Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

İnorganik polifosfat (polip) hayat^1,2,3tüm etki alanlarında bulunan doğrusal bir biyopolimer fosfat phosphoanhydride bağlı birimlerin var. Çeşitli bakteri, polip stres tepkisi, hareketliliği, biyofilm oluşumu, hücre döngüsü kontrol, antibiyotik direnci ve virülans^{4,5,6,7,8 için önemlidir ,9,10,11}. Bakteri metabolizmasında polip çalışmaların bu nedenle hastalığa neden ve farklı ortamlarda gelişirler için bakteri yeteneğini temel anlayışlar verim potansiyeline sahip. Birçok durumda, ancak, bu çalışmalarda kısıtlayıcı bir faktör bakteri hücreleri içinde sayısal polip için kullanılabilen yöntemleri vardır.

Şu anda Biyolojik materyallerde polip düzeylerini ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemler genellikle iki farklı adımları içerir: polip ayıklanması ve polip miktarının mevcut bu özler. Maya Saccharomyces cerevisiae Bru ve meslektaşları¹², özleri polip yanı sıra DNA ve RNA fenol kullanarak tarafından geliştirilen geçerli altın standart yöntem ve kloroform, etanol yağış, tedavi ile takip deoksiribonükleaz (DNaz) ve ribonükleaz (RNase) ve sonra kullanarak sayısal ücretsiz fosfat verim S. cerevisiae polip aşağılayıcı enzim exopolyphosphatase (ScPPX)-¹³ ile elde edilen arıtılmış polip sindirim bir malakit Renkölçer tahlil yeşil tabanlı. Bu yordamı son derece nicel ama emek yoğun, tek bir deneyde işlenebilir ve bakteriyel örnekleri için optimize edilmemiştir örneklerini sayısını sınırlama. Diğerleri polip hücre ve dokuların silis boncuk ("glassmilk") veya silis membran sütunları^{6,14,15,16,17kullanarak çeşitli ayıklama bildirdin, 18}. Bu bakteriler, genellikle öncelikle sentezlemek için düşünülen için daha az endişe olmasına rağmen bu yöntemleri verimli bir şekilde kısa zincir polip (az 60 fosfat adet)^12,14,15, ayıklamak değil uzun zincirli polip³. Polip asidik koşulları¹²altında kararsız olduğundan polip ekstraksiyon kuvvetli asit^19,20 kullanarak eski yöntemler artık yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ayrıca sayısal polip için bildirilen yöntemler vardır. En ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), genellikle DNA leke için kullanılan bir floresan boya daha yaygındır. DAPI-polip kompleksler farklı floresan uyarma ve emisyon maxima DAPI-DNA komplekslerinde^21,22daha var ama diğer hücresel bileşenleri, RNA, nükleotit ve inositol de dahil olmak üzere önemli girişim yapmaktadır özgüllük ve polip ölçümleri bu yöntem kullanılarak yapılan duyarlılığını azaltarak fosfatlar^12,15,16,23. Alternatif olarak, polip ve adenozin nükleotittir (ADP) adenozin arıtılmış Escherichia coli kullanarak trifosfat (ATP) dönüştürülebilir polip kinaz (PPK) ve luciferase^{14,17 kullanarak sayısal sonuç ATP ,18}. Bu polip çok az miktarda algılanmasını sağlar, ancak iki enzimatik reaksiyon adımları ve hem biyoluminesans hem de çok saf ADP, pahalı reaktifler olan gerektirir. ScPPX, özellikle digests polip ücretsiz fosfat^6,12,13,daha basit yöntemleri ama ScPPX kullanarak tespit²⁴, içine DNA ve RNA¹²tarafından inhibe DNaz ve RNase tedavi gerektiren polip içeren ayıklar. Ne PPK ne de ScPPX ticari olarak mevcut, ve PPK arıtma oldukça karmaşık^25,26.

Polip hücre lysates veya özleri de polyacrylamide jeller üzerinde^27,28,29,30, zincir uzunluğu değerlendirilmesi izin vermez, ancak bir yöntem boyama negatif DAPI tarafından görüntülenmeyecektir düşük işlem hacmi ve kötü nicel.

