Sunulan belirli bir kompost bakteri ve mantar büyüme Rhizoctonia solanibastırmak bulunma olasılığı olup olmadığını belirlemek bir plaka rekabet tahlil için bir protokoldür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir plaka rekabet tahlil olarak hastalık bastırma hızlı bir ön değerlendirme
Bu makalede
Özet
Özet
Geliştirmek ve hastalık süpresif yetenek soilborne mantar Rhizoctonia solanikarşı belirli bir kompost algılamak için bir basit, uygun fiyatlı ve etkili bioassay en iyi duruma getirmek için hedefi oldu. R. solani bitki ana bilgisayarlar dünya çapında geniş bir patojen var. Mantar ve topraklarda bir cimri hayatta basit su agar medyada hızla büyür. Plaka tahlil onların yetenek R. solanibüyümesini yavaşlatmak kompost karşılaştırmak için hızlı bir yöntemdir. Tahlil de Alternaria erken korumalılar, Fusarium solgunluğu, Phytophthora kök çürüklüğü ve Pythium kök çürüklüğü gibi toprakta saprophytes olarak hayatta diğer soilborne fungal patojenlerin bastırılması ile karşılıklı olarak ilişkilendirir.
Giriş
Rhizoctonia temsil eden mantarlar, hangi Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, geniş bir kompleks (Galatasaray Rhizoctonia solani Kühn =) olan kök çürüklüğü ve sönümleme kapalı1neden olan patojen. Rhizoctonia solani agresif bir patojen ve olumsuz çevre koşulları1altında sclerotia olarak yaşayabilir bir cimri olduğunu. Sonuç olarak, bu bir genel dağıtım ve hastalık çeşitli bitki ana Solanaceae, baklagiller, bitki ve ciddi ekonomik kayıplar sonucu turpgiller gibi birine neden olabilir.
Kompost biyolojik maddeler, bazı bitki patojenleri2için liman kapasitesine sahiptir. Ancak, tüm kompost birbirine ne de onlar tüm patojenler etkiler benzer şekilde3. Ahşap tabanlı karbon saman veya saman-karbon kompost tabanlı daha yüksek lignin selüloz oranlarına sahiptir. R. solani hazır karbon saman bulundu tercih ediyor. Buna ek olarak, karbon hazır daha az olduğunda Trichoderma spp. gibi biyolojik mücadele mantarlar daha etkilidir. Faydalı mantar ve bakteri kompost içine bitki hastalık ile rekabet, husumet veya bitki büyüme3düzenleyen gizle. Önerilen tahlil öncelikle üretim antibiyotikler, ecoenzymes veya patojen için zararlıdır şelatörlerin yarattığı husumet algılar.
Bitki biyoanalizler kompost lehine veya bitki büyüme4caydırmak olup olmadığını belirlemek için bir altın standarttır. Ancak, çoğu bitki biyoanalizler ay için zaman alıcı (hafta) hangi-ebilmek var olmak istenen ve bitki kök sistemleri şiddetini ölçmek için kökleri ile ayıklamak için daha fazla emek gerektiren daha uzun tamamlamak için. Nispeten sağlam, ama daha hızlı (gün) deneyleri kalite kontrol programları için ideal olacaktır. Bu kağıt amacı kompost süpresif potansiyel tahmin etmek için nispeten hızlı ve doğru bir test göstermektir. Yöntem Alfano et al. sonra desenli 5 iki istisna dışında kompost özleri seyreltilmiş ve su agar patates dekstroz agar (PDA) yerine kullanılmıştır. PDA bakteri ve kültür6kontamine diğer mantar büyüme terfi ise R. solani basit su agar medyada hızla büyür.
Bu plaka tahlil toprakta R. solani7, Alternaria erken korumalılar, Fusarium solgunluğu, Phytophthora kök çürüklüğü ve Pythium kök çürüklüğü gibi saprophytes hayatta bitki patojenleri bir dizi uygulandığı bastırma bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Plaka rekabet tahlil bir toprak patojenlerin biyolojik mücadele etmeni hizmet mikroplar toplulukların içeren için kompost ürün yelpazesi ekrana yararlıdır. Tahlil hastalık bastırma ticari kompost ürünler6,8' en tutarlı göstergeleri biriydi. Ürünler kendi varyasyon tarifi, olgunluk ve üretim süreci için seçilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. önceden hazırlamak
- Ana mantar kültürü (test organizma)
- Amerikan tipi kültür Collection, Mikrobiyoloji koleksiyonu9, onun teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) veya MYA 4031 tarafından sipariş.
