Yöntem makalesi

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

DOI:

10.3791/58818

⸱

21 Ocak 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnorganik polifosfat, gram pozitif, gram-negatif ve Mikobakteriyel türler de dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde hızlı miktar için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnorganik polifosfat (polip) yaşamın tüm etki alanları arasındaki bulundu biyolojik bir polimerdir ve virülans ve stres yanıt olarak birçok bakteri için gereklidir. Sayısal polip Biyolojik materyallerde, emek yoğun ya da duyarsız, kullanışlılığı sınırlama birçoğu için yöntemler vardır. Burada bakteri, polip miktar için akıcı bir yöntem birden çok örnekleri, polip polip özgü exopolyphosphatase ScPPX ile sindirim ve tespiti hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma kullanarak mevcut hassas bir askorbik asit tabanlı kolorimetrik yöntemi ile elde edilen ücretsiz fosfat. Bu yordamı basit, ucuz ve güvenilir polip miktar farklı bakteriyel türler sağlar. Biz temsilcisi polip miktar gram-negatif bakteri (Escherichia coli), gram-pozitif laktik asit bakteri (Lactobacillus reuteri) ve Mikobakteriyel türler (Mycobacterium smegmatis) mevcut. Biz de şu anda ticari olarak kullanılabilir durumda değilse nikel benzeşme arıtma ScPPX, mg miktarlarda için basit bir protokol içerir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnorganik polifosfat (polip) hayat1,2,3tüm etki alanlarında bulunan doğrusal bir biyopolimer fosfat phosphoanhydride bağlı birimlerin var. Çeşitli bakteri, polip stres tepkisi, hareketliliği, biyofilm oluşumu, hücre döngüsü kontrol, antibiyotik direnci ve virülans4,5,6,7,8 için önemlidir ,9,10,11. Bakteri metabolizmasında polip çalışmaların bu nedenle hastalığa neden ve farklı ortamlarda gelişirler için bakteri yeteneğini temel anlayışlar verim potansiyeline sahip. Birçok durumda, ancak, bu çalışmalarda kısıtlayıcı bir faktör bakteri hücreleri içinde sayısal polip için kullanılabilen yöntemleri vardır.

Şu anda Biyolojik materyallerde polip düzeylerini ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemler genellikle iki farklı adımları içerir: polip ayıklanması ve polip miktarının mevcut bu özler. Maya Saccharomyces cerevisiae Bru ve meslektaşları12, özleri polip yanı sıra DNA ve RNA fenol kullanarak tarafından geliştirilen geçerli altın standart yöntem ve kloroform, etanol yağış, tedavi ile takip deoksiribonükleaz (DNaz) ve ribonükleaz (RNase) ve sonra kullanarak sayısal ücretsiz fosfat verim S. cerevisiae polip aşağılayıcı enzim exopolyphosphatase (ScPPX)-13 ile elde edilen arıtılmış polip sindirim bir malakit Renkölçer tahlil yeşil tabanlı. Bu yordamı son derece nicel ama emek yoğun, tek bir deneyde işlenebilir ve bakteriyel örnekleri için optimize edilmemiştir örneklerini sayısını sınırlama. Diğerleri polip hücre ve dokuların silis boncuk ("glassmilk") veya silis membran sütunları6,14,15,16,17kullanarak çeşitli ayıklama bildirdin, 18. Bu bakteriler, genellikle öncelikle sentezlemek için düşünülen için daha az endişe olmasına rağmen bu yöntemleri verimli bir şekilde kısa zincir polip (az 60 fosfat adet)12,14,15, ayıklamak değil uzun zincirli polip3. Polip asidik koşulları12altında kararsız olduğundan polip ekstraksiyon kuvvetli asit19,20 kullanarak eski yöntemler artık yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ayrıca sayısal polip için bildirilen yöntemler vardır. En ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), genellikle DNA leke için kullanılan bir floresan boya daha yaygındır. DAPI-polip kompleksler farklı floresan uyarma ve emisyon maxima DAPI-DNA komplekslerinde21,22daha var ama diğer hücresel bileşenleri, RNA, nükleotit ve inositol de dahil olmak üzere önemli girişim yapmaktadır özgüllük ve polip ölçümleri bu yöntem kullanılarak yapılan duyarlılığını azaltarak fosfatlar12,15,16,23. Alternatif olarak, polip ve adenozin nükleotittir (ADP) adenozin arıtılmış Escherichia coli kullanarak trifosfat (ATP) dönüştürülebilir polip kinaz (PPK) ve luciferase14,17 kullanarak sayısal sonuç ATP ,18. Bu polip çok az miktarda algılanmasını sağlar, ancak iki enzimatik reaksiyon adımları ve hem biyoluminesans hem de çok saf ADP, pahalı reaktifler olan gerektirir. ScPPX, özellikle digests polip ücretsiz fosfat6,12,13,daha basit yöntemleri ama ScPPX kullanarak tespit24, içine DNA ve RNA12tarafından inhibe DNaz ve RNase tedavi gerektiren polip içeren ayıklar. Ne PPK ne de ScPPX ticari olarak mevcut, ve PPK arıtma oldukça karmaşık25,26.

