Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Bizim gün içinde sabit yüksek/super kararlılık düşsel ve yaşam numune sağlayan ışık mikroskobu teknikleri hızla gelişiyor. Süper çözümleme teknikleri gibi uyarılmış emisyonu yapısal azalması (STED), ışık mikroskobu (SIM) ve fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) veya doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına), sırasıyla, vardır piyasada bulunan ve görüntüleme ayrıntıları neredeyse moleküler ölçek^1,2,3,4,5,6' da gösterilen hücre altı yapıları etkinleştirin. Ancak, bu yaklaşımların hala geniş hacimli birden çok çerçevelemek-de ikinci Alım hızı ile görüntülenmeyecektir gereken canlı görüntüleme deneyler için uygulanabilirliği sınırlıdır. Plazma zarı ile Örneğin endo - düzenlenmiş Son derece dinamik süreçler çeşitleri / ekzositozu, adezyon, geçiş veya sinyal, ortaya büyük hücresel birimleri içinde yüksek hız ile. Son zamanlarda, bu boşluğu doldurmak için bir tümleşik mikroskobu tekniği önerilen denilen dönen disk-TIRF (SD-TIRF)⁷oldu. Özellikle yalıtmak ve plazma zarı^8,9yerelleştirilmesine, iken SD mikroskobu en hassas ve hızlı görüntüleme teknikleri görselleştirme ve takibi için yaşamak için izin verir ayrıntılı olarak TIRF mikroskobu hücre altı organelleri sitoplazma^10,11. Her iki görüntüleme teknikleri içinde a tek tertibat birleşimi zaten son^12,13' te fark, ancak, burada sunulan (Şekil 1) mikroskop nihayet canlı görüntüleme SD-TIRF deneyleri gerçekleştirmek için ölçütleri karşılayan 3 çerçevelemek-de ikinci hız, söz konusu süreçleri. Bu mikroskop ticari olarak mevcut olduğundan, bu yazının amacı detaylı olarak tarif ve açık kaynak araçlar ve protokoller için resim alma, kayıt ve SD-TIRF mikroskobu ile ilişkili görselleştirme sağlar olduğunu.

Kurulum iki tarama birimlerine bağımsız bağlantı noktaları üzerinden bağlı bir ters mikroskobu dayanmaktadır - sol bağlantı noktası SD birim ve tarayıcı ünitesini geri bağlantı noktasına TIRF ve fotoğraf-harekete geçirmek /-beyazlatma için bağlı olduğu deneyler. 6 lazerler (405/445/488/515/561/640 nm) uyarma için kullanılabilir. Uyarma ve algılama floresans sinyalinin ya 100 x / NA1.45 yağ veya 60 x / NA1.49 petrol TIRF amaç, sırasıyla, istihdam. Verilmiş ışık bölünmüş bir Dikroik ayna tarafından (561 nm uzun-pass veya 514 nm uzun taramalı) ve çeşitli bant geçiren filtre tarafından filtre (55 nm geniş 525 merkezli nm, 54 609 merkezli nm geniş nm için yeşil ve kırmızı floresans, sırasıyla) iki EM-CCD cam önünde yer devirlerde. Lütfen kurulumu hakkında daha fazla teknik bilgi Zobiak vd. listelenen Not ⁷. TIRF yapılandırmada, SD birim içinde ışık yolu yaklaşık 0,5 dışına taşınır s böylece aynı iki fotoğraf makinesi-ebilmek var olmak kullanılmış için algılama, 1 karşılaştırıldığında iki görüntüleme yöntemleri arasında daha hızlı geçiş izin geçmişte bildirildi s^{13 < /C2 >. Bu özellik, Çift kanal aynı anda satın alma sağlar, böylece SD-TIRF, daha önce eşsiz hız Imaging 4 kanalları ve doğruluk gerçekleştirilebilir. Ayrıca, SD ve TIRF görüntüleri arasında uyum gereksizdir. Resim hizalaması iki kamera arasında ancak, deneme başlamadan önce kontrol edilmesi ve gerekirse düzeltilmiş var. Aşağıdaki protokolünde bir kayıt düzeltme rutin bir kendi kendini yazılı ImageJ makrosunda uygulanmıştır. Ayrıca, makro ağırlıklı olarak SD - ve onların farklı dimensionality rağmen TIRF veri kümeleri bir eş zamanlı görselleştirme izin vermek için tasarlanmıştır. Satın alma yazılım bu özellikler sağlamadı.}