Biz şimdi polip hızlı miktar seviyelerinde farklı bakteri türleri sağlar bir hızlı, ucuz, orta-den geçerek polip tahlil raporu. Bu yöntem, 4 M guanidin isothiocyanate (GITC)¹⁴ 95 ° C'de bakteri hücreleri hücresel fosfatazlar, birden fazla örnekleri hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma ardından devre dışı bırakabilirsiniz için lysing tarafından başlar. Elde edilen polip içeren özü sonra DNaz ve RNase muamele için ihtiyacını ortadan kaldırarak ScPPX, büyük bir fazlalığı ile sindirilir. Biz basit nikel benzeşme arıtma ScPPX miktarda mg için bir iletişim kuralı içerir. Son olarak, ücretsiz fosfat polip kaynaklı basit, hassas, askorbik asit tabanlı Renkölçer tahlil²⁴ ile sayısal ve toplam hücresel protein için normalleştirilmiş. Bu yöntem polip bakteri hücreleri içinde ölçümü akıcılık ve biz kullanımı gram-negatif bakteriler, gram-pozitif bakteri ve mikobakteriler temsilci türleri ile göstermek.

1. arındırıcı Maya Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. E. coli protein overexpression gerilme BL21(DE3)³¹ plazmid pScPPX2⁶ Elektroporasyon³² veya kimyasal dönüştürme³³tarafından dönüşümü.
2. Lysogeny suyu (LB) bir 2 L unbaffled şişesi ile pScPPX2 içeren BL21(DE3) bir koloni içinde 100 µg mL^-1 ampisilin içeren 1 L aşılamak ve gecede 37 ° C'de, 600 bir absorbans için sallayarak olmadan kuluçkaya nm (bir₆₀₀) yaklaşık 0.3, spektrofotometre içinde ölçülen.
3. (180 rpm) sallayarak kültür başlatmak ve zaman zarfında hücreleri bir A₆₀₀ itibaren 0.4 - için büyür 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 0,5.
4. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM ve bir ek 100 µg mL^-1 ampisilin son bir konsantrasyon ekleyin, sonra 37 ° C 180 rpm'de sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
   Not: Bu overexpression Protokolü çözünür ScPPX büyük miktarda oluşturur. Ancak, ScPPX overexpression çok bağışlayıcı ve diğer genel protein overexpression protokollerini çeşitli başarıyla ScPPX arındırmak için kullanılmıştır.
5. Hücreleri bir 1 L santrifüj biberondan aktarmak ve bunları 5000 x g 4 ° C'de 20 min için centrifuging tarafından hasat Ve hücre Pelet 50 mL konik tüp transfer süpernatant çıkarın.
   Not: Hücre topakları süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir
6. Pelet buz çözme, sonra 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl ve 5 mM imidazole (pH 8) toplam hacmi yaklaşık 10 mL için resuspend.
7. (Son konsantrasyonları) 1 mg mL^-1 lizozim, 2 mM MgCl₂ve 50 adet mL^-1 , RNA ve DNA onur kırıcı bir endonükleaz ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
   Not: ScPPX nükleik asitler (veri) gösterilmez, bağlar nükleaz tedavi arıtma sırasında bu nedenle esastır.
8. Bir sonicator bir microtip ile kullanarak (bkz. Tablo reçetesi) sonication on Ice 5 darbe % 50 güç 2 döngüleri tarafından hücreleri parçalayıcı s 2 dk dinlenme döngüleri arasında ile kapalı, açık ve 5 s.
   Not: uygun işitme koruma sonication sırasında kullanın. Benzer şekilde overexpression ile durum için çeşitli hücre lizis Yöntemler ScPPX arıtma için kabul edilebilir.
9. Lysate, 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk centrifuging tarafından çözünmez enkaz kaldırma Elde edilen süpernatant (yaklaşık 10 mL) 0.8 µm gözenek boyutu selüloz asetat şırınga filtre ile filtre.
10. Lysate bir nikel-ücret 5 sütun şelat mL üzerine yük ( Tablo malzemelerigörmek) peristaltik pompa ya da büyük bir şırınga kullanarak.
11. Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.
12. Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.
13. ScPPX ile 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl ve 0,5 M imidazole (pH 8), toplama 15 1 mL kesirler elute. Protein ile Bradford protein tahlil³⁴ içerik için bu elüsyon kesirler test ( Tablo malzemelerigörmek) ve hangi kesirler arıtılmış ScPPX içeren onaylamak için bir SDS-sayfa jel³⁵ çalıştırın (Moleküler ağırlığı 45 kDa =).
14. Saf ScPPX içeren kesirleri havuz ve 50 mM HEPES ile yaklaşık 2 mg mL^-1 ve 0,5 M NaCl havuza alınan protein konsantrasyonu ayarlayın. Yüksek protein konsantrasyonları sonraki adımda çökelti.
15. Saf ScPPX depolama arabellek (20 mM Tris-[pH 7,5], HCl 50 mM KCl, %10 [v/v] gliserol) diyaliz tarafından değişimi. Havuza alınan ScPPX kesirler 12.000-14.000 Da moleküler ağırlık kesme diyaliz membran ( Tablo malzemelerigörmek) boru, mühürlü bir uzunluğu yerleştirin ve depolama arabellek en az 4 h yinelemek için bu adımı ile taze ile sürekli karıştırarak 4 ° C'de 1 L askıya 3 arabellek değişiklikleri toplam depolama arabellek.
16. Arıtılmış, diyaliz protein bir santrifüj tüpü ya da tüpler ve 20.000 x g 4 ° C'de herhangi bir çözünmez toplamları kaldırmak için de 20 dk santrifüj aktarın. Dikkatle süpernatant temiz 15 mL konik tüp aktarın.
17. Ayarlamak için 1 mg mL^-1 depolama arabellek ile arıtılmış ScPPX konsantrasyonu, % 0,1 (w/v) eklemek proteaz-Alerjik Sığır serum albumin (BSA; son konsantrasyonu) ve 6 ay 4 ° C'de mağaza
    Not: dondurulmuş¹³olduğunda faaliyete fazla % 90 ScPPX kaybeder.

