Endotoxins mühendislik Nanomalzemeler içinde tespiti nanomedicine alanında büyük zorluklardan biri temsil eder. Burada, nano tanecikleri potansiyel endotoksin kirlenme tahmin etmek için üç farklı biçimlerinin LAL oluşan çerçeve açıklar bir örnek çalışma mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak
Bu makalede
Özet
Özet
Varsa ilaç ürünlerinde (sık sık da lipopolysaccharide denir) gram-negatif bakteri hücre duvarı bileşeni endotoksin inflamasyon, ateş, hipo - veya hipertansiyon neden olabilir ve, aşırı durumlarda olabilir doku ve organ hasarı için neden olabilir ölümcül olur. Bu nedenle, eczacılık ürünleri, endotoksin miktarda kesinlikle düzenlenmektedir. Arasında için kullanılabilen yöntemleri endotoksin algılama ve miktar, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil dünya çapında yaygın olarak kullanılır. Herhangi bir ilaç ürün LAL tahlil ile müdahale ederken, nano-formülasyonları kendi karmaşıklığı nedeniyle belirli bir meydan okuma temsil eder. Bu yazının amacı araştırmacılar endotoxins mühendislik Nanomalzemeler ve uyuşturucu nanopartikül formüle tahmininde deneyimsiz için pratik bir rehber sağlamaktır. Burada, bulanıklık, chromogenic dahil olmak üzere üç LAL biçimleri ve jel-pıhtı testleri gerçekleştirmek için pratik öneriler ele alınmıştır. Bu deneyleri endotoksin kirlenme nanoteknoloji tabanlı ilaç ürünleri, aşılar ve adjuvan belirlemek için kullanılabilir.
Giriş
Bir endotoksin Ayagin Gram-negatif bakteri hücre duvarı1,2bir yapı taşıdır. Daha çok, bağışıklık hücreleri etkinleştirebilirsiniz düşük (picogram) konsantrasyonları1,2. Yanıt olarak bir endotoksin hücreleri tarafından üretilen proinflamatuar aracıların (sitokinler, lökotrienler, eikozanoidler, vb) ateş, hipotansiyon, hipertansiyon ve birden fazla organ yetmezliği gibi daha ciddi sağlık sorunları sorumlu 1 , 2 , 3. immün aracılı yan etkileri-endotoksin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlanması nanopartikül örnekleri
- LAL çalışma örnek sınıf su hazırlamak.
- Örnek pH 6-8 aralığının dışında ise, pH pyrogen ücretsiz sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak ayarlayın.
- LAL kullanarak sınıf su çalışma örneği birkaç dilutions hazır olun. En yüksek seyreltme en fazla geçerli seyreltme (MVD) fazla olamaz emin olun. MVD tahmini hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakın.
