Method Article

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

DOI:

10.3791/58878

⸱

December 8th, 2018

 ,  , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrot dizilerin (ölçü) yaygın olarak nöronal fonksiyon vitroincelemek için kullanılır. Bu cihazlar için uzun dönem eşzamanlı non-invaziv kayıt/stimülasyon elektrofizyolojik faaliyet izin. Ancak, her elektrot çevresinde tüm kaynaklardan gelen sinyalleri algılama özelliği iletişim anlamak ve nöronal devreler yayılmasında sinyal çalışırken olumsuz hale gelebilir. Nöronal ağ çeşitli nöronların aynı anda aktif olması ve çakışan Aksiyon potansiyelleri, ayrımcılık ve sinyal yayma izlemek üzere çıkarabilirsiniz. Bu sınırlama göz önüne alındığında, biz izole ve aksonal sinyalleri yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile yükseltmek yapabiliyor elektrofizyolojik iletişim değerlendirilmesi odaklı bir vitro Kur kurduk. Mikrosıvısal aygıtlar ve ölçü arabirim tarafından biz iyi kontrollü uyum akson ve microelectrodes nöronal kültürlerle bölümlendirirse edebiliyoruz. Bu kurulum birkaç hafta boyunca spike yayma yüksek sinyal gürültü oranı ile kayıtları verir. Özel veri analizi algoritmaları ile birlikte, çeşitli iletişim detaylı miktar sağlar ilgili yayılma hızı, iletim hatası, ateş oranı, Anterograd sivri gibi özellikler ve mekanizmaları kodlama.

Bu iletişim kuralı bir compartmentalized nöronal kültür kurulumu substrat entegre ölçü nasıl oluşturulacağı, nasıl bu kurulum nöronlarda kültür ve başarıyla kaydetmek, analiz etmek ve bu deneylerin sonuçlarını yorumlamak nasıl gösterir. İşte, nasıl kurulan Kur nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma anlayış kolaylaştırır göstermektedir. Bu platformlar yeni vitro modelleri ile mühendislik ve kontrol edilebilir nöronal ağ Topografyaları önünü. İçerikte homojen nöronal kültürlerin, ya da, örneğin, duyusal sinir hücreleri ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi değerlendirildi ve izlendiği ortak kültür konfigürasyonları ile kullanılabilir. Bu kurulum, örneğin, çalışmaya açıkların, nöronal devreler, kodlama, ateş ve neuroregeneration yaklaşımlar bilgi çok ilginç koşullar sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal devreler elektrik iletişimde anlayış normal fonksiyon açığa vurmak ve fonksiyon bozukluğu gidermek için tedavi stratejileri vasiyetle için temel bir adımdır. Nöronlar entegre, hesaplamak ve aksiyon potansiyelleri (APs) onların ince akson yaymak geçiş. Geleneksel elektrofizyolojik teknikleri (Örneğin, yama kelepçe) nöronal aktivite çalışmaya güçlü teknikleri vardır ama genellikle daha büyük hücresel yapılar, soma veya dendrites gibi sınırlıdır. Görüntüleme teknikleri teklif aksonal sinyalleri yüksek uzaysal çözünürlük ile çalışmak için bir alternatif, ama teknik olarak zordur gerçekleştirmek ve uzun vadeli ölçümleri1izin vermez. Bu bağlamda, elektrot dizilerin (ölçü) ve havacilik neuron´s etkinliği ve sinyal iletim nöronal ağlar vitro2 içinde temel özelliklerini ifşa içinde güçlü bir katkı yapabilir , 3.

MEA teknoloji nöronal kültürlerin ekstraselüler kayıtlarda dayanır. Uzun vadeli, eşzamanlı stimülasyon ve kayıt birden çok site ve non-invaziv yolu3desteklemek için onun yetenek bu elektrofizyolojik metodoloji başlıca avantajları şunlardır. Bana cam gofret alt katman içinde gömülü biyouyumlu, yüksek iletken ve korozyona dayanıklı microelectrodes yapılır. Bunlar geleneksel hücre kültür biyo-kaplamalar, hangi hücre adezyon önemli ölçüde teşvik substrat ve hücreleri3,4arasında sızdırmazlık direnç artışı ile uyumludur. Ayrıca, onlar tasarımında çok yönlü ve microelectrodes boyutu, geometri ve yoğunluğu değişebilir. Genel olarak, ölçü olarak geleneksel hücre kültür damarları eşzamanlı canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar/dürtme izin avantajı ile çalışıyorum.