2. hasat örnekleri polifosfat çıkarma için

1. Bakteri polip içeriği belirlemek için vade farkı şartları altında büyür. Bu iletişim kuralı için Lactobacillus reuteri³⁶ 37 ° C'de gecede seçeneği enzim İndüksiyon (Mey) orta³⁷ sistein (Mey-C) olmadan sallayarak olmadan büyümek.
2. Santrifüjü 50-100 µg hücresel protein toplam 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde tarafından yeterince hücre hasat (bkz. Adım 3 aşağı). E. coliiçin bu bir günlük faz kültür 0.2 - A₆₀₀ 1 mL 0,4. L. reuteriiçin bu bir gecede kültür 1 mL dir. İlgi diğer türler için gerektiği şekilde ayarlayın.
3. Tamamen süpernatant hücre çökeltilerini kaldırın.
4. Hücre granül GITC lizis arabellek (4 M guanidin isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) 250 µL içinde resuspend ve kuluçka deposu lysates-80 ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de tarafından parçalayıcı
   Not: yüksek sıcaklıkta genişletilmiş kuluçka polip düşmesine hidroliz³⁸tarafından neden olabilir bu yana lizis zamanla tutarlı olması. Lysates süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir
   Dikkat: Guanidin isothiocyanate chaotropic tuzudur ve olmalı eldiven ile ele ve tehlikeli atık kurtulduk.

3. ölçme hücre Lysates Protein içeriği

1. BSA standartları 0, 0.1, 0,2 ve 0.4 mg mL^-1 BSA, GITC lizis arabelleği hazırlayın.
   Not: GITC Bradford tahlil renk gelişimi etkiler GITC, BSA standartları yapmak önemlidir. BSA standartları-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir
2. Aliquot 5 µL çözdürülen, iyi karma hücre lysates ve kuyu temiz 96-şey plaka ayırmak için BSA standartları.
3. Her şey için 195 µL Bradford reaktifi³⁴ ekleyin ve 595 absorbans ölçmek nm (bir₅₉₅) bir plaka okuyucu ( Tablo malzemelerigörmek).
4. Karşılaştırma için formül y kullanarak BSA standart eğri olarak her iyi protein miktarı hesaplamak = mx + b, nereye i ise₅₉₅, x BSA µg, standart eğrinin eğimini metredir, ve b standart eğri y kesişimi. Sonuç değeri 0,05 Toplam mg protein her örnek içinde belirlemek için çarpmak.

4. açılan polifosfat

1. 250 µL % 95 etanol her GITC lysed örnek ve girdap karışımı ekleyin.
2. Silis membran spin sütun ve santrifüj 30 için bu karışımı uygulamak 16,100 x g s.
3. Akış-üzerinden atmak, sonra 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, % 50 Etanol ve santrifüj 30 750 µL (pH 7.5), 5 mm Tris-HCl ekleyin 16,100 x g s.
4. Akış-through ve santrifüj 16,100 x g de 2 min için atmak.
5. Sütun bir temiz 1.5 mL microfuge tüpü yerleştirin ve 50 mm Tris-HCl (pH 8) 150 µL ekleyin.
6. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya sonra polip 8.000 x g de 2 min için centrifuging tarafından elute.
   Not: arzu edilirse, eluates-20 ° C'de en az 1 hafta boyunca saklanır.