Polip hücre lysates veya özleri de polyacrylamide jeller üzerinde27,28,29,30, zincir uzunluğu değerlendirilmesi izin vermez, ancak bir yöntem boyama negatif DAPI tarafından görüntülenmeyecektir düşük işlem hacmi ve kötü nicel.

Biz şimdi polip hızlı miktar seviyelerinde farklı bakteri türleri sağlar bir hızlı, ucuz, orta-den geçerek polip tahlil raporu. Bu yöntem, 4 M guanidin isothiocyanate (GITC)14 95 ° C'de bakteri hücreleri hücresel fosfatazlar, birden fazla örnekleri hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma ardından devre dışı bırakabilirsiniz için lysing tarafından başlar. Elde edilen polip içeren özü sonra DNaz ve RNase muamele için ihtiyacını ortadan kaldırarak ScPPX, büyük bir fazlalığı ile sindirilir. Biz basit nikel benzeşme arıtma ScPPX miktarda mg için bir iletişim kuralı içerir. Son olarak, ücretsiz fosfat polip kaynaklı basit, hassas, askorbik asit tabanlı Renkölçer tahlil24 ile sayısal ve toplam hücresel protein için normalleştirilmiş. Bu yöntem polip bakteri hücreleri içinde ölçümü akıcılık ve biz kullanımı gram-negatif bakteriler, gram-pozitif bakteri ve mikobakteriler temsilci türleri ile göstermek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. arındırıcı Maya Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. E. coli protein overexpression gerilme BL21(DE3)31 plazmid pScPPX26 Elektroporasyon32 veya kimyasal dönüştürme33tarafından dönüşümü.
  2. Lysogeny suyu (LB) bir 2 L unbaffled şişesi ile pScPPX2 içeren BL21(DE3) bir koloni içinde 100 µg mL-1 ampisilin içeren 1 L aşılamak ve gecede 37 ° C'de, 600 bir absorbans için sallayarak olmadan kuluçkaya nm (bir600) yaklaşık 0.3, spektrofotometre içinde ölçülen.
  3. (180 rpm) sallayarak kültür başlatmak ve zaman zarfında hücreleri bir A600 itibaren 0.4 - için büyür 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 0,5.
  4. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM ve bir ek 100 µg mL-1 ampisilin son bir konsantrasyon ekleyin, sonra 37 ° C 180 rpm'de sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
    Not: Bu overexpression Protokolü çözünür ScPPX büyük miktarda oluşturur. Ancak, ScPPX overexpression çok bağışlayıcı ve diğer genel protein overexpression protokollerini çeşitli başarıyla ScPPX arındırmak için kullanılmıştır.
  5. Hücreleri bir 1 L santrifüj biberondan aktarmak ve bunları 5000 x g 4 ° C'de 20 min için centrifuging tarafından hasat Ve hücre Pelet 50 mL konik tüp transfer süpernatant çıkarın.
    Not: Hücre topakları süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir
  6. Pelet buz çözme, sonra 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl ve 5 mM imidazole (pH 8) toplam hacmi yaklaşık 10 mL için resuspend.
