Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lipoaspirates mekanik mikronize rejeneratif Terapisi için

7.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/58765

⸱

15 Mart 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, stromal vasküler kesir emülsifikasyon ve birden çok centrifugations kapsayan mekanik işlemler bir dizi Yağ dokusundan elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Stromal vasküler kesir (SVF) çeşitli hastalıklar için yenileyici bir araç haline gelmiştir; Ancak, mevzuat kesinlikle collagenase kullanarak hücre ürünlerin klinik uygulama düzenlemektedir. Burada, SVF hücreleri ve yerel hücre dışı matriks enjekte edilebilir bir karışımı yağ dokusu tamamen mekanik bir işlem tarafından oluşturmak için bir protokol mevcut. Lipoaspirates bir santrifüj koymak ve 1200 x g 3 dk de döndü. Orta tabaka toplanır ve (yüksek yoğunluklu alt) ve düşük yoğunluklu yağlı üst iki katmanlara ayrılmış. Üst katman doğrudan intersyringe, 6 x 8 x için 20 mL/s hızında değişen emülsiyon. Emülsifiye yağ 2.000 x g 3 min için de centrifuged ve yapışkan madde yağ tabakası altında toplanan ve hücre dışı Matriks (ECM) tanımlanan / SVF-jel. Üst katmanı yağlıboya toplanır. Yaklaşık 5 mL yağı 15 mL yüksek yoğunluklu yağ eklenir ve intersyringe, 6 x 8 x için 20 mL/s hızında değişen emülsiyon. Emülsifiye yağ 2.000 x g 3 dk de centrifuged, ve yapışkan madde de ECM/SVF-jel. Çıplak fareler içine ECM/SVF-jel nakli sonra rüşvet hasat ve histolojik bir sınava tabi. Sonuçta bu ürün normal yağ dokusu yeniden oluşturmak için potansiyele sahip olduğunu gösterir. Bu yordamı rejeneratif amaçlar için onların doğal destekleyici ECM gömülü SVF hücreleri yoğunlaşmak için basit, etkili mekanik ayrışma bir işlemdir.

Giriş

Böylece çeşitli hastalıkları1için alternatif bir tedavi rejimi sunabilir kök hücre tedavileri bir paradigma kayması doku onarımı ve yenilenme için sağlar. Kök hücreleri (örneğin, İndüklenmiş pluripotent kök hücreler ve embriyonik kök hücre) büyük tedavi potansiyel ama hücre düzenleme ve etik kaygılar nedeniyle sınırlıdır. Yağ elde edilen Mezenkimal stromal/kök hücreler (ASCs) lipoaspirates ve aynı sınırlamalarına tabi değil almak kolaydır; Böylece, bu pratik rejeneratif tıp2için bir ideal hücre türü haline gelmiştir. Buna ek olarak, onlar nonimmunogenic ve Otolog yağ3bol kaynaklara sahip.

Şu anda, ASCs esas olarak collagenase-aracılı hazım yağ dokusu tarafından elde edilir. Yağ dokusu stromal vasküler kesir (SVF) ASCs, endotelyal progenitor hücre, perisitlerden ve bağışıklık hücreleri içerir. Enzimatik SVF/ASCs yüksek yoğunluğu elde etmek faydalı etkileri olduğu gösterildi rağmen birçok ülke mevzuatında kesinlikle collagenase4kullanarak hücre tabanlı ürünlerin klinik uygulama düzenlemektedir. Yağ dokusu ile collagenase 30 dk SVF hücreleri elde etmek için 1 h için sindirerek eksojen her iki malzeme hazırlama ve biyolojik kirlenme riski artar. Yapisan kültür ve gün hafta için alır, ASCs, arıtma belirli labaratuar donanımları gerektirir. Ayrıca, çoğu çalışmalarda, süspansiyon SVF hücreleri ve ASCs kullanılır. Hücre dışı Matriks (ECM) veya başka bir taşıyıcı korumasız boş hücre güvenlik açığından etkilenir, zavallı hücre saklama enjeksiyon sonra neden ve tedavi sonucu5uzlaşma. Tüm bu nedenlerle daha fazla uygulama kök hücre tedavisinin sınırlayın.