5. polifosfat sindirerek

1. 0, 5, 50 ve 50 mM Tris-HCl (pH 8) 200 µM potasyum fosfat içeren standartlar hazırlamak.
   Not: Potasyum fosfat standartları süresiz olarak oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
2. Aliquot 100 µL her fosfat standart ve, polip örnekleri temiz 96-şey plaka ayrı kuyu hulâsa.
3. (Örnek) içeren bir ana karışım hazırlamak: 5 x ScPPX reaksiyon arabellek (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 250 mM amonyum asetat, pH 7.5)¹³30 µL, H₂O 19 µL ve saf ScPPX (1 mg mL^-1) 1 µL.
4. Ana Mix 50 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
   Not: arzu edilirse, sindirilmiş polip örnekleri-20 ° C'de süresiz olarak saklanır.

6. ücretsiz fosfat²⁴ algılama

1. Antimon Potasyum Tartarat 200 ml su, 4 N H₂150 mL kadar ekleme 0.185 g çözülerek algılama çözüm temel hazırlamak₄1,49 g amonyum heptamolybdate ekleme,. Dağıtılması ve 456 mL nihai bir birime getirmek için ilave edin. Parçacıklar kaldırmak ve saklamak için çözüm korunuyorsunuz ışık 4 ° c ilâ 1 ay için filtre.
2. 1 M askorbik asit stok çözeltisi hazırlamak. Işık 4 ° c ilâ 1 ay için korumalı depolama.
3. Taze bir çalışma stok algılama çözüm her gün algılama çözüm temel 9,12 mL 1 M askorbik asit 0,88 mL ile karıştırılarak hazır olun. Oda sıcaklığında kullanmadan önce gelmek algılama çözüm izin verin.
4. Her örnek ve standart 96-şey plaka algılama çözüm 50 µL ekleyin ve renk geliştirme izin vermek yaklaşık 2 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
5. Ölçmek 882 absorbans nm bir plaka okuyucu ile ve her örnek fosfat konsantrasyonu, buna karşılık potasyum fosfat standart eğri hesaplamak.
   Uyarı: Toksik tuzları ve kuvvetli asit algılama çözüm içerir. Eldiven giymek ve aşırı çözüm zehirli atık tedavi.

7. hücresel polifosfat içerik hesaplama

1. Polip kaynaklı fosfat tüm her hücrede aşağıdaki formüle göre lysate nanomoles 6.5. adımda belirlenen fosfat konsantrasyonları dönüştürmek:
   nmol polip 1.5 x = (µM fosfat / 10)
   Not: Standart eğri tabanlı yöntemi adım 6 fosfat (içinde µM) konsantrasyonu her 100 µL polip örnek adım 5.2 bölünmemeli belirler. Bu konsantrasyon nmol bir sayıya dönüştürmek için 100 µL 10 tarafından ayrılmıştır bir cilt L, vermek için⁶ konsantrasyon (µmol L^-1) tarafından çarpılan, sonra 1.000 (bir µmol nmol sayısı) ile çarpılır. Bu konsantrasyonu 10 tarafından bölünmesi için azaltır. Adım 4'te hazırlanan toplam özü cilt 150 µL, bu fosfat tüm hulâsa içinde mevcut nmol hesaplamak için 1.5 sonuç değeri çarpmak için gerekli bu yüzden.
2. 3.4. adımda belirlenen her örnek mg toplam protein nmol polip bölünerek toplam hücresel protein içeriğe hücresel polip normalleştirmek. Polip düzeyleri polip kaynaklı bireysel ücretsiz fosfat konsantrasyon açısından ifade edilir.
   Not: bazı durumlarda, fosfat standart eğri (adım 6.5) doğrusal aralığı dışında polip kaynaklı bir örnek mevcut fosfat miktarı düşebilir. Polip düzeyleri çok yüksek ise, aşırı polip içeren eluate adım 4,6 seyreltilmiş 1:10 veya 1: 100, gerekirse olabilir ve 5-7 arası adımları açıklandığı gibi yeniden ölçülür.

Protokolü'nün önemli adımlar Şekil 1' deki Basitleştirilmiş biçimde diyagramını.