MEA teknolojinin kullanımı, sinir ağları5önemli özellikleri çalışma için katkıda bulunmuştur. Ancak, iletişim ve nöronal devre yayılmasında APs eğitimi için bana performansını sınırlayan doğal özellikleri vardır. Bana tek hücreleri ve aksonlar gibi bile hücre altı yapıları kayıtları etkinleştirir ancak somal sinyallere karşılaştırıldığında çok düşük sinyal-gürültü oranı (SNR)6aksonal sinyalleri var. Ayrıca, hücre dışı alan potansiyelleri her elektrot çevresinde tüm kaynaklardan gelen algılama karakteristik sinyal yayma nöronal devre izleme engellemektedir.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda, ancak, daha iyi kayıt koşulları içinde dar mikro içine aksonlar büyüyebilir uyumlu microelectrodes alarak elde edilebilir göstermiştir. Bu yapılandırma, öyle ki aksonal sinyaller yayma kolayca olabilir7,8,9,10,11,12SNR önemli bir artış tespit sağlar, 13. Bir elektriksel olarak yalıtılmış microenvironment aksonal sinyalleri11yükseltmek uygun mikrosıvısal aygıtları MEA teknolojisi ile İttifakı gayet stratejisi oluşturur. Ayrıca, birden çok algılama microelectrodes bir microgroove boyunca varlığını algılama ve aksonal sinyal yayma karakterizasyonu için esastır.

Böyle vitro platformları ile son derece kontrol edilebilir nöronal ağ Topografyaları birçok araştırma soruları14için adapte edilebilir. Bu platformlar nöronal kültür bağlamında kullanılmak üzere uygundur ama ortak kültür yapılandırmaları, sinir hücreleri ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi nerede izlenen ve değerlendirildi mühendisi için genişletilebilir. Bu kurulum böylece sinirsel ilgili çalışmaları açıkların, nöronal devreler, bilgi kodlama, ateş ve neuroregeneration gibi bir dizi keşfetmek için çok ilginç koşullar sağlar. Ayrıca, onun insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler15,16 ortaya çıkan modelleri ile birlikte yeni yollar sinir sistemini etkiler insan hastalıkları için potansiyel tedavilerin geliştirilmesinde açabilirsiniz.

Laboratuarımıza bu platformu microelectrodes Havacilik (µEF) ile birleştiren cep ve ağ düzeyinde ve onların dolaylı fizyo - ve patolojik sinir sistemi nöronal süreçleri anlamak için kullanıyor. Böyle platformu Nörobilim alanında değeri göz önüne alındığında, bu iletişim kuralının amacını nasıl bölümlere nöronal kültür substrat entegre ölçü üzerinde oluşturmak için göstermektir kültür nöronlar bu platform ve başarılı bir şekilde kayıt nasıl yapılır analiz ve bu deneylerin sonuçlarını yorumlamak. Bu iletişim kuralı kesinlikle sinirsel iletişim çalışmada nöronal kültürler için deneysel araç zenginleştirmek olacak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları hayvanları içeren Avrupa Birliği (AB) yönergesi 2010/63 / (Portekizce mevzuatı Decreto-Lei tarafından 113/2013 aktarılması) AB göre yapıldı. Deneysel protokol (0421/000/000/2017) hayvan refahı ve deneme (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) her iki Portekizce resmi yetki ve ana kurum Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hazırlanması Kültür Medya ve diğer çözümleri

Not: Taze kullanımı günde kaplama çözümleri hazırlayın. Kullanılmayan kaplama çözümleri ve Kültür medya-20 ° C veya 4 ° C altında detaylı olarak depolanabilir.