- Alternatif olarak: yerel yalıtır yazarlar tarafından yapılan olarak toplamak. Kırmızı turp (Raphanus sativus) fidan iyi bir yem bitkisi olarak iş; toprak sönümleme-off veya kök çürüklüğü R. solanitarafından neden olduğu bir geçmişi olduğu bilinen bir konumdan toplamak. Toprak tohumları ekmek ve fidan 3-4 haftalık olduğunda kök lezyon yalıtır.
- Fidan topraktan çıkarmak ve musluk suyuyla durulayın. Yaprak ve kök (Şekil 1) arasında hypocotyl bölgedeki kahverengi doku arayın.
- 1 cm kesimlerde hypocotyl veya kök kahverengi bir renk varsa kesmek için tek ucu keskin jilet kullanın. Alev sterilize forseps % 10 çözüm için 1 dakika, 10 s durulama steril su ardından ev çamaşır suyu segmentlerinde daldırma için kullanın.
Not: Üst ve alt kısımlarında steril Petri kabına yararlı için bu adımı kapsayıcılardır. - Bitki aktarmak için alev sterilize kullanım forseps pat kuru ve Petri kabına su agar (1 L 15 g) ile yüzeyi yerleştirmek için bir kağıt havlu iç parçaları.
- Kapaklı plastik bir kap içinde Petri kabına yerleştirin ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) kuluçkaya. Kapsayıcı % 10 çamaşır suyu ya da % 75 etanol ile iç silin ve çanak eklemeden önce kuru hava sağlar.
- Yalıtır mısır yemek agar en az bir ortam üzerinde uzun süreli depolama (1 L 17 g) yatık (5 ° C'de) unutmayın.
Şekil 1: hastalık belirtileri. R. solani içeren toprak düzensiz çimlenme ve kuruluş (solda) ile sonuçlanır. Belirtiler turp fidan üzerinde hypocotyl (sağda), kahverengi lezyonlar olarak ortaya çıkar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Patates dekstroz agar tabak (1 L 39 g) inoculum bu plaka tahlil için kullanın.
- Bir kızı kültür Rhizoctonia kültür patates dekstroz agar bir tarih oluşturmak veya iki gün önce tahlil, bu sigorta için de tahlil önce kültür plaka üzerinde kurulmuştur. Kızı kültür küçük bir parça (10 mm çap) R. solani ana kültüründen patates dekstroz agar (Şekil 2) taze bir tabak merkezine transfer ederek başlayın.
Not: bir laminar akış mahallede iş veya bir laboratuvar tezgah bulaşma riskini en aza indirmek için % 10 çamaşır suyu ya da % 75 etanol ile aşağı silin.
- Bir kızı kültür Rhizoctonia kültür patates dekstroz agar bir tarih oluşturmak veya iki gün önce tahlil, bu sigorta için de tahlil önce kültür plaka üzerinde kurulmuştur. Kızı kültür küçük bir parça (10 mm çap) R. solani ana kültüründen patates dekstroz agar (Şekil 2) taze bir tabak merkezine transfer ederek başlayın.
- Otoklav 25 mL test tüpleri ile 10 mL aliquots distile su (2 x sayısı örnekleri).
2. Test için örnek hazırlanması
- İki bağımsız 0.5 g örnek her kompost test örneği 10 mL 25 mL test tüpleri autoclaved su ekleyin. Test tüpleri gecede sallamak.
- Test tüpleri benzersiz örnek numaraları ve her üyesi çifti (başvuru) veya B (örnek) olarak etiketleyin.
- 24 saat sonra 90 mL distile su içinde iki 125 mLconical şişeler için düz agar 1.5 g ekleyin.
- Otoklav agar ve her çifti yavaş egzoz ayarı 20 dk için A örneği ile her iki konik şişeler.
- Denge (yaklaşık 30 dk) ulaşana kadar basınçlı kap sonra konik şişeler agar ile 45 ° C su banyosu yerleştirin. Herhangi bir örnek sprey su banyosunda 45 ° C'ye serin kadar koymak değil
Şekil 2: illüstrasyon Protokolü'nün. R. solani fişler Petri yemekler üzerinde kompost su özü içeren yerleştirilir. Mycelial büyüme çapını çözünürlük ve kontrast geliştirmek için stereo mikroskop yardımıyla 1-2 gün sonra ölçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- A örnek (autoclaved başvuru) kompost Bulamaç A agar şişeye erimiş agar dökün. Girdap agar kompost dağıtmak için.
- B örnek (canlı örnek) kompost Bulamaç B agar şişeye erimiş agar dökün. Girdap agar kompost dağıtmak için.