1. hücre hazırlanması

1. İki gün önce deney 6-şey hücre-kültür plaka kuyu başına tam büyüme ortamının 2 mL 3 * 10⁵ HeLa veya NIH3T3 hücrelerde tohum. Hücreleri bir laminar akış başlıklı bu protokolü boyunca işlenir emin olun.
2. Bir gün önce deneme, üreticinin önerilerini veya ampirik olarak kararlı bir iletişim kuralı, Örneğingöre transfection reaktifler hazırlayın:
   1. Teklif toplama-Lifeact 1 µg sulandırmak ve YFP-Vinculin 1 µg toplam 200 µL serum orta düşük. Girdap transfection reaktif kısaca, 4 µL 200 µL DNA ve girdap yeniden add. Transfection karıştırmak için 15-20 dk oda sıcaklığında kuluçkaya.
   2. Tüm transfection karışımı dropwise doğrudan hücrelere ekleme. Plaka sallayarak karıştırın ve geri kuluçka makinesi yerleştirin.
3. Deneme günü, canlı görüntüleme için örnek hazırlayın:
   1. Bir 35 mm cam alt tabak cam yüzey kat için PBS fibronektin 10 µg/mL çözeltisi hazırlamak. Sadece yüksek kaliteli 0,17 mm cam coverslips en iyi TIRF performans için kullanın ve plastik alt yemekler kaçının. Çözüm için oda sıcaklığında 30 dk sonra kaldırın ve kurumasına izin çanak cam yüzeyde ayrılacaklar.
   2. 1.8 x 10⁹ parçacıklar mL distile su içinde başına yoğunluğunun 0,1 µm çok floresan boncuk çözüm sulandırmak ve 30-60 s için çözüm için fibronektin kaplı cam yüzey ekleyin. Hemen çözüm kaldırmak ve kurumasına izin çanak.
      Not: TIRF uçak önce hücreleri tohum ve/veya boncuk tabanlı görüntü kayıt için 2-renk referans görüntü elde etmek için yalnızca bulunmak, bu adım gereklidir.
   3. 0.1 M askorbik asit (AA) çözüm hazırlamak ve büyüme orta (AA-orta) 0.1 mM son bir konsantrasyon oranında seyreltin. Çözüm 37 ° C su banyosu içinde bir yer.
      Not: floresan optimize edilmiş hücre kültür ortamı mümkünse, böyle gibi phenolred ücretsiz kullanımı ve (ribo-) orta flavin azaltılmış. AA Fototoksik efektler canlı görüntüleme¹⁴sırasında azaltabilir bir anti-oksitleyici ajan var. Biz-si olmak sınav o başarıyla bu tahlil, daha fazla hücre daha AA ek uygulanan koşullar altında sağlıklı çıktı yani . Ancak, ortam pH 0,17 pH birimleri tarafından indirdi.
   4. 2 mL PBS hücrelerle yıka, 250 µL eklemek tripsin-EDTA ve beklemek-e kadar tamamen hücrelerdir (2-3 dk 37 ° C kuluçka) ilişkisi kesildi. Resuspend 1 mL dikkatle hücrelerde önceden ısınmış AA-orta bir pipet ile ve 4 mL AA-orta bir 15 mL hücre kültür tüp ekleyin. Hücre süspansiyon biraz açılan bir kapak ile mikroskop civarında 37 ° C ve % 5 CO₂ ye ayarla bir kuluçka yerleştirin.
   5. 1 mL ön cam alt yemek için AA-orta ısıttı ve önceden ısıtılmış mikroskop tutucuya yerleştirin ekleyin (sonraki paragrafa bakınız).

