Yöntem makalesi

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

DOI:

10.3791/58756

⸱

21 Ocak 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşam hücrelerinde adezyon oluşumunu gibi plazma zarı ve hücre iç kapsamlı yapısal değişiklikler gerektirir. Bu son derece dinamik olaylar görselleştirmek için canlı örnekleri hızlı görüntüleme sağlar iki tamamlayıcı ışık mikroskobu teknikleri kombine edilmiştir: hızlı ve yüksek çözünürlüklü ses kayıt ve toplam iç yansıma için disk mikroskobu (SD) iplik Floresan (TIRF) Mikroskopi için kesin yerelleştirme ve plazma zarı görselleştirme. Kapsamlı ve eksiksiz görüntüleme protokolü için numune hazırlama, mikroskop kalibrasyon, görüntü oluşumu ve satın alma rehberlik, çok renkli SD-TIRF canlı görüntüleme serisi yüksek spatio-zamansal çözünürlük ile sonuçlanan gösterilecek. Yani kayıt ve bireysel kanalları bileşimini, çok boyutlu canlı görüntüleme veri oluşturmak için tüm gerekli görüntü işleme adımları kendi yazılı bir makroda açık kaynak yazılımı ImageJ sağlanır. Başlatma sırasında floresan proteinlerin görüntüleme ve yapışma kompleksleri olgunlaşma yanı sıra aktin hücre iskeleti ağ oluşumu prensip bir kanıtı olarak bu yeni yaklaşımın için kullanıldı. Yüksek çözünürlükte 3D mikroskobu ve TIRF ile birlikte sağlanan bu karmaşık süreçler hücresel ortamı içinde ve aynı zamanda yüksek algılanan membran ilişkili moleküllerin kesin yerelleştirme ayrıntılı bir açıklaması sinyal arka plan oranı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim gün içinde sabit yüksek/super kararlılık düşsel ve yaşam numune sağlayan ışık mikroskobu teknikleri hızla gelişiyor. Süper çözümleme teknikleri gibi uyarılmış emisyonu yapısal azalması (STED), ışık mikroskobu (SIM) ve fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) veya doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına), sırasıyla, vardır piyasada bulunan ve görüntüleme ayrıntıları neredeyse moleküler ölçek1,2,3,4,5,6' da gösterilen hücre altı yapıları etkinleştirin. Ancak, bu yaklaşımların hala geniş hacimli birden çok çerçevelemek-de ikinci Alım hızı ile görüntülenmeyecektir gereken canlı görüntüleme deneyler için uygulanabilirliği sınırlıdır. Plazma zarı ile Örneğin endo - düzenlenmiş Son derece dinamik süreçler çeşitleri / ekzositozu, adezyon, geçiş veya sinyal, ortaya büyük hücresel birimleri içinde yüksek hız ile. Son zamanlarda, bu boşluğu doldurmak için bir tümleşik mikroskobu tekniği önerilen denilen dönen disk-TIRF (SD-TIRF)7oldu. Özellikle yalıtmak ve plazma zarı8,9yerelleştirilmesine, iken SD mikroskobu en hassas ve hızlı görüntüleme teknikleri görselleştirme ve takibi için yaşamak için izin verir ayrıntılı olarak TIRF mikroskobu hücre altı organelleri sitoplazma10,11. Her iki görüntüleme teknikleri içinde a tek tertibat birleşimi zaten son12,13' te fark, ancak, burada sunulan (Şekil 1) mikroskop nihayet canlı görüntüleme SD-TIRF deneyleri gerçekleştirmek için ölçütleri karşılayan 3 çerçevelemek-de ikinci hız, söz konusu süreçleri. Bu mikroskop ticari olarak mevcut olduğundan, bu yazının amacı detaylı olarak tarif ve açık kaynak araçlar ve protokoller için resim alma, kayıt ve SD-TIRF mikroskobu ile ilişkili görselleştirme sağlar olduğunu.

