Yöntem makalesi

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

DOI:

10.3791/58735

⸱

7 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miktar formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi proteinlerin klinik olarak önemli olduğunu ve araştırma uygulamaları. Miktar bir en iyi yöntem doğrudur, geniş bir doğrusal dinamik alanı vardır ve tek tek hücre tiplerinin tanımlanması için izin vermek için örnek yapısal bütünlüğünü korur. Geçerli yöntemleri immünhistokimya (IHC), kütle spektrometresi ve immunoblotting gibi her kategorik kendi doğası nedeniyle bu hükümleri yerine veya örnek homojenize gerekiyor. Alternatif bir yöntem ayirt (Eğer) ve faiz FFPE dokulara protein göreli bereket belirlemek için görüntü analizi öneriyorum. Burada biz bu yöntemi kolayca optimize edilmiştir, geniş dinamik alan verimleri ve nicel immunoblotting altın standart göre doğrusal olarak ölçülebilir göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem örnek yapısal bütünlüğünü bakım izni ve tanılama uygulamalarda çok önemli olabilir çeşitli hücre tiplerinin düzeye çıkarılmasını sağlar. Genel olarak, bu FFPE örneklerinde proteinlerin göreli miktar için sağlam bir yöntemdir ve klinik uygun veya ihtiyaçları araştırma için kolayca adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinler formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku biyopsisi örneklerinde ölçmek için gereken birçok klinik alanda bulunmaktadır. Örneğin, miktar rutin biyopsi örnekleri biyomarker proteinlerin prognoz aydınlatmak ve tedavi kanser hastaları1için bilgilendirmek için kullanılır. Ancak, geçerli yöntemleri genellikle öznel ve doğrulama eksikliği.

İmmünhistokimya (IHC) patoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılan ve genellikle birincil bir antikor hedef protein yönetmen ve horseradish peroksidaz2gibi enzimatik bir etiketi ile Birleşik bir ikincil antikor bağlıdır. Geleneksel IHC duyarlıdır, yapabilirsiniz dakika kullanımı örnekleri ve dolayısıyla protein ifade ile ilgili histolojik bağlamı içinde değerlendirilmesi erişimine izin verme doku örnekleri morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, IHC tarafından oluşturulan chromogenic sinyal Eksiltici olduğundan, nispeten dar Dinamik Aralık uğrar ve2,3,4çoğullama için sınırlı potansiyel sunmaktadır. Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (MALDI-MSI) görüntüleme morfolojik bütünlüğünü korur. Ancak, gelişmekte olan bu teknoloji mütevazı morfolojik çözünürlük ile ilişkilidir ve önemli kalibrasyon ve normalleştirme, onun fizibilite rutin klinik kullanım5,6,7için kararlar almanı gerektirir. İmmunoblotting8, kütle spektrometresi9,10,11ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)12, doku örnekleri protein ölçmek için alternatif teknikleri dahil her homojenize ile başladığı, örnek doku lysate. Birincil doku örnekleri türdeş olmayan çok sayıda hücre türleri içerdikleri vardır. Bu nedenle, homojenizasyon örnekleri gerektirecektir teknikleri bir protein miktar kanser hücreleri gibi ilgi belirli hücre nüfus izin vermez.

IHC, olsa gibi küçük ve ilgili FFPE örnekleri ve histolojik bütünlük13tutma izin verir. Ancak, floresan sinyallerini, katkı doğaya teşekkür Eğer birden çok birincil antikorlar ve floresan etiket uygulamaya müsait değil. Böylece, bir protein ilgi nispeten belirli hücreleri veya hücresel kompartmanlarda (örneğin, çekirdek karşı sitoplazma) diğer antikorları kullanılarak tanımlanmış içinde sayısal. Floresan sinyallerini de büyük bir Dinamik Aralık13,14avantajı var. Üstünlük, tekrarlanabilirlik ve çoğullama potansiyelini gösterdiği13,14,15FFPE örnekler için uygulanan olmuştur.

Burada nicel immunoblotting ilgi bir protein göreli bolluk belirlemede bilgisayar destekli görüntü analizi ile birleştiğinde nicel doğası tespit için altın standart olarak kurulan hücre hatları kullanarak nasıl kullanılacağını açıklar FFPE doku örnekleri histolojik bölümlerden. Bu yöntemde biyomarker proteinler klinik biyopsi örnekleri16,17,18ölçmek için çok katmanlı bir yaklaşım başarıyla uygulamış.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil insan doku örnekleri kullanmak için onay Sağlık Bilimleri ve bağlı eğitim hastaneleri Araştırma Etik Kurulu (HSREB) Queen's University elde edildi.