2. canlı görüntüleme

1. Bir kararlı 37 ° C, % 5 CO₂ ve nemli atmosfer elde etmek için mikroskop çevresel kontrolünü başlatın.
   Not: Burada, küçük sahne en iyi kuluçka odası yaklaşık 15 dk. daha büyük İnkübatörler içinde izin verilen istikrarlı ayarlar istikrarlı koşulları elde etmek için daha fazla zaman gerekir kullanılmıştır.
2. Hücre süspansiyon uygulanmadan önce tüm satın alma ayarları mikroskop saptamak:
   1. 30 için zaman aralığı ayarlarken s ve süresi 60-90 dk. için donanım tabanlı otomatik odaklama her zaman noktası ("1" değeri) için otomatik odaklama işlevi etkinleştirmek.
   2. Fotoğraf makinesi pozlama ve kazanç yanı sıra lazer güç her kanal için ayarlayın. Yüksek kazanç seviyeleri, düşük çekim hızı ve düşük lazer güç fotoğraf-toksisite azaltmak için tavsiye.
      Not: burada sunulan veri 200 ms pozlama ile satın alınmıştır, 0,5 W/cm² 488 için uyarma yoğunluklarda eşittir düzeyini 500 ve %20 lazer güç kazanmak nm ve 1 W/cm² 561 için nm, anılan sıraya göre.
   3. Z-yığın iplik-disk kanallar için 10 µm 0.4 µm aralığı ayarlayın. Z-yığınları TIRF kanallar için de-harekete geçirmek. Alt-ofset "0" En düşük uçak olacak yani donanım auto-odak odak konumunu ayarlayın.
   4. Çok noktalı işlevi "sahne pozisyonlar" etkinleştirin.
      Not: bir 30 s zaman aralığında en fazla 3 öğe kaydedilir.
3. Epi-floresan aydınlatma ile floresan boncuk göz veya bilgisayar ekranında, bulmak o zaman bir TIRF kanalı etkinleştirmek ve aydınlatma açısı TIRF aydınlatma gösteren bir değere ayarlayın. Auto-odak mikroskop panelde düğmeye basarak etkinleştirmek ve odak kaydırma tekerleği ile değiştirmek. Bir 2-renk veri kümesi, yani TIRF-488 ve TIRF-561, sonraki boncuk tabanlı görüntü kayıt için elde etmek (bkz: 3.1 üzerine gelin).
   1. İsteğe bağlı: TIRF aydınlatma sağlamak için birkaç microliters serbestçe yüzen floresan çok renkli boncuklar süspansiyon ekleyin (bkz: 1.3.2 gelin.). TIRF kanal canlı görünümünü etkinleştirmek ve aydınlatma açısı artar. Yapışık olmayan boncuk bir doğru TIRF aydınlatma⁸sağlanması kritik açı yok olacaktır.
4. Hücre süspansiyon tekrar 2 - 3 kez kapalı tüp ters çevirme tarafından mix ve hücrelerin 1 mL görüntüleme yemek için geçerlidir.
5. Hızlı bir şekilde düşük düzey epi-floresan aydınlatma içeren hücreleri çift transfected bulmak. Parlak alan aydınlatma kullanarak canlı kamera önizleme hücrelerde ortalayın ve konumunu işaretlemek. Başka bir 1-2 puan faiz bulmak ve konumları listesine kaydedebilirsiniz.
   Not: Başlangıçta, hücreleri kolayca sahne hareketi nedeniyle ayırmak, bu nedenle 4-5 pozisyonlar ayarlayabilir ve tüm resim alma başlamadan önce yeniden denetleyin. Daha sonra 1-2 pozisyonlar atmak.
6. Veri toplama "Sequence" butonuna basarak başlatın.

3. görüntü sonrası işleme ImageJ içinde

1. Kayıtsız hyperstack FIJI¹⁵dakika içinde oluşturmak için "SD-TIRF_helper" adlı bir makro 2-4 kanal SD-TIRF timelapse veri kümeleri için uygulanabilir yazılmıştır. Kurtarmak belgili tanımlık eğe "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" FİJİ'de üye aidatı-ağıl "Makrolar" ve menü komutu tıklatarak makro çalıştırma "Eklentiler > makrolar > Çalıştır...".
   1. Renk kanalları kayıt düzeltme gerekiyorsa, seçeneği seçin ve yeni bir boncuk tabanlı kayıt başvuru (dönüm noktası dosyası) oluşturun veya daha önce oluşturulmuş varolan bir dosyayı kullanmak.
      Not: Turboreg eklenti¹⁶ floresans boncuk başvuru görüntülere uygulanır. Eklenti FIJI yazılım eklenti yüklemeleri için genel yönergelere göre yükleyin.
   2. Biyo-biçimleri ithalatçı ile veri almak ve hyperstack olarak bir görüntüleme seçeneği seçin. Görüntü veri kümesi yüklemek için ilk adım ve ikinci adımda TIRF serisi SD-serisi seçin. FIJI kanal ve sahne konum, seçmiş olduğu her sahne pozisyon için bir hyperstack olarak normalde tüm SD-kanal ve tüm TIRF-kanal sırıtmak yani göre sıralanmış verileri görüntüler.
      Not: Veri içe aktarma örneğin TIFF-serisi veya platforma bağımlı dosya gibi türleri çeşitli dosya türlerinden mümkün mü * .nd. Yalnızca bağımsız, sıkıştırma-az TIFF biçimi olarak satın alma yazılım tarafından verilmedi Eğer dosya türü tanınamıyor.
   3. Kayıt düzeltme önceden belirlenmiş yerler dosyası yükleyerek ilgili kanallara uygulama.
   4. SD - ve TIRF her kanal için istenen renk arama tablosu (LUT) seçin ve bir tek, çok boyutlu hyperstack karıştırmak onları.
      Not: TIRF kanalları işlenirken, z-uçak sıfır yoğunluk değerleri ile bir dizi z-uçak SD veri kümesindeki numarasıyla eşleşen alt uçak üstüne eklenir. Bu son hyperstack görselleştirme için önemli bir adımdır. Bu metodoloji TIRF aydınlatma derinlik beri doğru olduğundan (200nm⁷) SD yığın z-adım boyutundan daha küçük daha azdır (400 nm).