  7. (Son konsantrasyonları) 1 mg mL-1 lizozim, 2 mM MgCl2ve 50 adet mL-1 , RNA ve DNA onur kırıcı bir endonükleaz ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
    Not: ScPPX nükleik asitler (veri) gösterilmez, bağlar nükleaz tedavi arıtma sırasında bu nedenle esastır.
  8. Bir sonicator bir microtip ile kullanarak (bkz. Tablo reçetesi) sonication on Ice 5 darbe % 50 güç 2 döngüleri tarafından hücreleri parçalayıcı s 2 dk dinlenme döngüleri arasında ile kapalı, açık ve 5 s.
    Not: uygun işitme koruma sonication sırasında kullanın. Benzer şekilde overexpression ile durum için çeşitli hücre lizis Yöntemler ScPPX arıtma için kabul edilebilir.
  9. Lysate, 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk centrifuging tarafından çözünmez enkaz kaldırma Elde edilen süpernatant (yaklaşık 10 mL) 0.8 µm gözenek boyutu selüloz asetat şırınga filtre ile filtre.
  10. Lysate bir nikel-ücret 5 sütun şelat mL üzerine yük ( Tablo malzemelerigörmek) peristaltik pompa ya da büyük bir şırınga kullanarak.
  11. Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.
  12. Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.
  13. ScPPX ile 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl ve 0,5 M imidazole (pH 8), toplama 15 1 mL kesirler elute. Protein ile Bradford protein tahlil34 içerik için bu elüsyon kesirler test ( Tablo malzemelerigörmek) ve hangi kesirler arıtılmış ScPPX içeren onaylamak için bir SDS-sayfa jel35 çalıştırın (Moleküler ağırlığı 45 kDa =).
  14. Saf ScPPX içeren kesirleri havuz ve 50 mM HEPES ile yaklaşık 2 mg mL-1 ve 0,5 M NaCl havuza alınan protein konsantrasyonu ayarlayın. Yüksek protein konsantrasyonları sonraki adımda çökelti.
  15. Saf ScPPX depolama arabellek (20 mM Tris-[pH 7,5], HCl 50 mM KCl, %10 [v/v] gliserol) diyaliz tarafından değişimi. Havuza alınan ScPPX kesirler 12.000-14.000 Da moleküler ağırlık kesme diyaliz membran ( Tablo malzemelerigörmek) boru, mühürlü bir uzunluğu yerleştirin ve depolama arabellek en az 4 h yinelemek için bu adımı ile taze ile sürekli karıştırarak 4 ° C'de 1 L askıya 3 arabellek değişiklikleri toplam depolama arabellek.
  16. Arıtılmış, diyaliz protein bir santrifüj tüpü ya da tüpler ve 20.000 x g 4 ° C'de herhangi bir çözünmez toplamları kaldırmak için de 20 dk santrifüj aktarın. Dikkatle süpernatant temiz 15 mL konik tüp aktarın.
  17. Ayarlamak için 1 mg mL-1 depolama arabellek ile arıtılmış ScPPX konsantrasyonu, % 0,1 (w/v) eklemek proteaz-Alerjik Sığır serum albumin (BSA; son konsantrasyonu) ve 6 ay 4 ° C'de mağaza
    Not: dondurulmuş13olduğunda faaliyete fazla % 90 ScPPX kaybeder.