ASCs collagenase-aracılı sindirim olmadan Yağ dokusundan elde etmek için aralıklarla, doğrama, parçalama, püre ve kıyma, mekanik dahil olmak üzere çeşitli mekanik işleme yordamları gelişmiş6,7 olmuştur , 8 , 9. bu yöntem doku ve ASCs mekanik olarak olgun adiposit ve onların yağ içeren veziküller kesintiye tarafından yoğunlaşmak düşünülmektedir. Ayrıca,8,9,10hayvan rejeneratif tıp modelleri gibi ASCs, yüksek konsantrasyonda içeren bu hazırlıklar, önemli bir tedavi potansiyel gösterdi.

2013 yılında, Tonnard ve ark. emülsifiye lipoaspirates11işleme intersyringe tarafından üreten içerir tekniği aşılama nanofat tanıttı. Değişen intersyringe tarafından oluşturulan kesme Kuvvetleri seçmeli olarak olgun adiposit zarar verebilir. Onların bulgularına dayanarak, sadece SVF hücreleri ve ECM/SVF-jel12fraksiyonlara ECM bırakarak lipoaspirates, lipid ve sıvı çoğunu kaldırır bir tamamen mekanik işleme yöntemi geliştirdi. Burada, insan kaynaklı yağ dokusu ECM/SVF-jel üretmek için mekanik sürecinin ayrıntıları açıklamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu araştırma etik teftiş kuruluna Nanfang hastanesine, Guangzhou, Çin tarafından kabul edildi. Yağ dokusu bağışçılardan çalışma katılmak için yazılı onay veren sağlıklı toplanmıştır. Tüm hayvan deneyleri Nanfang Hastanesi kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve ulusal sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (Çin) kurallarına göre yapılır.

1. ECM/SVF-jel hazırlık

  1. Hasat yağ.
    1. Liposuction bir insan 1 mm çapında,-0.75, birkaç keskin tarafı delik içeren bir 3 mm birden çok bağlantı noktalı kanül ile gerçekleştirmek atm emme baskı.
    2. 200 mL steril bir torbaya lipoaspirates toplamak.
  2. Coleman yağ hazırlayın.
    1. Lipoaspirates dört 50 mL tüpler içine aktarmak ve hala 10 dakikadır durmak hasat yağ sağlar.
    2. Yağ üst katmanda iki 50 mL tüpler içine aktarmak için geniş uçlu pipet kullanarak toplama ve alt katmanında sıvı kısmını atın.
    3. 50 mL tüpler, centrifugate yağ katman 3 dakikadır vasıl 1200 x g oda sıcaklığında (RT) kullanarak.
    4. Üst katmanı (yaklaşık 80 mL) Coleman fat olarak tanımlayın.
    5. Geniş uçlu pipet kullanarak 20 mL tüp üst 2/3 Coleman yağ aktarmak ve bu bölümü düşük yoğunluklu fat olarak tanımlayın.
    6. Geniş uçlu pipet kullanarak başka bir 20 mL tüp alt 1/3 Coleman yağ aktarmak ve bu bölümü yüksek yoğunluklu fat olarak tanımlayın.
  3. ECM/SVF-jel düşük yoğunluklu yağ üretmek.
    1. Düşük yoğunluklu yağ 20 mL intershift bir erkek erkek radarı-Lock konektörü (ile 2.4 mm bir iç çapı) tarafından bağlı iki 20 mL şırınga kullanarak.
    2. Değişen hız (20 mL/s) sabit tutmak ve 6 x 8 x için yineleyin.
    3. Centrifugate 2.000 x g de RT 3 dk karisimin.
    4. Geniş uçlu pipet RT için daha fazla kullanılmasını kullanarak üstünde belgili tanımlık tepe 10 mL tüp içinde petrol bölümü toplamak.
    5. Yapışkan madde ECM/SVF-jel (şekil 1A), geniş uçlu pipet kullanmaktır, Orta tabaka içinde toplamak ve sıvı alt katmanında atın.
  4. ECM/SVF-jel yüksek yoğunluklu yağ üretmek.
    1. 5 mL (--dan adım 1.3.4 toplanan) yağı 15 mL yüksek yoğunluklu yağ ekleyin.
    2. Karma yağ şırınga 6 arasında intershift x 8 x kadar bir flocculate emülsiyon içinde görülmektedir.
    3. Centrifugate 2.000 x g de RT 3 dk karisimin.
    4. Petrol kısmı üst üzerinde atmak.
    5. Orta tabaka (ECM/SVF-jel) yapışkan madde geniş uçlu pipet kullanarak toplama ve sıvı alt katmanında atın.
    6. ECM/SVF-jel adımlardan 1.3.5 ve 1.4.5 karıştırın.