  1. 10 mL %0,05 (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) çalışma çözüm hazırlamak.
    1. Arıtılmış PEI çözülerek 20 mL % 0.25 (w/v) PEI stok çözeltisi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) steril su.
    2. 8 mL steril distile su içinde %0.25 (w/v) PEI stok çözelti 2 mL seyreltik. Mix iyi ve kullanın. Kullanılmayan çözüm 4 ° C'de depolanan
  2. 1 mL 5 µg/mL laminin çözeltisi hazırlamak.
    1. Seyreltik çözeltinin 1 mg/mL laminin hisse senedi bazal orta 995 µL içinde 5 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Mix iyi ve kullanın. Kullanılmayan çözüm-20 ° C'de dondurulmuş 1-2 haftaya kadar saklanabilir.
  3. Hank'in HEPES tampon dengeli tuz solüsyonu (H-HBSS) 1 litre hazırlayın.
    1. 1 M HEPES çözüm HEPES toz Ultrasaf Su 50 ml 11.9 gram çözülerek hazırlayın. PH 7.2 için ayarlayın.
    2. H-HBSS çözüm (kalsiyum ve magnezyum) olmadan 5,33 mM potasyum klorür, 0,44 mM potasyum fosfat Yem mono, 138 mM sodyum klorür, 0.3 mM sodyum fosfat dibasic ve 800 mL Ultrasaf Su 5.6 mM glikoz çözülerek hazırlayın.
    3. 15 mL 1 M HEPES çözeltisi (15 mM son konsantrasyonu) ekleyin.
    4. PH 0,2-0,3 için ayarla birim istenen pH 7.4 1 kullanarak aşağıda N HCl veya 1 N NaOH. Nihai çözüm birimini oluşturan ultrasaf su ekleyin.
      Not pH filtrasyon sırasında artış eğilimindedir.
    5. Kullanarak bir 0,22 µm gözeneklilik poly(ether sulfone) (PES) membran filtrasyon tarafından sterilize.
  4. 10 mL hazırlamak H-HBSS % 10 içeren ısı-Fetal sığır Serum (hiFBS) inaktive olur.
    1. HiFBS H-HBSS 9 ml 1 mL seyreltik. Mix iyi ve kullanın. Kullanılmayan çözüm 4 ° C'de 3-4 hafta boyunca saklanır.
  5. 1.5 mg/mL 5 mL tripsin çözüm hazırlamak.
    1. Kullanımdan hemen önce H-HBSS 5 ml tripsin 7.5 mg geçiyoruz. Kullanarak 0,22 µm porozite PES membran filtrasyon tarafından sterilize.
  6. 50 mL ilave orta hazırlayın.
    1. Bazal orta 48,5 mL 50 mL konik tüp içinde karıştırın (bakınız Tablo malzemeler), % 2 (v/v) B-27 ek, 0,5 mM L-glutamin ve % 1 kalem/Strep (10.000 U/mL penisilin ve 10.000 µg/mL streptomisin). İlave orta 4 ° C'de 3-4 hafta boyunca saklanır.

2. mikrosıvısal ve MEA cihazların hazırlama

Not: bir gün önce hücre tohum adımları 2.1-2,11 gerçekleştirin.