2. LAL formatları arasında reaktifler ortak hazırlanması
- Seyreltik sodyum hidroksit hisse senedi 0,1 n bir konsantrasyon, çalışan bir çözüm hazırlamak için pyrogen ücretsiz LAL reaktif su kullan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu formülasyon LAL deneyleri içinde test ettikten sonra oluşturulan veri örneği Tablo 1' de gösterilen. Pegile liposomal doksorubisin chromogenic LAL seyreltme 5, müdahale. Ancak, bu girişim büyük dilutions tarafından üstesinden oldu. Spike kurtarma 50 ile % 200 arasında bu formülasyon dilutions 50 ve 500 bulanıklık ve chromogenic LAL yanı sıra, seyreltme 5 bulanıklık LAL olarak test edildi zamandı. Seyreltme faktörü ayarlandığında sonuçları her iki deneyleri dilutions ar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol için sağlanan bilgi15,26 daha önce açıklanan ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA bize veya FDA) ve Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopoeia (USP)4 tarafından yayımlanan farklı düzenleyici belgelere dayanan , 5 , 6 , 27ve kullanılabilir protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) NCL Web sitesi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Çalışma federal fonların Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri, sözleşmeli HHSN261200800001E. Bu yayın içeriğini sayısı veya ilkeleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri yansıtmayabilir ne ticari adlarını, ticari ürünler, söz etmez veya kuruluşların ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bulanıklık LAL Testi | |||
| Sodyum Hidroksit | Sigma | S2770 | Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır |
| Hidroklorik asit | Sigma | H9892 | Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır |
| Cod | T0051'in | LAL Reaktif | Bu reaktif bulanıklık ile kullanılabilir sadece tahlil |
| Kontrol Endotoksin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | Bu reaktif, bulanıklık ve jel-pıhtı tahlilleri ile kullanılabilir |
| LAL dereceli su | Associates of Cape Cod | WP0501 | Bu reaktif herhangi bir LAL formatı ile kullanılabilir |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Beta-glukanlardan |
| yanlış pozitif yanıtı önlemek için kullanılırTek kullanımlık endotoksin içermeyen cam seyreltme tüpleri 12 x 75 mm | Cape Cod | TB240 | Bu tüpler her üç tahlil ile de kullanılabilir |
| Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam reaksiyon tüpleri 8 x 75 mm | Cape Cod | TK100 | Bu tüpler bulanıklık ve kromojenik tahlillerle kullanılabilir |
| 0.25 ve 1.0 mL hacimli pirojen içermeyen uçlar | RAININ | PPT25, PPT10 | Uçlar ve pipetler endotoksini adsorbe edebilir ve LAL testine müdahale eden sızabilir maddeleri serbest bırakabilir. Bu RAININ uçları, LAL tahlilindeki optimum performansları doğrulandığı ve onaylandığı için kullanılır |
| Pirojen içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Diğer eşdeğer sarf malzemeleri kullanılabilir |
| Pirojen ücretli kombiuçlar, 5 mL | Eppendorf | 30089669 | Diğer eşdeğer sarf malzemeleri kullanılabilir |
| Pipetleyici | Eppendorf | 4982000020 | tekrarlayın Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir |
| Mikrocetrifüj | herhangi bir marka | kullanılabilir Herhangi bir marka | |
| Buzdolabı, 2-8 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka | |
| Vorteks | herhangi bir marka | bir marka kullanılabilir | |
| Dondurucu, -20 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka | |
| Pyros Kinetix veya Pyros Kinetix Flex okuyucu | Cape Cod | PKF96 | AssociatesDiğer enstrümanlar da kullanılabilir. Bununla birlikte, bu testte kullanılan LAL reaktifleri ve endotoksin standartları optimizasyon gerektirebilir. Diğer enstrümantasyon kullanıldığında, talimatlar için lütfen cihaza ve LAL kiti üreticilerine bakın |
| Kromojenik LAL Testi | |||
| Cape Cod | CG1500-5'in | Pirokrom LAL Reaktif | Bu reaktif |
| Cape Cod | EC010'un | Kromojenik Test Kontrolü Endotoksin Standart Ortaklarına özgüdürBu standart, bulanıklık ve jel-pıhtı LAL'leri için kullanılandan farklıdır; kromojenik tahlilde optimum performans için optimize edilmiştir | |
| Sodyum Hidroksit | Sigma | S2770 | Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır |
| Hidroklorik asit | Sigma | H9892 | Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 LAL dereceli su arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır |
| Cape | Cod | WP0501 | Bu reaktif, herhangi bir LAL formatlı |
| Glucashield Tamponu ile kullanılabilir | Cape Cod | GB051-25'in | Beta-glukanlardan yanlış pozitif yanıtı önlemek için kullanılır |
| Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam seyreltme tüpleri 12 x 75 mm | Cape Cod | TB240'ın | Bu tüpler her üç tahlil ile de kullanılabilir |
| Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam reaksiyon tüpleri 8 x 75 mm | Cape Cod | TK100'ün | Bu tüpler bulanıklık ve kromojenik deneylerle kullanılabilir |
| 0,25 ve 1,0 ml hacimli pirojen içermeyen uçlar | RAININ | PPT25, PPT10 | Uçlar ve pipetler, endotoksini adsorbe edebilir ve LAL testine müdahale eden sızabilir maddeleri serbest bırakabilir. Bu RAININ uçları, LAL tahlilindeki optimum performansları doğrulandığı ve onaylandığı için kullanılır |
| Pirojen içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Diğer eşdeğer sarf malzemeleri kullanılabilir |
| Pirojen ücretli kombiuçlar, 5 mL | Eppendorf | 30089669 | Diğer eşdeğer sarf malzemeleri kullanılabilir |
| Pipetleyici | Eppendorf | 4982000020 | tekrarlayın Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir |
| Mikrocetrifüj | herhangi bir marka | kullanılabilir Herhangi bir marka | |
| Buzdolabı, 2-8 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka | |
| Vorteks | herhangi bir marka | bir marka kullanılabilir | |
| Dondurucu, -20 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka | |
| Pyros Kinetix veya Pyros Kinetix Flex okuyucu | Cape Cod | PKF96 | AssociatesDiğer enstrümanlar da kullanılabilir. Bununla birlikte, bu testte kullanılan LAL reaktifleri ve endotoksin standartları optimizasyon gerektirebilir. Diğer enstrümantasyon kullanıldığında, talimatlar için lütfen cihaza ve LAL kiti üreticilerine bakın |
| Jel-Pıhtı LAL Testi | |||
| LAL Cape | Cod | G5003 | Bu reaktif, jel-pıhtı testine özgüdür |
| Cod | E0005'in | Endotoksin Standardı Kontrol | Bu reaktif, bulanıklık ve jel-pıhtı tahlilleri ile kullanılabilir |
| Sodyum Hidroksit | Sigma | S2770 | Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır |
| Hidroklorik asit | Sigma | H9892 | Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 LAL dereceli su arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır |
| Cape | Cod | WP0501 | Bu reaktif, herhangi bir LAL formatı ile kullanılabilir |
| Cod | GB051-25'in | Glucashield Tampon OrtaklarıBeta-glukanlardan yanlış pozitif yanıtı önlemek için kullanılır | |
| Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam seyreltme tüpleri 12 x 75 mm | Cape Cod | TB240'ın | Bu tüpler her üç tahlil ile de kullanılabilir |
| Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam reaksiyon tüpleri 10 x 75 mm | Cape Cod | TS050'nin | Bu tüpler jel-pıhtı tahlili ile kullanım içindir |
| 0.25 ve 1 mL hacimli pirojen içermeyen uçlar | YAĞMUR SUYU | PPT25, PPT10 | Uçlar ve pipetler endotoksini adsorbe edebilir ve LAL testine müdahale eden sızabilir maddeleri serbest bırakabilir. Bu RAININ uçları, LAL tahlilindeki optimum performansları doğrulandığı ve onaylandığı için kullanılır |
| Pirojen içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Diğer eşdeğer sarf malzemeleri kullanılabilir |
| Pirojen ücretli kombiuçlar, 5 mL | Eppendorf | 30089669 | Diğer eşdeğer sarf malzemeleri kullanılabilir |
| Pipetleyici | Eppendorf | 4982000020 | tekrarlayın Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir |
| bir marka | mikrocetrifüj | Herhangi bir marka kullanılabilir | |
| Buzdolabı, 2-8 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka | |
| Vortex | herhangi bir marka | bir marka kullanılabilir | |
| Derin dondurucu, -20 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka | |
| Su banyosu, 37 C | herhangi bir marka | Herhangi bir marka kullanılabilir, ancak su sirkülasyonunu kapatmak veya sirkülasyon yapmayan su banyosu kullanmak önemlidir çünkü su akışı pıhtı oluşumunu etkileyecek ve yanlış negatif sonuçlara yol açacaktır |
Kaynaklar
- Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
- Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