2. çıplak fare ECM/SVF-jel greft modeli

  1. Çıplak fareler anestezi (8 hafta yaşlı, kadın) ile isoflurane (% 1-%3) inhalasyon anestezi bir hayvan operasyon odasında.
  2. ECM/SVF-jel 1 mL şırınga aktarın.
  3. 1 mL şırınga künt infiltrasyon kanül ile bağlayın.
  4. Kanül subkutan fare her kanat yerleştirin.
  5. ECM/SVF-jel 0.3 mL enjekte.

3. doku 3, 15 ve 90 gün sonra ECM/SVF-jel enjeksiyon hasat

  1. Fareler isoflurane (% 1-%3) ile anestezi inhalasyon anestezi.
  2. Fareler servikal çıkığı yöntemi tarafından kurban.
  3. Bir kesi ile Cerrahi makas fare dorsal cilt orta hat olun.
  4. İncelemek ve fare her iki tarafında yağ greft hasat. Yağ greft %4 paraformaldehyde RT, bir gecede katıştırın.
  5. Etanol konsantrasyonları artan doku kurutmak: % 70 etanol, iki değişiklik, 1 h her; % 80 etanol, bir değişiklik, 1 h; % 95 etanol, bir değişiklik, 1 h; % 100 etanol, üç değişiklik, 1,5 saat; Ksilen, üç değişiklik, 1,5 saat.
  6. Parafin balmumu (58-60 ° C), iki değişiklik, 2 h ile doku sızmak.
  7. Doku parafin blok embed. Yaklaşık 4 µm kalınlığa, bölümleri ve onları slaytlar üzerine koydu.

4. Hematoksilen ve Eozin boyama

  1. Parafin blok slaytlar ıslatarak onları Ksilen içinde ı, II ve III (10 dk her) deparaffinize.
  2. Onları konsantrasyonlarda (% 100, % 100, % 95, % 80'i, % 70) azalan üzerinden geçerek doku bölümleri suyla temasa 3 min için etanol hamamları.
  3. Distile su (5 dk) doku bölümlerde durulayın.
  4. Hematoksilen 5 min için doku bölümlerde leke.
  5. Musluk suyu 20 dk. Decolorize için % 1 asit alkol çalışan doku bölümleri durulama (% %1 70 alkol HCl) bölümleri tekrar maviye dönüşene kadar akan musluk su içinde 5 s. durulama için.
  6. Eozin Y boya doğrudan slayt pipet tarafından üzerine 2-3 damla ekleyin ve 10 dakikadır ayarla boya izin.
  7. Slaytları musluk suyu 1-5 dakika yıkayın.
  8. Konsantrasyonlarda (% 70, %80, % 95, % 100, % 100) artan slaytlar kurutmak 3 min için etanol.
  9. Temizleyin Ksilen içindeki slaytları ı ve II 5 dk her.
  10. Ortam takma içinde slaytlar bağlayın.