2. hasat örnekleri polifosfat çıkarma için

  1. Bakteri polip içeriği belirlemek için vade farkı şartları altında büyür. Bu iletişim kuralı için Lactobacillus reuteri36 37 ° C'de gecede seçeneği enzim İndüksiyon (Mey) orta37 sistein (Mey-C) olmadan sallayarak olmadan büyümek.
  2. Santrifüjü 50-100 µg hücresel protein toplam 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde tarafından yeterince hücre hasat (bkz. Adım 3 aşağı). E. coliiçin bu bir günlük faz kültür 0.2 - A600 1 mL 0,4. L. reuteriiçin bu bir gecede kültür 1 mL dir. İlgi diğer türler için gerektiği şekilde ayarlayın.
  3. Tamamen süpernatant hücre çökeltilerini kaldırın.
  4. Hücre granül GITC lizis arabellek (4 M guanidin isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) 250 µL içinde resuspend ve kuluçka deposu lysates-80 ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de tarafından parçalayıcı
    Not: yüksek sıcaklıkta genişletilmiş kuluçka polip düşmesine hidroliz38tarafından neden olabilir bu yana lizis zamanla tutarlı olması. Lysates süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir
    Dikkat: Guanidin isothiocyanate chaotropic tuzudur ve olmalı eldiven ile ele ve tehlikeli atık kurtulduk.

3. ölçme hücre Lysates Protein içeriği

  1. BSA standartları 0, 0.1, 0,2 ve 0.4 mg mL-1 BSA, GITC lizis arabelleği hazırlayın.
    Not: GITC Bradford tahlil renk gelişimi etkiler GITC, BSA standartları yapmak önemlidir. BSA standartları-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir
  2. Aliquot 5 µL çözdürülen, iyi karma hücre lysates ve kuyu temiz 96-şey plaka ayırmak için BSA standartları.
  3. Her şey için 195 µL Bradford reaktifi34 ekleyin ve 595 absorbans ölçmek nm (bir595) bir plaka okuyucu ( Tablo malzemelerigörmek).
  4. Karşılaştırma için formül y kullanarak BSA standart eğri olarak her iyi protein miktarı hesaplamak = mx + b, nereye i ise595, x BSA µg, standart eğrinin eğimini metredir, ve b standart eğri y kesişimi. Sonuç değeri 0,05 Toplam mg protein her örnek içinde belirlemek için çarpmak.

4. açılan polifosfat

  1. 250 µL % 95 etanol her GITC lysed örnek ve girdap karışımı ekleyin.
  2. Silis membran spin sütun ve santrifüj 30 için bu karışımı uygulamak 16,100 x g s.
  3. Akış-üzerinden atmak, sonra 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, % 50 Etanol ve santrifüj 30 750 µL (pH 7.5), 5 mm Tris-HCl ekleyin 16,100 x g s.
  4. Akış-through ve santrifüj 16,100 x g de 2 min için atmak.
  5. Sütun bir temiz 1.5 mL microfuge tüpü yerleştirin ve 50 mm Tris-HCl (pH 8) 150 µL ekleyin.
  6. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya sonra polip 8.000 x g de 2 min için centrifuging tarafından elute.
    Not: arzu edilirse, eluates-20 ° C'de en az 1 hafta boyunca saklanır.

5. polifosfat sindirerek

  1. 0, 5, 50 ve 50 mM Tris-HCl (pH 8) 200 µM potasyum fosfat içeren standartlar hazırlamak.
    Not: Potasyum fosfat standartları süresiz olarak oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  2. Aliquot 100 µL her fosfat standart ve, polip örnekleri temiz 96-şey plaka ayrı kuyu hulâsa.
  3. (Örnek) içeren bir ana karışım hazırlamak: 5 x ScPPX reaksiyon arabellek (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM amonyum asetat, pH 7.5)1330 µL, H2O 19 µL ve saf ScPPX (1 mg mL-1) 1 µL.
  4. Ana Mix 50 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
    Not: arzu edilirse, sindirilmiş polip örnekleri-20 ° C'de süresiz olarak saklanır.