Kurulum iki tarama birimlerine bağımsız bağlantı noktaları üzerinden bağlı bir ters mikroskobu dayanmaktadır - sol bağlantı noktası SD birim ve tarayıcı ünitesini geri bağlantı noktasına TIRF ve fotoğraf-harekete geçirmek /-beyazlatma için bağlı olduğu deneyler. 6 lazerler (405/445/488/515/561/640 nm) uyarma için kullanılabilir. Uyarma ve algılama floresans sinyalinin ya 100 x / NA1.45 yağ veya 60 x / NA1.49 petrol TIRF amaç, sırasıyla, istihdam. Verilmiş ışık bölünmüş bir Dikroik ayna tarafından (561 nm uzun-pass veya 514 nm uzun taramalı) ve çeşitli bant geçiren filtre tarafından filtre (55 nm geniş 525 merkezli nm, 54 609 merkezli nm geniş nm için yeşil ve kırmızı floresans, sırasıyla) iki EM-CCD cam önünde yer devirlerde. Lütfen kurulumu hakkında daha fazla teknik bilgi Zobiak vd. listelenen Not 7. TIRF yapılandırmada, SD birim içinde ışık yolu yaklaşık 0,5 dışına taşınır s böylece aynı iki fotoğraf makinesi-ebilmek var olmak kullanılmış için algılama, 1 karşılaştırıldığında iki görüntüleme yöntemleri arasında daha hızlı geçiş izin geçmişte bildirildi s13 < /C2 >. Bu özellik, Çift kanal aynı anda satın alma sağlar, böylece SD-TIRF, daha önce eşsiz hız Imaging 4 kanalları ve doğruluk gerçekleştirilebilir. Ayrıca, SD ve TIRF görüntüleri arasında uyum gereksizdir. Resim hizalaması iki kamera arasında ancak, deneme başlamadan önce kontrol edilmesi ve gerekirse düzeltilmiş var. Aşağıdaki protokolünde bir kayıt düzeltme rutin bir kendi kendini yazılı ImageJ makrosunda uygulanmıştır. Ayrıca, makro ağırlıklı olarak SD - ve onların farklı dimensionality rağmen TIRF veri kümeleri bir eş zamanlı görselleştirme izin vermek için tasarlanmıştır. Satın alma yazılım bu özellikler sağlamadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre hazırlanması