5. immünfloresan boyama

  1. Deparaffinize Ksilen doku bölümlerde ı, II ve III (5 dk her).
  2. Doku bölümleri farklı konsantrasyonlarda (% 100, % 100, % 95, % 95, % 70) geçerek suyla temasa 3 min için alkol hamamları.
  3. RT, metanol 10 min için bir % 3 H2O2 çözümde bölümlerde kuluçkaya.
  4. Durulama kaymak 2 x ile distile su, 5 dak.
  5. Slaytları bir slayt sepete at. 10 mM sitrat arabellek (pH 6.0) 300 mL ekleyin ve 10 min 95-100 ° C'de slaytlarını kuluçkaya.
  6. RT slayt 20 dk için ne yapıyorsun?
  7. Durulama kaymak 2 x fosfat tamponlu tuz (PBS), 5 min ile.
  8. 100 µL % 10 fetal sığır serum slayda ekleyin ve 1 h için RT, oksijen bir odasında kuluçkaya.
  9. Birincil antikor çözüm (eskiden şiling şimdi domuz Anti-fare Perilipin, 1: 400) 4 ° C'de bölümlerle gecede kuluçkaya.
  10. PBS 3 kaydıraklı durulama x, 5 dak.
  11. İkincil antikor çözüm bölümlerle kuluçkaya (keçi Anti-eskiden şiling şimdi domuz-488 IgG) için 2 h RT.
  12. PBS 3 kaydıraklı durulama x, 5 dak.
  13. Temiz kağıt mendil ile bölüm etrafında su yok etmek.
  14. ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve Alexa Fluor 488 Birleşik isolectin kısmındaki slayt üzerinde karşılamak için çember içine bırakın.
  15. Coverslips dağ ve koyup karanlıkta kuruyuncaya kadar bırakın.
  16. Slaytlar ile floresan mikroskop gözlemlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Coleman yağ ECM/SVF-jel için işleme sonra atılan petrol hacmi son hacim % 80'i kadar alır ve yağ dokusu korunmuş yağ tabakasının altında sadece % 20'si ECM/SVF-jel (şekil 1A) kabul edilir. ECM/SVF-jel 27 G ince iğne ile gitmesini sağlar pürüzsüz bir sıvı gibi doku vardır; Ancak, Coleman yağ büyük lifleri ile ayrılmaz bir yağ yapısının oluşur ve sadece 18 G kanül (şekil 1B) ile devam edebilirsiniz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kök hücre tabanlı rejeneratif terapisi büyük potansiyel yarar farklı hastalıklarda göstermiştir. Kolay elde etmek ve doku onarımı ve roman doku15rejenerasyon için kapasitesine sahip oldukları için ASCs en iyi tedavi adaylardır. Ancak, hücreleri ve collagenase6işlemek için izole etmek için karmaşık prosedürler gerektirdiğinden klinik uygulama, genişleyen sınırlamalar vardır. Böylece, kök hücre collagenase kullanımı olmadan elde etmek için basit bir teknik geliştirmek esastır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser desteklenmiştir (81471881, 81601702, 81671931) Çin'in Ulusal Doğa Bilim Vakfı, Guangdong Eyaleti Çin (2014A030310155) ve Nanfang hastane yöneticisi Foundation (2014B009, doğal Bilim Vakfı tarafından 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488-konjuge izolektin GS-IB4Moleküler ProblarI21411
kobay anti-fare perilipinProgenGP29
DAPIThermofisherD1306
geniş uçlu pipetCelltreat229211B
Konfokal mikroskop ve nbsp;Leica TCS SP2
çıplak güzel Güney Mdical Üniversitesi/
ışık mikroskobu Olympus/
50 mL tüpCornig430828
steril torbaLaishi/
mikrotomLeica CM1900
santrifüjHeraus

Kaynaklar

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693(2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Stromal Vasküler FraksiyonLipoaspirat İşlemeEkstrasellüler Matriks JeliAdipoz Doku RejenerasyonuŞırıngalar Arası AktarımSantrifügasyon ProtokolüAkış Sitometrisi AnaliziTaramalı Elektron MikroskobuNüd Fare Transplantasyonu
Lipoaspirates mekanik mikronize rejeneratif Terapisi için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.