlanabilir. Bu protokol için EV süspansiyon hafifçe exosomes ve EVs 30 arasında bir corpuscular büyüklüğüne göre precipitates özel bir polimer içeren bir eksozom yağış reaktif kullanarak serum 100 μL üzerinden oluşturulan nm 200 nm, mademki 10-20 μL EVs her yüzey işaretçisine karakterizasyonu için atandılar. Çünkü serum numuneleri (Örneğin, albümin ve globulin) protein yüksek miktarda antikor boyama prosedürü ile karışan ve arka plan ve sofistike bulguları yüksek düzeyde sonuçlar ne yazık ki, yalıtım adım, kaçınılmazdır. Ayrıca, exosomes örneklerde biyolojik kullanılabilirliğini temel, istihdam EV süspansiyon yanı sıra seyreltme işlemeden önce miktarı diğer kaynak malzemeleri için ayarlanması gerekir. Birden çok örnekleri karşılaştırmak için seyreltme örnekleri hem de tutarlı Alım parametreleri (duyarlılık, çekim, vb) için standart bir yaklaşım gereklidir. Başka bir önemli nokta drift (bizim ellerimizde < 5 mikron/s) düşük olana ölçümlere başlatılmamış olduğunu. Drift çok yüksek olsaydı, kendi aralarında yüksek standart sapma tekrarlanan ölçüler örnek vermiştir ama düşük bir drift, sonuçta elde edilen veriler son derece tutarlı ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde doğruladı. Seçili antikorlar uygun bir fluorochrome olması önemlidir. Çünkü FITC fotoğraf ağartma yüksek orandaki antikorlar ile Alexa Fluor 488, Birleşik gerekir. Muhtemelen daha istikrarlı fluophores artan tahlil istikrar için kesinlikle gelecekte götürecek. Normalde, pek çok araştırmacı için EVs. bir eritici PBS kullanma Bu iletişim kuralı için distile su bir eritici EV kullanılamaz hale için kullanmak çok önemlidir. Ne zaman EVs Floresanda boyalar, yüksek osmolalite ve PBS gibi diğer seyrelticiler iyon konsantrasyonu ile etiketlenir ile ölçüm engelleyebilir ve müşteri adayına sonuçlar değişmiş.

Önemli ölçüde son on yıl içinde gelişmiş yöntemlerle EVs çözümlenmesi için orada iken hala yalıtım ve EVs. karakterizasyonu için standart bir yöntemi yoktur Akış Sitometresi, nerede EVs kez boncuk için daha büyük bir yüzey sağlar bağlanmıştır, büyük dezavantajı birçok EVs güçlü ve algılanabilir sinyal10sağlamak için yüzeye dock olmasıdır. SEM ve TEM örnekleri hazırlık zaman alıcı ve EVs sadece onların boyut ve morfoloji11tarafından ayırt edilebilir dezavantajı var. Bugüne kadar nitel (Yani, biyokimyasal) için best-established ve yaygın olarak kullanılan yöntem EV karakterizasyonu Western blot, nerede protein-ebilmek var olmak çözümlemek belirli antikor12,13ile doldu. Ancak, bu yöntemlerin dezavantajları yetersizlik belirli yüzey işaretleri tek EVs çözümlemek için yalan. Ayrıca, emek yoğun adımlar değil yüksek örnek işlem hacmi ve tek EVs. karakterizasyonu için uygundur, uzun işlem süreleri ve birçok geçerli protokol tarafından kullanılan uzun çamaşır/yalıtım yordamlar içerir Bizim iletişim kuralı CD63, CD9, vimentin ve CD107a gibi belirli yüzey işaretleyicileri hızlı yalıtım ve tek EVs karakterizasyonu için tam bir iş akışı sağlar ve diğer yüzey işaretleyicileri kökenini belirlemek için geniş bir yelpazede için genişletilmiş Yayınlanan EVs. Nedeniyle kalıcı bir teknik ilerleme NTA cihazın en yeni analyzer ile üretici ile işbirliği içinde bizim bulgular doğruladık. EV biyoloji, özellikle exosomes, ilgili araştırmanın gelecek ilerleme ne olursa olsun burada sunulan Protokolü belirli işaretçileri olan tek EVs karakterizasyonu için hızlı ve güvenilir bir yöntem sağlayacaktır. EVs toplama yalıtım ve boyama işlemi sırasında defa kaçınılmaz olduğu için gelecekteki araştırma EV toplama önlemek ve floresan etiketli EVs. doğru boyutu belirlenmesi etkinleştirmek için yöntemler geliştirilmesi üzerinde odaklanmalıdır

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar parçacık Metrix GmbH kısmen bu eserin yayın maliyetleri kapsayan için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Serum ayırma tüpüBD366882BD Vacutainer
Ampuwa suyuFresenius Kabi10060
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suSigma56064C
Falcon tüpü, 15 mLGreiner Bio One188271
Falcon tüpü, 50 mLGreiner Bio One227270
Mikrosantrifüj tüp, 1.5 mLEppendorf30120086Ultra santrifüjleme için özel tüpler
Geçmeli Kapaklı Tüp 1.5 mLBeckman Coulter357448
Polybeads Microspheres 0.2 & mikro; mPolibilimler A.Ş.7304Hizalama Çözeltisi
Floresbrit YG Karboksilat Mikroküreler boncuk 0.2 ve mikro; mPolibilimler A.Ş.09834-10Hizalama
Solüsyonu Şırıngası, 2 mLBraun4606027V
Şırınga, 10 mLBraun4606728V
ExoquickSBIEXOQ20A-1EV çökeltme solüsyonu
Laemmli Numune Tamponu (2x)BioRad1610737
DC Protein Test Kiti IIBioRad5000112Lowry prtein testi
PKH67 Yeşil Floresan Hücre Bağlayıcı KitiSigmaPKH67GL-1KTGenel membran etiketleme için
Alexa Fluor 488 anti-insan CD107a AntikoruBioLegend328609Lizozomal ilişkili membran proteini-1 (LAMP-1)
İnsan CD9-Alexa Fluor 488R& D SistemleriFAB1880G:
AntikoruSBIEXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488ThermoFisherMA5-18149
FITC anti-insan CD63, AntikorBioLegend353005
CD63. Antikor, poliklonalSantaCruzSc-15363
Alexa Fluor 488 anti-vimentin AntikoruBioLegend677809
Anti-Vimentin AntikoruSBIEXOAB-VMTN-1
Keçi anti fare IgG + IgMJackson Immuno315-035-048
Keçi anti tavşan IgGDianova111-035-003
SuperSignal Batı Femto Maksimum Hassasiyetli YüzeyThermoFisher34094
ZetaViewParçacık MetrixPMX 100, Tip
SantrifüjEppendorf5804R
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima MAX-XP
Kemilüminesans GörüntüleyiciGE HealthcareAmersham Görüntüleyici 600
Anti-CD9 , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
  2. Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
  3. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9(2011).
  4. Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  5. Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086(2015).
  6. Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
  7. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  8. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
  10. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  11. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
  12. Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
  13. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
  14. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesNanoparticle Tracking AnalysisFluorescence based CharacterizationSingle EV AnalysisHuman Blood EVsPKH67 StainingCD63 CD9 MarkersLAMP 1 VimentinSerum Isolation ProtocolFluorescent Bead Calibration

Related Articles