  1. İki gün önce deney 6-şey hücre-kültür plaka kuyu başına tam büyüme ortamının 2 mL 3 * 105 HeLa veya NIH3T3 hücrelerde tohum. Hücreleri bir laminar akış başlıklı bu protokolü boyunca işlenir emin olun.
  2. Bir gün önce deneme, üreticinin önerilerini veya ampirik olarak kararlı bir iletişim kuralı, Örneğingöre transfection reaktifler hazırlayın:
    1. Teklif toplama-Lifeact 1 µg sulandırmak ve YFP-Vinculin 1 µg toplam 200 µL serum orta düşük. Girdap transfection reaktif kısaca, 4 µL 200 µL DNA ve girdap yeniden add. Transfection karıştırmak için 15-20 dk oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. Tüm transfection karışımı dropwise doğrudan hücrelere ekleme. Plaka sallayarak karıştırın ve geri kuluçka makinesi yerleştirin.
  3. Deneme günü, canlı görüntüleme için örnek hazırlayın:
    1. Bir 35 mm cam alt tabak cam yüzey kat için PBS fibronektin 10 µg/mL çözeltisi hazırlamak. Sadece yüksek kaliteli 0,17 mm cam coverslips en iyi TIRF performans için kullanın ve plastik alt yemekler kaçının. Çözüm için oda sıcaklığında 30 dk sonra kaldırın ve kurumasına izin çanak cam yüzeyde ayrılacaklar.
    2. 1.8 x 109 parçacıklar mL distile su içinde başına yoğunluğunun 0,1 µm çok floresan boncuk çözüm sulandırmak ve 30-60 s için çözüm için fibronektin kaplı cam yüzey ekleyin. Hemen çözüm kaldırmak ve kurumasına izin çanak.
      Not: TIRF uçak önce hücreleri tohum ve/veya boncuk tabanlı görüntü kayıt için 2-renk referans görüntü elde etmek için yalnızca bulunmak, bu adım gereklidir.
    3. 0.1 M askorbik asit (AA) çözüm hazırlamak ve büyüme orta (AA-orta) 0.1 mM son bir konsantrasyon oranında seyreltin. Çözüm 37 ° C su banyosu içinde bir yer.
      Not: floresan optimize edilmiş hücre kültür ortamı mümkünse, böyle gibi phenolred ücretsiz kullanımı ve (ribo-) orta flavin azaltılmış. AA Fototoksik efektler canlı görüntüleme14sırasında azaltabilir bir anti-oksitleyici ajan var. Biz-si olmak sınav o başarıyla bu tahlil, daha fazla hücre daha AA ek uygulanan koşullar altında sağlıklı çıktı yani . Ancak, ortam pH 0,17 pH birimleri tarafından indirdi.
    4. 2 mL PBS hücrelerle yıka, 250 µL eklemek tripsin-EDTA ve beklemek-e kadar tamamen hücrelerdir (2-3 dk 37 ° C kuluçka) ilişkisi kesildi. Resuspend 1 mL dikkatle hücrelerde önceden ısınmış AA-orta bir pipet ile ve 4 mL AA-orta bir 15 mL hücre kültür tüp ekleyin. Hücre süspansiyon biraz açılan bir kapak ile mikroskop civarında 37 ° C ve % 5 CO2 ye ayarla bir kuluçka yerleştirin.
    5. 1 mL ön cam alt yemek için AA-orta ısıttı ve önceden ısıtılmış mikroskop tutucuya yerleştirin ekleyin (sonraki paragrafa bakınız).

2. canlı görüntüleme