  1. Temiz mikrosıvısal cihazlar imalat ve vinil bant kullanarak diğer enkaz kaldırmak için. Teyp aygıtının tüm alanlarda ulaşmak için aygıt karşı hafifçe bastırın.
  2. Plazma-temiz yüzeyi temizlemek ve daha hidrofilik sağlamak için MEA 3 dk (0.3 mbar) hava.
  3. Kısaca mikrosıvısal aygıt % 70 etanol içinde daldırın ve onları bir laminar akış başlık içinde kurumasını sağlar.
  4. Her MEA bir steril 90 mm Petri kabına yerleştirin ve ultraviyole (UV) ışık pozlama tarafından 15 dakika sterilize.
  5. MEA merkezi yüzey alanı 500 µL için en az 1 h 37 ° C'de % 0.05 (v/v) PEI çözümü ile kuluçka tarafından kat
    Not:17başkaları tarafından açıklandığı gibi bana PEI kaplama poly(lysine) kaplama kullanmaktan daha kümeleme daha az hücre sonuçlanır.
  6. PEI kaplama çözüm MEA yüzeyinden Aspire edin ve bana 4 yıkama x ile 1 mL steril distile su. Bu elektrotlar zarar verebilir gibi adımları yıkama sırasında MEA yüzeyine dokunmamasını dikkat et.
  7. Laminar akış çuval içinde bir stereomicroscope rehberliğinde, MEA çip ortalayın ve 1 mL steril su MEA merkezi alanına ekleyin.
  8. Mikrosıvısal aygıt MEA yüzey üzerine yerleştirin.
  9. Dikkatle mikrosıvısal aygıt microgrooves MEA elektrot kılavuz ile hizalayın.
  10. Düzgün hizalanmış zaman dikkatle fazla suyu MEA veya mikrosıvısal aygıt dokunmadan Aspire edin.
  11. µEFs gecede 37 ° C'de kuru ve tam ek izin vermek için kuluçkaya. Eki kolaylaştırmak için bana karşı mikrosıvısal cihaz hafifçe bastırın.
    Not: adım 2.12 tohum hücre gününde gerçekleştirin.
  12. µEFs tamamen kurumuş mikrosıvısal wells 150 µL 5 µg/mL laminin kaplama çözüm ile yük ve hücre tohum önce en az 2 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: çözüm microgrooves doldurur µEF laminin çözüm ile yüklenirken, emin olun. bir vakum içinde microgrooves mevcut olabilecek herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için kullanın.

3. prefrontal korteks diseksiyon

  1. Diseksiyon alan embriyo kaldırılması için hazırlamak.
    1. Çalışma yüzeyi ve % 70 etanol ile cerrahi aletler dezenfekte edin.
      Not: Bu diseksiyon steril müdahale olmasa da, dezenfeksiyon kirliliği azaltmak için yardımcı olur.
    2. Temiz tek kullanımlık çocuk bezi diseksiyon alanı sınırlamak ve embriyo temizlenmesine yönelik Cerrahî aletler düzenlemek için kullanın.
    3. 4 90 mm Petri yemekler soğuk H-HBSS ile dolu hazırlamak ve onları buz diseksiyon alanının yakınında bir tepsiye yerleştirin.
  2. Bir E-18 zaman hamile Wistar sıçan tarafından karbondioksit (CO2) inhalasyon ötenazi.
  3. Yordamı tamamlandığında, hayvan CO2 odasından kaldırın ve ötenazi, kan kaybı gibi ikincil bir yöntem tarafından ölüm onaylayın.
  4. Hayvan ventral haricinde tek kullanımlık çocuk bezi yerleştirin, alt karın % 70 etanol ile sprey ve forseps ve makas yardımı ile rahim ortaya çıkarmak için deri yoluyla kesilmiş bir U şekli olun.
  5. Dikkatle embriyoların rahim uzak herhangi bir bağ dokusu keserek kaldırmak ve bir Petri yemekler soğuk H-HBSS ile koyun.
  6. Her embriyo embriyonik onun sac kaldırma ve forseps ve makas yardımı ile embriyo başını kesmek.
  7. Embryo´s kafa soğuk H-HBSS ile dolu ikinci bir Petri kabına aktarın.
  8. 3.6-3.7 her embriyo için yineleyin.
  9. Prefrontal korteks incelemek.
    1. Bir embryo´s başı üçüncü bir Petri kabına aktarın.
    2. Forseps çifti beyin ortaya çıkarmak için kullanın.
    3. Beyin onun boşluğundan kaldır ve soğuk H-HBSS ile kaplayın.
    4. Varsa, kaldırmak ve olfaktör soğanları atın. Prefrontal korteks teşrih ve meninkslerde kaldırın.
    5. Prefrontal korteks parçaları soğuk H-HBSS ile dolu dördüncü Petri kabına aktarın.
    6. 3.9.1 - 3.9.5 her embriyo için adımları yineleyin.

4. kortikal nöronlar ayrılma ve µEF kültür

Not: bir 15dk UV sterilizasyon döngüsü sonra aşağıdaki yordamları bir laminar akış başlık içinde yapıldı. Yüzey alanı ve kapağın yerleştirilen tüm malzemeler çalışma % 70 etanol ile daha önce dezenfekte.