1. hücre kültürünü doku Mikroarray (TMA) bina

  1. Hasat ve hücreleri yıkayın.
    Not: Bu protokol üzerinde çeşitli kurulan ölümsüzleştirdi hücre satırları (Örneğin HeLa, Jurkat, RCH-ACV) test edilmiştir.
    1. Bir kez onlar uzanmak yaklaşık % 80'i confluency yapışık hücreleri için yaklaşık 1.3 x 107 hücre hasat. Bu hücre satırı için uygun bir reaktif kullanarak hücre bağlantısını kesin.
      Not: Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) yüzey proteinleri aşağılayıcı riskini azaltmak için tripsin üzerinde genellikle tercih edilir. Tripsin kullanıyorsanız, hemen hücreleri hasat sonrası fetal Sığır serum (FBS) kullanarak tripsin etkisiz hale getirin.
    2. Süspansiyon hücreler için yaklaşık 8 x 107 hücreleri günlük-büyüme aşamasında hasat.
    3. Hasat/müstakil hücreleri 225 x g 50 mL konik tüp içinde 5 min için centrifuging tarafından toplamak.
    4. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve pelet 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) X 10 ml yeniden askıya alma. 225 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
      Not: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 ' te distile su 1 X PBS oluşmaktadır; pH 7.4 için ayarlayın.
  2. Formalin hücrelerde düzeltmek ve onları cips.
    1. Hücre Pelet konik tüp içinde 10 mL % 10 tarafsız tampon formalin (NBF) askıya alma.
      Not: NBF 1 mL 1 X PBS 9 ml % 37 formaldehit stok çözeltisi sulandrarak hazır olun.
      Dikkat: formalin ve formaldehit ele alırken dikkatli olun. Bir duman hood formalin ve formaldehit içeren adımları için kullanın.
    2. Bir rocker (yaklaşık 17 h) gecede oda sıcaklığında 24 rpm'de hücrelerdeyse kuluçkaya.
    3. Düşük erime noktası özel PBS içinde % 1 çözeltisi (özel 1 mL PBS başına 0,01 g) hazırlayın.
      1. Özel çözüm hücre satır örnek başına 500 µL yetecek hazırlayın.
      2. Ara sıra 2-5 min için karıştırma ile bir 80 ° C su banyosu veya sıcak bir blok içinde özel geçiyoruz. Sonra çözünmüş, çözüm sertleşme önlemek için bir 37 ° C su banyosu veya sıcak bir blok içinde tutun.
    4. Sabit hücrelerden 1.2.2 225 x g., 5 min için centrifuging tarafından adım Pelet süpernatant çıkarın ve 1 x PBS 500 µL hücrelerde resuspend.
    5. Hücreleri, 290 x g. aspiratı tüm süpernatant 5 min için centrifuging tarafından 1.5 mL microcentrifuge tüp ve Pelet aktarın.
  3. Özel hücrelerde döküm.
    1. ~ 500 µL hücreleri içeren her tüp (1.2.3. adımdaki) % 1'özel çözüm ekleyin. Yumuşak, ama hızlı bir şekilde karıştırmak için bir P-1000 micropipette kullanarak yukarı ve aşağı karışımı pipet.
      Not: diyafram büyütmek ve kabarcıklar oluşturan önlemek için pipet ucu ucunu kesti. Çalışan özel çözüm sertleşme önlemek için 37 ° C su banyosu içinde tutun.
    2. Oda sıcaklığında (5-10 dk) sertleşmesine özel hücre çözümü sağlar. NBF her microcentrifuge için bir örnek içeren tüp ve oda sıcaklığında (en fazla 24 saat) katıştırma parafin kadar tutmak % 10 1 mL ekleyin.
  4. Özel tak parafin gömmek için hazırlayın.
    1. Örnekten NBF kapalı Aspire edin.
    2. Bir tıraş bıçağı kullanarak microcentrifuge Tüp tak plastik doku kaset yerleştirmek için hücre fişini çıkarın. % 10'luk kaset depolamak NBF oda sıcaklığında.
  5. Örnekleri işlemek ya el ile gece veya bir otomatik doku işlemci kullanarak ve parafin içinde standart Histoloji yöntemlerle embed.
    Not: Bkz: Fischer ve ark. bir örnek protokolü için 19 .
  6. Kullanarak, özel bir "doku arrayer" enstrüman, yinelenen 0,6 mm göbek parafin blok her hücre satırından ve, satır içinde bir hücreyi satır TMA oluşturmak için bir boş alıcı parafin blok eklemek hasat.
    Not: Fedor ve De Marzo20dakikaya açıklananlar gibi standart yöntemleri kullanılmalıdır.
  7. 2-3 ek doku türlerini (örn., bademcik, iki nokta üst üste, testis, vb) pozitif veya negatif denetimleri TMA temsil eden birincil örneklerinden çekirdek dahil. Faiz protein için uygun doku seçin.
  8. Bir microtome iki histolojik kesitler, yaklaşık 4-6 µm kalınlığında, hücre satırının TMA hazırlamak için kullanın. Histoloji slaytta bölümüne bağlayabilir, Kuru ve (Fedor ve De Marzo20içinde açıklandığı gibi) deparaffinize.