Bu iletişim kuralıyla Ayagin Gram-negatif bakteriler, vahşi tipi E. coli kullanımını göstermek için MG165539 LB zengin Orta 37 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile orta log fazı için yetiştirilen, sonra durulanır ve ek bir 2s için inkübe 4 g L-1 glikoz ve 0,1 mM K2HPO4, üretim polip14,29ikna etmek için bilinen bir durum içeren morpholinopropanesulfonate arabelleğe alınmış (paspas) en az orta40 . Şekil 2Agösterildiği gibi biz vahşi tipi E. coli LB ve 192 ± 14 (ortalama ± standart sapma [SD]) nmol polip mg-1 toplam protein bezleri, önceki raporlar14ile,29 tutarlı yetiştirilen hiçbir polip tespit . , Hangi yoksun polip kinaz41, üretilen her iki ortamda hiçbir polip, bir ∆ppk mutant6, beklendiği gibi exopolyphosphatase42yoksun, bir ∆ppx mutant6, yaklaşık aynı miktarda üretilen Polip vahşi türü olarak ve fosfat taşımacılığında arızalı olan bir ∆phoB mutant29, vahşi tipi14,29,43daha önemli ölçüde daha az polip üretti.

Bu iletişim kuralıyla gram-pozitif bakteri, vahşi tipi L. reuteri kullanımını göstermek için ATCC okul aile birliği 647536 ve oligo-yönetmen recombineering44, kullanılarak inşa polip kinaz, eksik bir isogenic ppk1 null mutant olduğunu gecede MEI-C 37 ° C'de sallayarak olmadan büyüdü. Ppk1 mutant yarısından daha az miktarda bulunan süre Şekil 2B, vahşi tipi birikmiş 51 ± 6 nmol polip mg-1 toplam protein bu koşullar altında gösterildiği gibi. L. reuteri muhtemelen mevcut hesapları polip için ppk1 null mutant ppk2 gene45tarafından kodlanmış ikinci bir polip kinaz içerir.

Bu iletişim kuralı ile mikobakteriler kullanımını göstermek için Mycobacterium smegmatis gerilme SMR546 Hartmans-de Bont (HdB) orta47, sonra durulanır ve filolarının içinde seyreltilmiş HdB veya HdB % 2 etanol ile orta log fazı için yetişkin. Bu kültürler sonra gecede 37 ° C'de (180 rpm) sallayarak ile inkübe. Etanol tedavi üç kat artış için 437 ± 102 nmol polip mg-1 toplam protein sonuçlandı süre içinde Şekil 2C, etanol, yokluğunda gösterildiği gibi M. smegmatis 141 ± 52 nmol polip mg-1 toplam protein, birikmiş. Etanol M. smegmatis48polip düzeyleri yükseltmek için daha önce bildirilmiştir bu yana bu sonucu bekleniyordu.

Şekil 1: diyagramı polifosfat çıkarma ve ölçüm yordam. Polip miktar Protokolü'nün temel adımlar gösterilmiştir. Bakteri hücre topakları 95 ° c GITC (guanidin isothiocyanate) olarak lysed. Lysates küçük aliquots Bradford tahlil kullanarak protein içeriği için denetlesinler. Polip silis membran sütunları kullanarak ve sonra sindirilmiş ScPPX ile elde edilir. Elde edilen ücretsiz fosfat askorbik asit tahlil kullanarak sayılabilir. Toplam fosfat polip kaynaklı her örnek için toplam protein için normalleştirilmiş. 595 595 absorbans = nm; 882 882 absorbans = nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: temsilcisi sonuçları ile çeşitli bakteri. (A) E. coli MG1655 vahşi tipi ve isogenic ∆ppk, ∆ppxve ∆phoB mutantlar 37 ° C'de (200 devir/dakika) için600 sallayarak ile yetişkin = 0,2 - 0,4 zengin LB Orta (siyah daireler) ve en az orta (MOPS kaymıştır 4 g L-1 glikoz ve 0,1 mM K2HPO4içeren) için 2 h (beyaz daireler; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC okul aile birliği 6475 (daireler) ve bir isogenic ppk1 null mutant (üçgen) sallayarak olmadan gecede MEI-C orta 37 ° C'de yetişkin (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 37 ° C'de (180 rpm) için600 sallayarak ile yetişkin = 1 HdB Orta (kapalı kareler) ile veya olmadan (açık kareler) % 2 etanol (n = 3, ± SD). Polip düzeyleri polip kaynaklı bireysel ücretsiz fosfat konsantrasyon açısından ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.