Bir tahlil geliştirilmiştir SD-TIRF görüntüleme, potansiyelini göstermek için matris hücre adezyon kompleksleri ve sitoiskeleti onların etkileşim sırasında hücre adezyon spatio-temporal organizasyonu ortaya çıkarmak. Bu nedenle, yapışık HeLa ya da, alternatif olarak, NIH3T3 hücreleri RFP-Lifeact ile YFP-Vinculin 18-24 h için transfected trypsinized ve fibronektin kaplı cam alt yemekleri tohumlari. Bu hücre satırları kendi belirgin sitoiskeleti ve daha yüksek sağlamlık için canlı görüntüleme deneylerde, aksine Örneğin, primer hücre seçilmiştir. O çok hassas durumda tripsin tedavi sonrasında olduğu gibi görüntüleme karşı koymak değil. Mikroskop, YFP/RFP-ifade hücre seçildi ve yapışma işlemi sırasında 60 dk zaman hata (Şekil 2 ve film 1 ve 2) görülmektedir. Bu özel tahlil nadiren ve net değil edebiyat17,18içinde tanımlanmıştır. Ayrıca, adezyon oluşumunu çoğunlukla hücre19,20geçiş Örneğin içinde araştırmış. Böylece, biz bu yöntemi (hücre kültürünü, kaplama, orta, kompozisyon) Bu makalede açıklanan deneyler yürütmek için uyum için gerekli.

Oysa membran çıkıntılar çevre algılama ve yapım beklendiği gibi hücreleri yuvarlak şekilli başlangıç ve sadece zayıf yapışık, sonunda substrat ile temas. Hücre-matris kişiler hızlı bir şekilde sözde doğmakta olan yapışıklıklar20,21 (Şekil 2A, TIRF-488 kanal, zaman puan 0-4.5 dk) oluşumu güçlendirdi. İkinci nokta gibi Vinculin-pozitif hücre ventral kenarındaki yapılardır. Yapıları TIRF Albümdeki açıkça görülebilir. Adezyon oluşumunu başlangıçta, aktin hücreye eşit olarak dağıtılan ve erken bu komplekslerin (Şekil 2A, SD-561 kanal) yerelleştirmek değil. Saat boyunca yapışma kompleksleri genişlemiş ve odak yapışıklıklar (Şekil 2C) olgunlaştı. Bu uzun yapılar (Şekil 2A + B) hücre çevre ağırlıklı olarak görünür ve acto myosin lifleri tarafından sarf kuvvetlerinden sonuçlandı. Böylece onları hücre merkezine doğru çekerek ve hücre-matris yapışıklıklar yanı sıra aktin iplikleri21inci donatılacak güçlendirilmesi inducing yapışma kompleksleri için bağlanmak bu elyaf başladı. Görünüşe göre hücre aktin ağ oluşumu (Şekil 2A, XZ görünümü) bir sonucu olarak basık. Olarak yüksek hassasiyet, uzaysal çözünürlük ile ve tam bir bakış açısından bu işlem görselleştirme izin SD-görüntüleme yönteminin seçimi burada olmak için güvenli hale getirdin. SD-TIRF görüntüleme açıkça filopodia (2B şekil, süresi noktası 17 dk, beyaz ok ucu) ile dernek ortaya ise bir önceki rapor17' de TIRF yalnız sadece periferik yapışıklıklar, kökeni hakkında spekülasyon izin verirsin. Nitekim, aktin iplikleri centripetally fokal yapışıklıklar ortaya çıkan 27 MIN (Şekil 2B, sarı ok ucu) sonra görünür oldu.