  1. Bir kararlı 37 ° C, % 5 CO2 ve nemli atmosfer elde etmek için mikroskop çevresel kontrolünü başlatın.
    Not: Burada, küçük sahne en iyi kuluçka odası yaklaşık 15 dk. daha büyük İnkübatörler içinde izin verilen istikrarlı ayarlar istikrarlı koşulları elde etmek için daha fazla zaman gerekir kullanılmıştır.
  2. Hücre süspansiyon uygulanmadan önce tüm satın alma ayarları mikroskop saptamak:
    1. 30 için zaman aralığı ayarlarken s ve süresi 60-90 dk. için donanım tabanlı otomatik odaklama her zaman noktası ("1" değeri) için otomatik odaklama işlevi etkinleştirmek.
    2. Fotoğraf makinesi pozlama ve kazanç yanı sıra lazer güç her kanal için ayarlayın. Yüksek kazanç seviyeleri, düşük çekim hızı ve düşük lazer güç fotoğraf-toksisite azaltmak için tavsiye.
      Not: burada sunulan veri 200 ms pozlama ile satın alınmıştır, 0,5 W/cm² 488 için uyarma yoğunluklarda eşittir düzeyini 500 ve %20 lazer güç kazanmak nm ve 1 W/cm² 561 için nm, anılan sıraya göre.
    3. Z-yığın iplik-disk kanallar için 10 µm 0.4 µm aralığı ayarlayın. Z-yığınları TIRF kanallar için de-harekete geçirmek. Alt-ofset "0" En düşük uçak olacak yani donanım auto-odak odak konumunu ayarlayın.
    4. Çok noktalı işlevi "sahne pozisyonlar" etkinleştirin.
      Not: bir 30 s zaman aralığında en fazla 3 öğe kaydedilir.
  3. Epi-floresan aydınlatma ile floresan boncuk göz veya bilgisayar ekranında, bulmak o zaman bir TIRF kanalı etkinleştirmek ve aydınlatma açısı TIRF aydınlatma gösteren bir değere ayarlayın. Auto-odak mikroskop panelde düğmeye basarak etkinleştirmek ve odak kaydırma tekerleği ile değiştirmek. Bir 2-renk veri kümesi, yani TIRF-488 ve TIRF-561, sonraki boncuk tabanlı görüntü kayıt için elde etmek (bkz: 3.1 üzerine gelin).
    1. İsteğe bağlı: TIRF aydınlatma sağlamak için birkaç microliters serbestçe yüzen floresan çok renkli boncuklar süspansiyon ekleyin (bkz: 1.3.2 gelin.). TIRF kanal canlı görünümünü etkinleştirmek ve aydınlatma açısı artar. Yapışık olmayan boncuk bir doğru TIRF aydınlatma8sağlanması kritik açı yok olacaktır.
  4. Hücre süspansiyon tekrar 2 - 3 kez kapalı tüp ters çevirme tarafından mix ve hücrelerin 1 mL görüntüleme yemek için geçerlidir.
  5. Hızlı bir şekilde düşük düzey epi-floresan aydınlatma içeren hücreleri çift transfected bulmak. Parlak alan aydınlatma kullanarak canlı kamera önizleme hücrelerde ortalayın ve konumunu işaretlemek. Başka bir 1-2 puan faiz bulmak ve konumları listesine kaydedebilirsiniz.
    Not: Başlangıçta, hücreleri kolayca sahne hareketi nedeniyle ayırmak, bu nedenle 4-5 pozisyonlar ayarlayabilir ve tüm resim alma başlamadan önce yeniden denetleyin. Daha sonra 1-2 pozisyonlar atmak.
  6. Veri toplama "Sequence" butonuna basarak başlatın.