2. örnek tarafından ayirt boyama

  1. Birincil antikor seyreltme optimize edin.
    Not: IHC veya Eğer optimizasyonu FFPE doku bölümlerde Kajimura vd gibi için için standart protokoller bulunmaktadır 21. yaklaşım kısa bir bakış burada özetlenen.
    1. 4-5 dilutions üretici yönergelerine tarafından güdümlü faiz protein birincil antikor, hazır olun.
    2. Protein morfolojik tanınabilir hücre popülasyonlarının ilgi ifade eder bir hayvan veya insan kaynağından kontrol doku tipini belirleyin. Doku bölümlerini hazırlamak ve aşağıdaki gibi standart immünhistokimya yordamı Fedor ve De Marzo20slayt üzerindeki mount.
      Not: Gerekli bölüm sayısı birincil antikor dilutions artı fazladan bir sayısıdır.
    3. Bir otomatik veya el ile sistemi immunohistology için kullanıldığında, birincil antikor dilutions adım 2.1.1 her adım 2.1.2 slayttaki sınayın. Birincil antikor uygulamadan ilave slayt atlarsanız, bir negatif kontrol kullanın.
    4. Boyama işlemi sırasında tüm slaytlar ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bir nükleer counterstain ve fluorescently etiketli bir ikincil antikor olarak leke. Daha fazla duyarlılık gerekliyse bir HRP (horseradish peroksidaz) kullanın-Birleşik ikincil antikor ve tyramide tabanlı sinyal güçlendirme sistemi (bkz: yığın vd. 13).
      Not: birincil antikorlar çoğullama, farklı bir floresan etiket için her protein kullanılır.
    5. Uyarma ve algılama dalga boylarında kullanılan fluorophores uygun kullanarak bir dijital resim dosyasını üretme yeteneğine sahip uygun bir araç kullanarak immunostained slaytlar inceden inceye gözden geçirmek.
    6. Dijital görüntüleri görebilir ve ampirik olarak sinyal şiddeti arka plan floresans göre en iyi duruma getirir birincil antikor seyreltme seçmek için uygun yazılımı kullanın.
      Not: arzu edilirse, bu iyileştirme bir HRP Birleşik ikincil antikor, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) ve aydınlık alan mikroskobu kullanılarak oluşabilir.
  2. Hücre kültürünü TMA boyama gerçekleştirin.
    1. TMA hücre satırıyla (2.1. adımda belirlenen) en iyi duruma getirilmiş birincil antikor seyreltme slayt leke için immunohistology için bir otomatik veya el ile sistemi kullanın. Birincil antikor uygulama ikinci slayttan atlarsanız, bir negatif kontrol kullanın.
    2. Boyama işlemi sırasında tüm slaytlar ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nükleer bir counterstain olarak ve bir ikincil antikor ve tyramide olduğu gibi adım 2.1.4 leke.
    3. Uyarma ve algılama dalga boylarında kullanılan fluorophores uygun kullanarak bir dijital resim dosyasını üretme yeteneğine sahip uygun bir araç kullanarak immunostained slaytlar inceden inceye gözden geçirmek.
    4. Faiz (Yani, sitoplazma karşı çekirdeği) hücresel bölmesinin tanımlamak ve her hücre satırı için Ortalama floresans yoğunluğu (MFI) ölçmek için bir görüntü analiz yazılım paketi kullanın.
      Not: Çeşitli yazılım paketleri bu amaç için kullanılan ve birçok yığını ve ark. içinde ele alınmıştır 13.