6. ücretsiz fosfat24 algılama

  1. Antimon Potasyum Tartarat 200 ml su, 4 N H2150 mL kadar ekleme 0.185 g çözülerek algılama çözüm temel hazırlamak41,49 g amonyum heptamolybdate ekleme,. Dağıtılması ve 456 mL nihai bir birime getirmek için ilave edin. Parçacıklar kaldırmak ve saklamak için çözüm korunuyorsunuz ışık 4 ° c ilâ 1 ay için filtre.
  2. 1 M askorbik asit stok çözeltisi hazırlamak. Işık 4 ° c ilâ 1 ay için korumalı depolama.
  3. Taze bir çalışma stok algılama çözüm her gün algılama çözüm temel 9,12 mL 1 M askorbik asit 0,88 mL ile karıştırılarak hazır olun. Oda sıcaklığında kullanmadan önce gelmek algılama çözüm izin verin.
  4. Her örnek ve standart 96-şey plaka algılama çözüm 50 µL ekleyin ve renk geliştirme izin vermek yaklaşık 2 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Ölçmek 882 absorbans nm bir plaka okuyucu ile ve her örnek fosfat konsantrasyonu, buna karşılık potasyum fosfat standart eğri hesaplamak.
    Uyarı: Toksik tuzları ve kuvvetli asit algılama çözüm içerir. Eldiven giymek ve aşırı çözüm zehirli atık tedavi.

7. hücresel polifosfat içerik hesaplama

  1. Polip kaynaklı fosfat tüm her hücrede aşağıdaki formüle göre lysate nanomoles 6.5. adımda belirlenen fosfat konsantrasyonları dönüştürmek:
    nmol polip 1.5 x = (µM fosfat / 10)
    Not: Standart eğri tabanlı yöntemi adım 6 fosfat (içinde µM) konsantrasyonu her 100 µL polip örnek adım 5.2 bölünmemeli belirler. Bu konsantrasyon nmol bir sayıya dönüştürmek için 100 µL 10 tarafından ayrılmıştır bir cilt L, vermek için6 konsantrasyon (µmol L-1) tarafından çarpılan, sonra 1.000 (bir µmol nmol sayısı) ile çarpılır. Bu konsantrasyonu 10 tarafından bölünmesi için azaltır. Adım 4'te hazırlanan toplam özü cilt 150 µL, bu fosfat tüm hulâsa içinde mevcut nmol hesaplamak için 1.5 sonuç değeri çarpmak için gerekli bu yüzden.
  2. 3.4. adımda belirlenen her örnek mg toplam protein nmol polip bölünerek toplam hücresel protein içeriğe hücresel polip normalleştirmek. Polip düzeyleri polip kaynaklı bireysel ücretsiz fosfat konsantrasyon açısından ifade edilir.
    Not: bazı durumlarda, fosfat standart eğri (adım 6.5) doğrusal aralığı dışında polip kaynaklı bir örnek mevcut fosfat miktarı düşebilir. Polip düzeyleri çok yüksek ise, aşırı polip içeren eluate adım 4,6 seyreltilmiş 1:10 veya 1: 100, gerekirse olabilir ve 5-7 arası adımları açıklandığı gibi yeniden ölçülür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü'nün önemli adımlar Şekil 1' deki Basitleştirilmiş biçimde diyagramını.

Bu iletişim kuralıyla Ayagin Gram-negatif bakteriler, vahşi tipi E. coli kullanımını göstermek için MG165539 LB zengin Orta 37 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile orta log fazı için yetiştirilen, sonra durulanır ve ek bir 2s için inkübe 4 g L-1 glikoz ve 0,1 mM K2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol basitleştirir ve tipik bir el tam olarak işlemek için yaklaşık 1,5 saat alarak 24 örnekleri ile çeşitli bakteri, polip düzeylerinin miktar hızlandırır. Bu örnekleri hızlı tarama ve analiz mutant kütüphanelerin izin verir ve kinetik deney polip birikimi zamanla ölçüm kolaylaştırır. Protokol etkili üç farklı kültürlenebilen temsilcileri üzerinde çalışıyor göstermiştir: bakteri, firmicutes ve bunlar, onların esnek için kötü üne sahip olan hücre duvarları49koşullar zor.