  1. 1.5. adımda açıklandığı gibi H-HBSS 5 ml daha önce ağırlıklı tripsin dağıtılması ve çözüm filtre.
  2. Daha önce 5 mL H-HBSS de toplamda disseke korteks parçaları toplamak. Onları steril 15 mL konik tüp aktarın.
  3. 2.3 mL taze hazırlanmış 1.5 mg/mL tripsin çözeltisi korteks parçaları içeren tüp ekleyin.
  4. Süspansiyon mix ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya (kısaca her 5 dk da tahrik).
  5. Doku sindirim durdurmak ve tripsin yıkamak.
    1. Tripsin içeren süpernatant atmak. Kalan tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için H-HBSS içeren % 10 hiFBS 5 mL ekleyin; yavaşça kışkırtmak.
    2. Sakin olun ve süpernatant atın korteks parçaları izin.
    3. HiFBS artıkları kaldırmak için H-HBSS 5 mL ekleyin. Sakin olun ve süpernatant atın korteks parçaları izin.
    4. Tekrar korteks parçaları H-HBSS 5 mL ile yıkayın.
    5. Sakin olun ve süpernatant atın korteks parçaları izin. 5 mL ilave nöronal orta de ekleyin.
  6. Mekanik olarak yavaş yavaş yukarı ve aşağı için pipetting tarafından korteks parçaları 5 mL gonore pipet ile ayırmak 10 - 15 kez. Gerekirse, hücre süspansiyon homojen olana bir küçük kalibreli pipet kullanarak yordamı yineleyin.
  7. Kalan undissociated dokularda hücre süspansiyon yalak 40 µm hücre süzgeç filtre uygulayarak atın.
  8. Hücrelerin sayısı ve hücre yoğunluğu belirlemek.
    1. Bir microtube %0,4 (w/v) Trypan mavi bir 20 µL hücre süspansiyon için 20 µL ekleyin. Homogenate de çözüm mix ve 10 µL odası sayma bir Neubauer aktarmak.
    2. Hücrelerin sayısı ve hücrelerin hücre yoğunluğunu belirlemek.
  9. 3.6 x 107 hücre/mL hücre yoğunluğu ayarlayın (hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi gerekirse).
  10. Tohum hemen önce hücre laminin kaplama µEF Bütün kuyulardan kaldırın. µEF aksonal bölmenin her şey için ilave orta 50 µL pipet.
  11. Hücre süspansiyon µEF somal yerde 5 µL tohum. Yüzey hücreleri eki izin vermek için 1 h, 37 ° C'de kuluçkaya.
  12. Yavaşça her doldurmak de, µEF ile ısıtılan desteklenmiştir orta. µEF % 5 CO2ile sağlanan 37 ° C'de bir nemlendirici kuluçka aktarın.
    Not: hızlı kültür orta buharlaşma önlemek için µEF taşıyan Petri kabına içinde su ile dolu bir açılan microtube yerleştirin.
  13. Kültürler her ikinci-üçüncü gün kültür kültür orta % 50'si eski yerine koymak için gerekli süre korumak.
    Not: deneyler sonra Havacilik bana su µEF gecede çeker tarafından Ilişkisi kesildi. Gerekirse, havacilik forseps yardımıyla hafifçe kabuğu. Bana bir %1 (v/v) ticari enzimatik deterjan ile gece kuluçka tarafından temizlenir ( Tablo malzemelerigörmek).

5. kayıt spontan nöronal aktivite

Not: 7 gün tüp bebek (DIV), al ama 2-3 hafta (14-21 DIV olgun ve sergilemek için) etkinliği kararlı olarak embriyonik kortikal nöron kültürler üzerinde ölçü genellikle spontan aktivite sergilemek. Çalışma hedefler üzerinde dayalı elektrofizyolojik ölçümleri başlatmak karar deneyci kalmıştır. Bu protokol için bir ticari kayıt sistemi kullanarak kayıt µEF nöronal etkinliği gösterilmiştir ( Tablo reçetesi donanım Ayrıntılar için bakınız), Isıtma modülü ile dahil. Kayıtları gerçekleştirmek için serbestçe kullanılabilir bir yazılım kullanılan ( Tablo reçetesi yazılım Ayrıntılar için bakınız).