3. görüntü sonrası işleme ImageJ içinde

  1. Kayıtsız hyperstack FIJI15dakika içinde oluşturmak için "SD-TIRF_helper" adlı bir makro 2-4 kanal SD-TIRF timelapse veri kümeleri için uygulanabilir yazılmıştır. Kurtarmak belgili tanımlık eğe "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" FİJİ'de üye aidatı-ağıl "Makrolar" ve menü komutu tıklatarak makro çalıştırma "Eklentiler > makrolar > Çalıştır...".
    1. Renk kanalları kayıt düzeltme gerekiyorsa, seçeneği seçin ve yeni bir boncuk tabanlı kayıt başvuru (dönüm noktası dosyası) oluşturun veya daha önce oluşturulmuş varolan bir dosyayı kullanmak.
      Not: Turboreg eklenti16 floresans boncuk başvuru görüntülere uygulanır. Eklenti FIJI yazılım eklenti yüklemeleri için genel yönergelere göre yükleyin.
    2. Biyo-biçimleri ithalatçı ile veri almak ve hyperstack olarak bir görüntüleme seçeneği seçin. Görüntü veri kümesi yüklemek için ilk adım ve ikinci adımda TIRF serisi SD-serisi seçin. FIJI kanal ve sahne konum, seçmiş olduğu her sahne pozisyon için bir hyperstack olarak normalde tüm SD-kanal ve tüm TIRF-kanal sırıtmak yani göre sıralanmış verileri görüntüler.
      Not: Veri içe aktarma örneğin TIFF-serisi veya platforma bağımlı dosya gibi türleri çeşitli dosya türlerinden mümkün mü * .nd. Yalnızca bağımsız, sıkıştırma-az TIFF biçimi olarak satın alma yazılım tarafından verilmedi Eğer dosya türü tanınamıyor.
    3. Kayıt düzeltme önceden belirlenmiş yerler dosyası yükleyerek ilgili kanallara uygulama.
    4. SD - ve TIRF her kanal için istenen renk arama tablosu (LUT) seçin ve bir tek, çok boyutlu hyperstack karıştırmak onları.
      Not: TIRF kanalları işlenirken, z-uçak sıfır yoğunluk değerleri ile bir dizi z-uçak SD veri kümesindeki numarasıyla eşleşen alt uçak üstüne eklenir. Bu son hyperstack görselleştirme için önemli bir adımdır. Bu metodoloji TIRF aydınlatma derinlik beri doğru olduğundan (200nm7) SD yığın z-adım boyutundan daha küçük daha azdır (400 nm).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir tahlil geliştirilmiştir SD-TIRF görüntüleme, potansiyelini göstermek için matris hücre adezyon kompleksleri ve sitoiskeleti onların etkileşim sırasında hücre adezyon spatio-temporal organizasyonu ortaya çıkarmak. Bu nedenle, yapışık HeLa ya da, alternatif olarak, NIH3T3 hücreleri RFP-Lifeact ile YFP-Vinculin 18-24 h için transfected trypsinized ve fibronektin kaplı cam alt yemekleri tohumlari. Bu hücre satırları kendi belirgin sitoiskeleti ve daha yüksek sağlamlık için canlı görüntüle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda SD ve TIRF mikroskobu canlı hücre görüntüleme deneyler, yani yüksek edinme oranları 3 farklı aşamada dakikada 2 SD-TIRF görüntü yığınları gibi gerçekleştirmek için uygun bir yapılandırmadaki ilk başarılı uygulanması sunuldu Toplam 168 kare (yaklaşık 3 kare / saniye), karşılık gelen pozisyonlar, satın alınan. Vardı birkaç SD-TIRF mikroskoplar, daha önce12,13, ağırlıklı olarak hangi hücresel süreçler 3D takip etmek yeterince yüksek görüntüleme hı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz büyük ölçüde bilimsel topluluk, Üniversitesi Tıp Merkezi Hamburg-bize örnek değerlendirme için destek için Eppendorf teşekkür ederim. Yani, biz Sabine Windhorst NIH3T3 hücrelerin, Andrea Mordhorst YFP-Vinculin için ve Maren Rudolph RFP Lifeact için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mikroskop ve aksesuarları
SD-TIRF mikroskobuVisitron Systems
TiNikonTers mikroskop standı
CSU-W1 T2YokogawaÇift kamera konfigürasyonunda dönen disk ünitesi
iLAS2 Roper ScientificTIRF/FRAP tarayıcı
Evolve PhotometrixEM-CCD kameralar
PiezoZ aşamasıLudl Elektronik ÜrünlerMotorlu Z aşaması
Bioprecision2 XY aşamasıLudl Elektronik ÜrünlerMotorlu XY aşaması
Sahne üstü kuluçka odasıOkolabKalın ÇizgiSıcaklığı, CO2< / sub> ve nem kaynağı
Hücre kültürü< / güçlü>
HeLa rahim ağzı kanseri hücreleriDSMZACC-57
NIH3T3 fibroblastlarDSMZACC-59
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco14190144
Tripsin-EDTA %0.05Gibco25300054
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070Azaltılmış serum ortamı
Fetal buzağı serumu (FCS)Gibco10500064
Penisilin/Streptomisin (PenStrep)Gibco15140148
Tam büyüme ortamı (%10 FCS ve %1 PenStrep ile desteklenmiş DMEM)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfeksiyon reaktif
Askorbik asit (AA)SigmaA544-25G
6 oyuklu hücre kültürü plakasıSarstedt83.392
Cam alt tabaklarMatTekP35G-1.5-10-C35mm, 0.17mm cam lamel
Fibronektin, sığır plazmasıThermoFisher Scientific33010018
Neubauer geliştirilmiş odaVWR631-0696
TetraSpeck boncuklarıThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactMaren Rudolph, Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü, Hamburg Üniversitesi Tıp Merkezi, Eppendorf, Almanya
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü, Hamburg Üniversitesi Tıp Merkezi Eppendorf, Almanya
Yazılım ve eklentiler
VisiViewVisitron SystemsSürüm 3
ImageJSürüm 1.52c
Turboreg eklentisihttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Makro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"bu yayınhttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerSürüm 6.2.2
Mükemmel odak sistemine sahip

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

İlgili makaleler