3. kantitatif Immunoblotting hücre hatları

  1. Hücre Lysates hazırlayın.
    1. 2 milyon hücre her hücre satırın 1.1.1-1.1.3 adımlarda açıklandığı gibi hasat.
    2. Hücreleri aşağı vasıl 650 x g 50 mL konik tüp içinde 5 min için spin. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
    3. Buz gibi PBS 10 mL hücrelerle yıkayın. Buz gibi PBS ve 1.5 mL microcentrifuge tüp transfer 1 ml resuspend. Adım başı olarak 3.1.2 santrifüj kapasitesi, dikkatle boşaltmak ve hücreler buz üzerinde bırakın.
    4. Soğuk radioimmunoprecipitation (RIPA) lizis arabelleği proteaz inhibitörleri (100 X inhibitörleri RIPA lizis arabellek mL başına 10 µL) ile yaklaşık 200 µL hücrelere ekleme girdap ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
      Not: Lizis arabellek etkili lizis için gerekli miktarda hücre satırı ile değişir ve ampirik olarak belirlenebilir. RIPA arabellek 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, %1.0 NP-40, % 0.5 sodyum deoxycholate, % 0,1 SDS distile su içinde oluşur.
    5. Nispeten bile immunoblots üzerinde yükleme sağlamak için her lysate Bradford tahlil gibi uygun bir yöntem kullanarak üzerinden 20 µL örnek Toplam protein ölçmek. 6 X Laemmli lizis arabelleği yaklaşık 40 µL kalan (yaklaşık 180 µL) her hücre lysate için ekleyin ve 5 min için bir ısı blok veya su banyoda 100 ° C'de kaynatın.
      Not: arabellek 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), % 4 (w/v) SDS, % 60 gliserol, % 0.6 (w/v) bromophenol mavi, oluşan 6 X Laemmli 50 mM dithiothreitol (DTT) içinde distile su.
    6. Örnekleri-20 ° c ilâ iki hafta için saklayın.
  2. Hangi hücre kültürünü ilgi en bol protein belirlemek için tüm hücreleri satırlarının bir immunoblot gerçekleştirin.
    Not: Mahmud, T. ve Yang, PC konusunda açıklanan yordamı izleyin. 22, aşağıdaki değişiklikler ile.
    1. Aliquot hücre lysate (hazırlanan adım 3.1) içeren 10-50 µg protein (bağlı olarak protein ilgi bereket) microcentrifuge tüpler içine. 6 X Laemmli arabellek ve birimi 15 µL kadar açmak için yeterli RIPA lizis arabellek 2.5 µL ekleyin.
    2. Yük istifleme %5 ve uygun bir konsantrasyon (Örneğin, proteinler arasında 15-100 kDa için % 10) çözme SDS-sayfa jel bir protein merdiven ve adım 3.2.1 örneklerinden. 1 X Laemmli arabellek boş kuyu yükleyin. Güç kaynağı uygun ayarları genellikle 125 V, 80 dk ya da bromophenol mavi boya alt plaka ulaşıncaya kadar çalıştırın.
    3. Wiedemann vd içinde açıklandığı gibi bir yarı kuru protein aktarımı gerçekleştirmek 23.
      Not: için temsilcisi sonuçları (metanol içinde batırılmış gerekmez) bir nitroselüloz membran, ve soğuk Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) aktarım arabellek kullanılmıştır. BSN arabellek 48 mM Tris, 39 mM glisin, % 20 metanol distile su içinde oluşur.
    4. Aktarımdan sonra yatay olarak GAPDH gibi bir uygun iç kontrol protein dan ilgi protein içeren bölümünü ayırmak için membran kesmek için jilet kullanın.
    5. Birincil antikorlar üretici tarafından önerilen engelleme tampon kullanarak engelleme ve antikor incubations devam edin.
      Not: Optimum birincil antikor dilutions önemli ölçüde protein bereket ve duyarlılık bağlı olarak değişebilir. GAPDH denetim 1:40,000 seyreltme gerekli iken aşağıdaki temsilcisi sonuçları için antikor protein ilgi 1:1,000 seyreltme gerekli. İkincil antikorlar kullanılan seyreltme 1:3, 000 olduğunu.
    6. Antikor incubations ve membran yıkama sonra bir sandviç torbası gibi şeffaf plastik kılıf membran şeritler yerleştirin.
    7. Üreticinin yönergelerini izleyerek enchanced Kemiluminesan (ECL) karışımı hazırlayın. ECL karışımı ile membran kapak, kılıf kapatın ve 1-2 min için oda sıcaklığında karanlıkta karışımı ile membran şeritler kuluçkaya P-1000 pipet kullanın.