  1. Kayıt sistemi ve sıcaklık denetleyicisi MEA açmak ve 37 ° c ulaşmak için pre amplifikatör ısıtmalı taban plakası izin
    Not: uzun süreli kayıtlar için (> 30 dk bir anda) bir de bir CO2 atmosfer tutar bir sistem olmalıdır.
  2. µEF pre amplifikatör (headstage) koyun.
    Not: MEA çip doğru kenar sol üst referans numarası ile uyumlu olun. Kullandığımız MEA çip rotasyonel simetrik olmakla beraber bu hizalama elektrotlar ve donanım kimliklerini PIN düzenini doğru yönünü eşleşir.
  3. Kapatın ve pre amplifikatör kapak mandalı.
  4. Kaydetmek için kayıt yazılımı açın ve kayıt parametrelerini ve (nasıl kurulur bir kayıt düzeni Ayrıntılar için yazılımının kılavuzuna bakın) kaydedilen veri akışlarını yolunu tanımlayın.
    Not: Bir 20 kHz örnekleme oranı ile yeterince genellikle çoğu uygulama için değil. Yüksek örnekleme sıklığı daha hassas spike zamanlamaları gerekliyse, tavsiye edilir. Bir kayıt sivri için çalışırsa, yüksek geçiren filtre alt frekans bileşenlerinin sinyal azalt 300 Hz de ayarlayın. Ham ve filtre uygulanmış verileri aynı anda kaydedilirse, bu önemli ölçüde veri dosya boyutunu artırır. Her zaman çevrimdışı ham veri filtreleme yapmak mümkündür. Veriyi azaltmak için dosya boyutu bir kayda (örneğin, tek microelectrodes microgrooves içinde) hangi microelectrodes da sınırlayabilirsiniz.
  5. Veri toplama başlatmak için DAQ Başlat'ı tıklatın. Ekranda çalışan izleri etkinliği ve kayıt başlatma mesajı kontrol edin.
    Not: Gürültü seviyesi genellikle biraz yüksek microgrooves için karşılık gelen microelectrodes. Gürültü seviyesi çok yüksek ise (pik pik genlik > 50 µV) ya da kararsız birkaç microelectrodes içinde iyi bir PIN pad temas engelleyen kir nedeniyle olabilir. Bu sorun genellikle yavaşça MEA kişi yastıkları ve % 70 etanol ile ıslatılmış bir pamuk bez kullanarak pre amplifikatör pimleri temizleyerek çözülmüştür.
  6. Kaydedilen dosyayı analiz yazılımı açın (hızlı bir şekilde verileri incelemek için Malzemeler tablobkz:).

6. veri analizi

Not: Aşağıdaki adımlar µSpikeHunter yazılım, Aguiar'ın Laboratuvarı (pauloaguiar@ineb.up.pt için e-posta servisinin serbestçe kullanılabilir), µEF ile kaydedilen verileri çözümlemek için geliştirilen bir hesaplama aracı kullanmayı gösterir. Bir grafik kullanıcı arabirimi (Şekil 2) verileri yüklemek, yayılıyor spike dalgalar tanımlamak, kendi yönünü belirlemek için kullanılır (Anterograd ya da retrograd) ve yayılma hızları tahmin ediyoruz. µSpikeHunter 60, 120 ve 256-elektrot ölçü ile birlikte kullanılan MEA2100 ailesi sistemleri kullanılarak elde kayıtlarından oluşturulan HDF5 dosyaları ile uyumludur. Çok kanallı deneyci kullanılarak elde kayıtları kolayca serbestçe kullanılabilir yazılım kullanarak HDF5 dosyalarına dönüştürülebilir ( Tablo malzemelerigörmek).

