Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Özet

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Özet

Bizim bağışıklık sistemi bir numarası ve bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri (Treg) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli oluşur. Treg hücreler iki alt kümeleri, timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri ve periferik indüklenen Treg (pTreg) hücre bölünmüş olabilir. Vücudumuzun farklı organlarda varsa ve Helios ve Neuropilin 1 gibi özel işaretler tarafından seçkin. Bu tTreg hücreler pTreg hücreleri işlevsel olarak daha baskılayıcı bildirilmiştir. Bu nedenle, türdeş olmayan hücre popülasyonlarının soruşturma ne zaman tTreg ve pTreg hücre oranı belirlemek önemlidir. Burada, biz timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri ve dalağı normoglycemic obez olmayan diyabetik farelerin tTreg hücreleri Akış Sitometresi kullanarak pTreg hücrelerden ayırt etmek için toplanan. El ile tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırladık. Fluorochrome Birleşik yüzey CD4, CD8, CD25 ve Neuropilin 1 antikorlar hücreleri leke için kullanılmıştır. Onlar gece buzdolabında tutuldu. Ertesi gün, hücreleri Birleşik fluorochrome hücre içi Foxp3 ve Helios antikorlar ile lekeli. Bu işaretleri Treg hücreler iki alt kümeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı tek fare timus, dalak ve lenf nodu drene pankreas hücrelerden hazırlamak ve sonraki akış sitometrik çözümlemesi için kullanma a sade ama pratik yol gösterir.

Giriş

Düzenleyici T (Treg) hücreleri bağışıklık sistemi homeostazı için kritik öneme sahiptir. Treg hücreler ifade yüzey antijenleri CD4 ve CD25 ve transkripsiyon faktörü forkhead kutusunu P3 (Foxp3)^1,2,3tarafından tanımlanır. Sakaguchi vd. ilk CD25 yapısal T bastırıcı hücrelerde fareler⁴insan Treg hücreler tanımlaması için öncü bir gözlem sağlanan, ifade edilir gösterdi. Treg hücreler mekanizmaları, Apoptozis, sitokin tüketimi ve inhibisyon sitotoksik ifade yoluyla ikna etmek için granzymes salgısı ile cytolysis dahil olmak üzere çeşitli yoluyla baskılayıcı....

Protokol

Yerel hayvan Etik Komitesi, Uppsala Üniversitesi hayvan deneyleri onaylanmış.

1. hayvanlardan organ hasat

1. Fareler tarafından servikal çıkığı kurban.
2. Timik bezleri yerleştirin ve dalağı 20 mL mercek tüpleri veya 15 mL konik tüpler Hanks´ 5 mL ile dolu dengeli tuz solüsyonu (HBSS). 1.5 mL mikro tüpler RPMI 1640 1 mL ile dolu yer PDLNs. Bütün timus ve dalak ve bütün PDLNs kullanın.
   Not: Organları prosedürü boyunca buzda tutulmalıdır ve araştırmacı timik bağışıklık hücreleri hızlı bir şekilde yüksek sıcaklıklarda düşebilir beri timik doku özellikle işlerken tek hücre süspansiyonlar, hazırlarken hızlı olma....

Sonuçlar

Nrp1 ve tTreg ve pTreg hücreleri üzerinde Helios ifadesi araştırmak için tek hücreleri timik bezleri, PDLNs ve normoglycemic NOD farelerin dalağı hazırlanan ve onları için akış sitometrik Treg hücre işaretli CD4, CD25, Foxp3, Helios ve Nrp1 lekeli analiz. Sonuçları stratejileri (şekil 1) çoğunluğuna temsilcisi gösterildiği gibi analiz edildi. Helios⁺ hücreler arasında CD4 oranı bulduk⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg.......

Tartışma

Bu çalışmada izole timik bezleri, PDLNs ve dalağı NOD farelerin tek hücreleri ve Helios ve CD4 Nrp1 ifadesi soruşturma⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg hücreler Akış Sitometresi kullanarak. Bu da çalışmanın, NOD fareler, hangi tip 1 diyabet fare bir modeldir kullanıldı. Bir önceki çalışmada, biz vahşi türü fare suşları CD-1 ve C57BL/6 fareler Helios veya Nrp1 tTreg hücre pTreg hücrelerden ayırt için daha iyi bir işaret olduğunu araştırmak için kullandık. Bu çalışmada, biz benzer Treg hücre.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NOD fareler			Kurum içi ekmek
HBSS	Statens veterinä rmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4< / sub>Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti	ThermoFisher	00-5523-00	Fiksasyon/Geçirgenleştirme Konsantresi, Fiksasyon/Geçirgenleştirme Seyreltici ve Geçirgenleştirme Tamponu (10x) İçerir
eBioscience Akış Sitometrisi Boyama Tamponu	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoklonal Antikor (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoklonal Antikor (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 Sıçan anti-Fare CD8a	BD Biosciences	560182
Fare Nöropilin-1 APC konjuge Antikor	R& D Sistemleri	FAB5994A
FOXP3 Monoklonal Antikor (FJK-16s), PE-Siyanin7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pasifik Mavisi anti-fare/insan Helios Antikoru	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Geçmeli Kapaklı	CORNING	352235	A 35 &mikro; m naylon ağ, çift konumlu geçmeli kapağa dahil edilmiştir
Tüp 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Mikro tüp 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Tek kullanımlık sintilasyon şişeleri	WHEATON
Akış sitometrisi	BD
Akış sitometrisi analiz yazılımı	Inivai	Technologies Flowlogic