    8. Membran kılıf bir dijital görüntüleme platformu yerleştirin. Kemiluminesan ve kolorimetrik işaret algılama membran çeşitli pozlama yakalamak için kullanın.
      Not: Pozlama süreleri yüklü protein miktarına göre değişir, bolluk hedef protein, bir kaç saniye hareketlerle bir otomatik pozlama (genellikle birkaç saniye) ve test pozlama süreleri üstündeki ve altındaki antikor benzeşme vb başlar.
    9. Ampirik olarak, görüntü analiz yazılımı kullanarak belirlemek hangi hücre kültürünü en hedef protein ifade eder.
  3. Bir seri dilüsyonu kullanılarak her birincil antikor doğrusal dinamik aralığı bulmak.
    1. Adımları 3.2.1-3.2.8 gerçekleştirmek (3.2.9 adımda belirlediğiniz) hedef protein en yoğun ifade hücre satırından seri dilutions bir dizi kullanarak.
    2. Görüntü analiz yazılımı ImageJ gibi Dansitometresi pozlama görüntülerinde gerçekleştirmek için kullanın.
      1. Örneğin, ImageJ kullanarak, ilk sokağın jel ölçmek için seçmek için Dikdörtgen seçim aracını kullanın. Gidin analiz | Jelleri | İlk Lane seçin. Elde edilen dikdörtgen sonraki lane üzerinde hareket etmek için fareyi kullanın. Gidin analiz | Jelleri | İleri Lane seçin. Art arda gelecek şerit için dikdörtgeni taşımak ve lane şerit geri kalanı için seçin.
      2. Gidin analiz | Jelleri | Şerit Arsa. Düz çizgi aracı arka plan gürültü çıkarmak için her tepe üsleri arasında çizgiler çizmek için kullanın. Her tepe seçmek için değnek aracını kullanın ve bundan böyle grup yoğunluk sonuçları penceresinden başvurulan her tepe yoğunluğu toplamak.
    3. Dansitometresi çıkış bant yoğunluk karşı scatterplot toplam protein miktarı her birincil antikor için yüklü oluşturmak için kullanın. En uygun ve görsel denetim bir çizgi kullanarak, her antikor doğrusal dinamik aralığını (yoğunluk aralığı) konumunu belirleyin.
    4. Tüm hücre hatları ile ilerlemeye konsantrasyon için doğrusal Aralık sonundaki daha yüksek bir değer oluşturur bir protein konsantrasyonu seçin.
      Not: Bu konsantrasyonu hücre satırı bu proteinin en büyük miktarda doygunluk düzeyin altında olduğu için olmalıdır tehlikesi yok diğer hücre hatları için bantları açığa üzerinde.
  4. 3.3.4. adımda tüm hücre satırlarını seçilen protein konsantrasyonu kullanarak bir immunoblot gerçekleştirmek ve adımları 3.2.1-3.2.8 tekrarlayın.
    1. Dansitometresi adım 3.3.2 olduğu gibi dijital tarama gerçekleştirin. 3.3.3. adımda tanımlanan her antikor için doğrusal aralıklarda sinyalleri verim pozlama görüntüleri seçin.
    2. 3.4.1 ideal maruziyetin gelen grup yoğunluğu sinyalleri kullanarak, hedef protein grubu yoğunluğu her hücre satırı için Grup yoğunluğunu kontrol yükleme için oranını hesaplamak. Bu oranı değerleri göreli bereket hedef protein ilgi gösterir.
    3. Pearson korelasyon testi (-ebilmek kılınmak istatistiksel yazılım paketi kullanarak) bu immunoblotting (adım 3.4.2) elde edilen görüntü analizi eğer boyama (adım 2.2) elde edilen değerler ilişkilendirmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eğer yetenek hücre hatlarında FFPE doku bloklar halinde yapılan anti-apoptotik protein Bcl-2 göreli miktarını belirlemek için onaylamak için kullanılan bu protokol. Sayısal Bcl-2 seçmeli olarak'kanser hücrelerinin oncogenic mekanizmaları aydınlatmak ve patolojik tanı ve klinik yönetim kararları24bilgilendirilmesi yararlı olabilir. Daha ayrıntılı olarak, Bcl-2 uygun B-lymphocyte gelişiminde bir rol oynar ve ifadesini sık lenfoma25,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem tarif var nicel immunoblotting (IB) ayirt (Eğer) yardımcı programı göstermek için bir hedef protein FFPE doku örneklerinde göreli bolluk ascertaining için yararlandığına. Geçerli protein miktar yöntemleri chromogenic IHC2,3gibi kategorik doğaları gereği veya örnekleri gibi örnek nüfus yapısı ve hücre içine soruşturma önlenmesi, homojenize gerektiğinden sınırlıdır IB ve kütle spektrometresi8,9