  1. Kayıt dosyası seçmek için Gözat ' ı tıklatın. Sonra örnekleme hızı, kayıt süresi gibi (Örneğin, ham veri, filtre uygulanmış verileri) kaydedilen veri akışlarını bir liste listelemek için dosya bilgileri düğmesini tıklatın.
    Not: için doğru yayılma hızı tahminlerini, ham veri akışı analizi için seçmek için önerilir.
  2. Analiz için microelectrodes (tek satır ya da microgroove ile ilişkili sütun) seçin ve 6 sinyal gürültü standart sapma (SD) x spike algılama eşik değeri (pozitif veya negatif faz) ayarlayın. Olay dedektörü uygulayıp tanımlanan yayma dizileri elde etmek için Read Data düğmesini tıklayın.
    Not: şartlar yerine gelirse, algılanan yayma sıralarının listesini analiz paneli dolduracaktır. Kullanıcı sonra görüntüleyebilir ve gerilim izleri, arası elektrot çapraz korelasyon, tek-sıra yayılma hızları, bir kymograph ve bir ses çalma aracı gibi yayılma sırası için birkaç analiz araçları ile etkileşim. Yayılma hızı tahmini microelectrodes veya tüm çiftleri için tahminleri ortalaması olarak herhangi bir çift için elde edilebilir olsa da, bu tahmini en uzak çift seçtiyseniz daha güvenilir.
  3. Faiz elektrot kümeleri için önceki adımı yineleyin. CSV dosyasına tüm tanımlanan yayma serileri için Tüm olayları kaydetmek zaman ve genlik sivri (her microelectrodes üzerinde) kaydetmek için her zaman'ı tıklatın.
  4. CSV dosyaları veri analiz ortamına (Örneğin, ateş oranı, arası spike aralıkları) kültürünün aktivitesinin kalıplarının daha fazla çözümleme için almak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokolü kullanarak, E-18 sıçan kortikal nöronlar üzerinde µEF numaralı seribaşı geliştirmek ve bir aydan fazla için bu kültür koşullarda sağlıklı kalmak edebiliyoruz. En kısa zamanda 3-5 gün içinde kültür, kortikal nöronlar onların aksonlar ile microgrooves µEF (Şekil 1) aksonal bölmesinin doğru büyür. 15 gün sonra kültür, kortikal nöronlar üzerinde µEF kültürlü sürekli düzeylerini faaliyet göstermesi beklenen ve aksiyon potansiyelleri micr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokolü nasıl bir mikrosıvısal aygıtı ve bir MEA standart ticari olarak mevcut tasarımları ile oluşan bir µEF montajı ve kaydedilen verileri çözümlemek nasıl gösterir.