Ancak, bu deneyleri, yani satın alma hızı, uyarma kazanç, yoğunluk ve dedektör satın alma ayarlarını gerekir dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. 30 s/timepoint, olanaklı kılmak multi noktası satın alma, aralığını uyarma lazer radyasyon yoğunluğu ideal gibi görünüyor (0.5-1 arasında W/cm²) altında kritik dikkate alınması gerekir. Şekil 2B bir hücre için belgili tanımlık substrate iliştirmek başarısız aynı deneyi farklı bir konumda görüntüler. Fototoksik etkileri sonunda membran sonra muhtemelen apoptosis (Movie 2) benzeyen 60 dk köpüren içinde sonuçlandı, hücre biyolojisi etkilenen olasılığı vardır. Bu daha ne kadar hassas hücreleri sil yapılan fototoksisite için tepki verebilir ve bu ışık miktarını arasında iyi bir denge koymak bulmak ve bilgiler alındı çıkarmak önemlidir. Lazer güç azaltılması, bir z-yığın veya kazanç artan görüntü sayısını fototoksisite azaltmak için doğru strateji olabilir. Tüm bu ayarlar, ancak, hala yeterince çözünürlük ve sinyal gürültü oranı, elde izin veren bir düzeyde kaydedilen zaman atlamalı Niceliksel bilgileri ayıklamak için etkinleştirme ayarlanmalıdır.

Şekil 1: şematik SD-TIRF kurulumunu çizim. A. SD görüntü modu: 6 farklı lazer satır (405/445/488/515/561/640nm, yeşil hat) confocal tarama birimi (CSU), SD (pozisyon 'İnç') ve bir boş filtre küp mikroskop vücuttaki (MIC) geçerek içine birleştiğinde. Floresans emisyon (SPEC) örnekten SD ve split iğne delikleri farklı Dikroik ayna, Örneğin yeşil/kırmızı veya sarı/mavi aynı anda satın alma, iki farklı EM-CCD kamera (C1 ve C2) üzerine tarafından öngörülmektedir. Floresans filtreler (gösterilmez) kameralar önünde yerleştirilir. B. TIRF görüntüleme modu: lazer satırları (TIRF) TIRF tarayıcıya birleştiğinde. MIC bir çok satırlı ışın bölücü ışın numune için yönlendirir ve ışık emisyon ekranı kaplamış iletimi için SD ('OUT') atlar. Floresans aynı kameralar tarafından algılanır ve emisyon açıklandığı A. filtreler Bu rakam Zobiak ve arkdeğiştirildi. 7 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: SD-TIRF mikroskobu kullanarak hücre yaymak ve yapışma oluşumu temsilcisi sonuçları. A. çift transfected HeLa hücre RFP-Lifeact (kırmızı, SD-561 kanal) ve YFP-Vinculin (yeşil, TIRF-488 kanal) ifade edildi trypsinized ve üzerine yeniden numaralı seribaşı fibronektin kaplı cam coverslips. Adezyon oluşumunu yaklaşık 5 dakika sonra daha büyük odak yapışıklıklar içine geliştirmek 0 dakika küçük doğmakta olan yapışıklıklar (Vinculin-olumlu noktalar) ile başlayan kolayca görünür hale gelir. Kortikal aktin 10 dakika sonra görülür ve çevre (çerçeveler bkz: 12 ve 24.5. dakikada) hücre genişletir. B. hücre yaymak ve doğmakta olan odak için yapışıklıklar gibi filopodia ilgili yapışıklıklar (beyaz ok ucu) ve stres fiber oluşumu (çerçeve 27. dakikada, bkz: geçiş (çerçeve) 45 dakika içinde kutulu bölgesinin büyütülmüş görünümü gösteriyor sarı ok ucu). A. ö . çizilmiş kesik çizgili sarı çizginin C. Kymograph (Fotoğraf-) Hücreleri veya aksi takdirde sağlıksız hücreleri üzerinde toksik etkileri onları belgili tanımlık substrate iliştirmek başarısız izin verebilirsiniz. Eleştirel fototoksisite dışlamak için değerlendirilmek üzere görüntüleme koşullarına sahip. Ölçek çubuğu 5 mikron = (a ve D) ve (içinde B ve C) 2 µm. İçinde A ve D vardır orada çizilmiş kesik beyaz çizgiler çıkarılan orthogonal projeksiyonlar XZ sayısı (alt yüzey =). Görüntüleri doğrusal olarak kontrast-artırılmış ve medyan 3 x 3 çekirdek ile filtre edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Film 1: 3D-Res. 2A timelapse sırayla inşası. Görüntü sırası ile 3D görüntüleme yazılımı hale oldu. Süre: 42,5 dk. alım oranı: 2 Çift kanal SD-TIRF yığınları / dakika (Toplam 56 çerçeveler) satın aldı. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Movie 2: Res. 2 C. timelapse sırayla film Süre: 60 dk. alım oranı: 2 Çift kanal SD-TIRF yığınları / dakika (Toplam 56 çerçeveler) satın aldı. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Yazarlar ifşa gerek yok.