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser kısmen Fredrick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu (A.M.) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
697DSMZACC 42Hücre hattı
JeKo-1ATCCCRL-3006Hücre hattı
JurkatATCCTIB-152Hücre hattı
RCH-ACVDSMZACC 548Hücre hattı
Granta-519DSMZACC 342Hücre hattı
REHDSMZACC 22Hücre hattı
RajiATCCCCL-86Hücre hattı
HeLaATCCCCL-2Hücre hattı
Tripsin / EDTA çözeltisiİnvitrojenR001100Yapışkan hücreleri ayırmak için
Fetal sığır serumu (FBS)Wisent Inc.81150Tripsin
Nötr Tamponlu FormalinProtokolünü245-684Hücre peletlerini sabitlemek için
UltraPure düşük erime noktalı agarozInvitrogen15517-022Hücre peletlerini dökmek için
Fare monoklonal anti-insan Bcl-2 antikoru, klon 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429Bcl-2'yi immünoflorenence ve immünoblot ile tespit etmek için (lot#:  00095786
Ventana Discovery XTboyama otomasyonu için
EnVision+ Sistemi- HRP etiketli polimer (fare önleyici)Dako (Agilent)K4000İmmünofloresan sinyal amplifikasyonu için
EnVision+ Sistemi- HRP etiketli polimer (tavşan önleyici)Dako (Agilent)K4002İmmünofloresan sinyal amplifikasyonu için
Siyanin 5 tiramid reaktifiPerkin ElmerNEL745001KTİmmünofloresan sinyal amplifikasyonu için
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Tarananslaytları görüntülemek için
HALO görüntü analiz yazılımıIndicaLabs-İmmünofloresan
Proteaz inhibitörlerinin miktar tayini için (Halt proteaz inhibitörü kokteyli, 100X)Thermo Scientific1862209 Eklemek için RIPA tamponu
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)RIPA tamponuBioShopEDT001
NP-40BDH Limited56009RIPA tamponu için
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750RIPA tamponu için
GliserolFisherBiotechBP229Laemlli tamponu
için Bromofenol mavisiBioShopBRO777Laemlli tamponu
için Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Laemlli tamponu için
Sığır serum albümini (BSA)BioShopALB001İmmünoblot yıkamaları için
Protein merdiveni (Precision Plus Protein Çift Renk Standartları)Bio-Rad161-0374Protein jeli çalıştırmak için
Filtre kağıdı (Ekstra kalın leke kağıdı)Bio-Rad1703969Lekeleme için transfer
Nitroselüloz membranBio-Rad162-0115Lekeleme transferi için
Trans-blot SD yarı kuru transfer hücresiBio-Rad1703940Yarı kuru transfer için
Yağsız süt tozu (Yağsız kuru süt)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi9999STamponu bloke etmek için
Tween 20BioShopTWN510Yıkama tamponu
için GAPDH tavşanı monoklonal antikorEpitomik2251-1Kontrol proteininin birincil antikoru (lot #: YE101901C)
Keçi anti-fare IgG (HRP konjuge) antikoruabcamkedi #: ab6789, RRID: AB_955439İmmünoblot için ikincil antikor
Keçi anti-tavşan IgG (HRP konjuge) antikoruabcamkedi #: ab6721, RRID: AB_955447İmmünoblot için ikincil antikor (lot #: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substratlarıBio-Rad1705060İmmünoblot sinyal tespiti için
Amersham Imager 600GE Healthcare Yaşam Bilimleri29083461İmmünoblot sinyal tespiti için
ImageJ yazılımıFreeware, NIH-Dansitometrianalizi için
nötralize etmek için Roche-İmmünofloresan için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Immunofluorescence AssayCell Line ValidationProtein Biomarker QuantificationFFPE Tissue AnalysisImage Analysis SoftwareWestern Blot ProtocolFluorescence Intensity MeasurementLinear Dynamic RangePearson Correlation Test

İlgili makaleler