<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje Birmingham bölümü Mikrobiyoloji başlangıç fonlar ve NIH hibe R35GM124590 (MJG) ve NIH hibe R01AI121364 (FW) University of Alabama tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plazmid pScPPX2Addgene112877akademik ve diğer kar amacı gütmeyen kurumlar tarafından kullanılabilir
LB suyuFisher ScientificBP1427-2E. coli büyüme ortamı
ampisilinFisher ScientificBP176025
izopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)Altın BiyoteknolojiI2481C
HEPES tamponuAltın BiyoteknolojiH-400-1
potasyum hidroksit (KOH)HEPES tamponlu çözeltilerin pH'ını ayarlamak içinFisher ScientificP250500
sodyum klorür (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazolFisher BilimselO3196500
lizozimFisher ScientificAAJ6070106
magnezyum klorür (MgCl2< / sub>)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonaz (Sigma-Aldrich cat. # E1014) kabul edilebilir bir alternatiftir
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120diğer hücre lizis yöntemleri (örneğin French Press) da etkili olabilir:
5 mL HiTrap şelatlama HP sütunuGE Life Sciences17040901herhangi bir nikel afinite kromatografi sütunu veya reçine ikame edilebilir
nikel (II) sülfat hekzahidratAC415611000HiTrap sütunu
0.8 ve mikro; m gözenek boyutu selüloz asetat şırınga filtreleriFisher Scientific09-302-168
Bradford reaktifiBio-Rad5000205
Tris tamponuFisher ScientificBP1525
Spektrumu  Spectra/Por 4 RC Diyaliz Membran Tüpü 12.000 ila 14.000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667BMWCO < 30.000 Da olan diğer diyaliz membranları da çalışmalıdır
hidroklorik asit (HCl)Fisher ScientificA144-212Tris tamponlu çözeltilerin pH'ını ayarlamak için
potasyum klorür (KCl)Fisher ScientificP217500
gliserolFisher ScientificBP2294
10x MOPS orta karışımTeknovaM2101E. coli büyüme ortamı
glikozFisher ScientificD161
monobazik potasyum fosfat (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibazik potasyum fosfat (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
kurutulmuş maya özüFisher ScientificDF0886-17-0
triptonFisher ScientificBP1421-500
magnezyum sülfat heptahidratFisher ScientificM63-50
manganez sülfat monohidratFisher ScientificM113-500
guanidin izotiyosiyanatFisher ScientificBP221-250
sığır serum albümini (proteaz içermez)Fisher ScientificBP9703100
şeffaf düz tabanlı 96 oyuklu plakalarSigma-AldrichM0812-100EAherhangi bir şeffaf 96 oyuklu plaka çalışacaktır
Tecan M1000 Sonsuz plaka okuyucuTecan, Inc.uygulanamaz,595 ve 882 nm'de absorbansı ölçebilen herhangi bir plaka okuyucu etanol çalışacaktır
Fisher Scientific04-355-451
silika membran spin kolonlarıEpoch Life Science1910-050/250
etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5 mL mikrofüj tüpleriFisher ScientificNC9580154
amonyum asetatFisher ScientificA637-500
antimon potasyum tartratFisher ScientificAAA1088922
4 N sülfürik asit (H < alt > 2 < / alt > SO4)Fisher ScientificSA818-500
amonyum heptamolibdatFisher ScientificAAA1376630
askorbik asitFisher BilimselAC401471000
, ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63(2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27(2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267(2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757(2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76(2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Polifosfat KantifikasyonuSilika Membran EkstraksiyonuScPPX PurifikasyonuAskorbik Asit AnaliziBakteriyel PolifosfatProtein NormalizasyonuFosfat TespitiPolifosfat EkstraksiyonuPolifosfat Analizi

İlgili makaleler