Bir deney tasarımı yaparken, araştırmacılar vitro modeli microgroove ayarlamaları kısıtlar MEA sabit kılavuz tarafından sınırlı olduğu dikkate almak gerekir. Belirli mikrosıvısal veya MEA tasarım kullanımı belirli deneysel ihtiyaçlarına bağlı olacaktır ama genel olarak, aynı yordamı adımları farklı µEF ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser FEDER - yarışmak 2020 yoluyla Fundo Europeu de Desenvolvimento bölgesel para tarafından finanse edildi - Operacional programı için rekabet ve küreselleşme (POCI), Portekiz 2020 ve Portekizce tarafından fon FCT - Fundação para Ciência e bir Teknoloji / Ministério da Ciência, PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623) projesi çerçevesinde teknoloji e Ensino çift. José C Mateus FCT (PD/BD/135491/2018) tarafından desteklenmiştir. Paulo Aguiar Programa Ciência - Programa Operacional Türk Humano (POPH) - promosyon bilimsel istihdam, ESF ve MCTES ve program Investigador FCT, tarafından POPH ve Fundo sosyal Europeu desteklenmiştir. Mikrosıvısal aygıtları INESC - Microsystems ve Nanoteknolojide, Portekiz, João Pedro Conde ve Virginia Chu gözetiminde fabrikasyon.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
B-27 Tamamlama (50X)Thermo Fisher ScientificLTI17504-044
Dallı poli (etilen imin) (PEI), 25 kDaSigma-Aldrich408727Dallı PEI'yi 4 ° C'de 3 gün boyunca 2,5 kDa'lık bir kesme membranı kullanarak diyaliz ile saflaştırın; 5 mM HCl çözeltisine karşı C (günlük olarak yenilenir). Saflaştırılmış PEI'yi dondurarak kurutun.
Hücre süzgeci (40 & mikro; m) Falcon352340
Konik mikrotüpler (1.5 ml)VWR211-0015
Tek kullanımlık bebek bezi, 60x40 cmBastos Viegas SA455-019
Forseps Dumont #5, düzGüzel Bilim Araçları91150-20
Forseps Dumont #5/45Güzel Bilim Araçları11251-35
Forseps Dumont #7, kavisliGüzel Bilim Araçları91197-00
Isı İnaktive Fetal Sığır Serumu PremiumBiowestS181BH-500ML
Engelbreth-Holm-Swarm'dan Laminin Sigma-AldrichL2020-1MGTozu ilgili takviye edilmemiş ortam hacminde çözerek 1 mg / mL'de laminin stok çözeltisi hazırlayın. Laminin solüsyonunu -20 ° C'de saklayın; Küçük alikotlarda C (20 &mikro; L) tekrarlanan donma/çözülme döngülerini önlemek için.
L-Glutamin 200mM Thermo Fisher ScientificLTID25030-024
Neubauer geliştirilmiş sayma odası (hemositometre)Marienfeld630010
Nörobazal Ortam (1X)Thermo Fisher Scientific21103-049Nöronal kültürler için kullanılan bazal ortam
PDMS mikroakışkan cihazlar uygulanamaz,uygulanamaz450 & mu ile 20 mikro oluk ile birbirine bağlanmış iki hücre tohumlama bölmesinden oluşur; m uzunluk ve süreler; 10 & mu; m yükseklik ve süreler; 14 μ m genişlik boyutları ve 86 & mikro ile ayrılmış; m (100 &mu'nun toplam arası; m).
Penisilin-streptomisin (P / S) çözeltisi (100X)BiowestL0022-100
PES şırınga filtre ünitesi (Ø 30 mm), 0.22 &mikro; m Frilabo1730012
Polipropilen konik tüpler, 15 mlThermo Fisher Scientific07-200-886
Polipropilen konik tüpler, 50 mlThermo Fisher Scientific05-539-13
Polistiren disposabel serolojik pipetler, 10 ml Thermo Fisher Scientific1367811D
Polistiren tek kullanımlık serolojik pipetler, 5 ml Thermo Fisher Scientific1367811D
Standart Rejenere selüloz membran (2 kDa)   Spektrum laboratuvarları132107
Standart cerrahi makasGüzel Bilim Araçları91401-14
Substrat entegreli düzlemsel MEA'lar (256 mikroelektrot)Çok Kanallı Sistemler256MEA100/30iR-ITO252 titanyum nitrür (TiN) kayıt elektrotları ve 16'ya 16 kare ızgarada düzenlenmiş 4 dahili referans elektrotu. Her kayıt elektrodu 30 & mikro; m çapında ve 100 &mikro;m aralıklı.
Şırınga luer-lock ucu, 10 ml Terumo Europe5100-X00V0
Şırınga luer-lock ucu, 50 ml Terumo Avrupa8300006682
Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287 MEA'ların temizliğinde kullanılan enzim aktif toz deterjan
Doku kültürü plakaları, 35 mm Kök Hücre Teknolojileri27150
Doku kültürü plakları, 90 mmFrilabo900095
Tripan Mavisi çözeltisi (%0.4) Sigma-AldrichT8154
Tripsin (1:250)Thermo Fisher Scientific27250018
Vinil bant 4713MB40071909

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
  2. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  3. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2014).
  4. Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
  5. Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
  6. Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181(2013).
  7. Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
  8. Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
  9. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
  10. Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
  11. Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
  12. Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514(2015).
  13. Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868(2017).
  14. Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
  15. Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
  16. Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
  17. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
  18. van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
  19. Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11(2006).
  20. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  21. Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DevicesMicroelectrode ArraysNeuronal CommunicationAxonal Signal PropagationCompartmentalized CultureSpike PropagationPropagation VelocityConduction FailureFiring RateAnterograde Spikes

Related Articles