- İçine 100 mm çapında olan beş plastik Petri yemekler her şişeyi karışımı dökün.
- Agar sertleşir plakaları serin gecede izin.
3. eklemek Rhizoctonia Challenge
- Aseptik teknik kullanarak, R. solani eşit büyüklükte parçalar örnek ağar kaplamalar her çifti için transfer (3-5 mm corkborer de eşit büyüklükte parçalar oluşturmak için çalışır). Koloni adet miselyum aktif büyüyen sigorta ettirmeleri koloni dış kenar boşluğunda almak.
Not: bir laminar akış mahallede iş veya bir laboratuvar tezgah % 10 çamaşır suyu ya da % 70ini etanol ile aşağı silin. - Plakayı oda sıcaklığında 1-2 koloni büyüme A tabak hakkında yarı yol kenarına ulaşıncaya kadar günlerce kuluçkaya.
4. ölçü R. solani büyüme
- Stereo mikroskop ile iletilen aydınlatma kullanarak açık düz cetvel ile miselyum her plaka yakın 1 mm yarıçapında ölçmek.
Not: Eğik veya koyu alan aydınlatma görmek ve şeffaf hif ölçmek kolaylaştırır. Bu noktada, kompost süpresif ise inhibisyon bölgeleri kompost parçaları B plaka çevresinde görünür hale gelir. - RADIUS plaka başına üç yerde kaydetmek ve temsili bir ölçütü üç ortalaması hesaplamak.
- Demek--dan A tabak B plakaların çıkarma. Eğer B < daha sonra burada R. solani patojen süpresif B plakaları mikroplar vardır.
- Ortalama RADIUS Challenge birimler göreli bastırma bir oranı, mm miselyum günlük olarak ifade etmek için gün sayısı bölün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bitmiş kompost istikrarlı ve Olgun, iki o güvenli bir şekilde paketlenmiş taşınan ve sık sık birbirinin yerine geçebilir, kullanılan terimler ve olumsuz etkilere neden sırasında son kullanım4. İstikrar ayrışma bir direnci ve genellikle mikrobiyal aktivite endeksi kullanılarak belirlenir. Genel önlemler mikrobiyal solunum kompost istikrar şart değil hastalık bastırma bir saldırgan patojen ve cimri R. solani7gibi ama ölçü. Bu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biliyoruz önceki araştırma, belirli kompost R. solani bastırmak etkili ve baskılayıcı etkileri kompost içinde yaşayan mikroplar nedeniyle değil kompost6,8abiyotik özellikleri vardır. Media10karbon kimya etkilediğinden ısıyla kullanımı microbiota ' öldürmeye ' aracı olarak eleştirilmiştir. Isıyla Whatman No 1 kağıt üzerinden vakum filtrasyonu için kullanımı ile karşılaştırıldığında. Ne süzülmüş ne de autoclaved tedaviler R. sol...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Vermont tarımsal deney istasyonu rekabetçi Hatch Program VT-HO1609 araştırma finanse. Lynn Fang M.S. tezini Vermont Üniversitesi6parçası olarak kullanılan yöntem.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| otoklavlanabilir dar boyunlu cam erlen | Fisher Scientific | 10-040D | 125 mL |
| otoklavlanabilir cam test tüpleri | Fisher Scientific | 14-925J | 25 mL |
| susuz granül agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g miktar |
| ısıya dayanıklı eldiven | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | çeşitli markalar mevcuttur |
| Parafilm (2-3 cm genişliğinde şeritler) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 veya 10 cm genişlikte tek |
| kullanımlık polistiren petri kapları | çalışır Fisher Scientific | R80116 | 20/ea'lık kılıflar veya 500 |
| susuz patates dekstroz agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | , 100, 500 ve 2000 gram miktarlarda gelir |
| üstü karşılıklı çalkalayıcı | Thomas Scientific | 1227Y31 | diğer modeller |
| çalışacak su banyosu | ThermoScientific | S37363 | 5L genel amaçlı |
| şeffaf cetvel, düz, en az 10 cm | Herhangi bir | kullanım metrik kuralı | |
| ATCC kültürü | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu | ATCC 10154 | teleomorf Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) veya MYA 4031; |
| laboratuvar bandı | Fisher Scientific | 15935 | otoklavlanabilir ve çıkarılabilir, 1 "genişliğinde tercih edilen |
| suya dayanıklı işaretleyici | ofis veya bilimsel tedarik | Sharpie ince ipucu | kasete örnek numarası yazın |
Kaynaklar
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
