Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil
Bu makalede
Özet
Özet
Ateroskleroz kardiyovasküler hastalık (CVD) yol açar. Hala belirsiz olup kolesterol HDL (cHDL) konsantrasyon ateroskleroz gelişmede nedensel bir rol oynar. Ancak, önemli bir aterom plak oluşumu, erken evrelerinde kolesterol sızma kapasitesi HDL (makrofajlar kolesterolden kabul etme yeteneği HDL parçacıkların) için faktördür köpük hücre oluşumunu önlemek için. Bu endotel ve ters kolesterol taşıma (RCT) kolesterol karaciğer yoluyla ortadan kaldırmak için bir parçası kolesterol birikimi kaçınmak önemli bir adımdır. Kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri biyomarker ateroskleroz için kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. Geleneksel olarak, [3H]-kolesterol kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılır. Bu çalışmada, floresan etiketli-kolesterol (NBD-kolesterol) kullanarak daha güvenli ve daha hızlı bir strateji geliştirmek için THP 1 türetilmiş makrofajlar kolesterol alımı ve sızma sürecinde izlemek için hücresel bir tahlil amacımız. Son olarak, biz optimize etmek ve NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Giriş
Dünya Sağlık Örgütü göre iskemik kalp hastalığı ve inme (muhasebe 15.2 milyon ölüm olmak üzere toplam)1ölüm dünya çapında geçerli asıl nedenleri vardır. Ateroskleroz ve kan damarları2,3' te aterom plak yırtılması tarafından öncesinde kardiyovasküler hastalık (CVD) ikisi de.
Ateroskleroz makrofajlar, T hücreleri, mast hücreleri ve dendritik hücreler endotel sızmak ve sonunda aterosklerotik plaklar oluşturan kan birikir bir gemi Duvar iltihabi bir hastalıktır. Aterosklerotik plaklar çekirdek ve kolesterol kristalleri, yüksek çözünürlüklü B-mod ultrasonografi öl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada, etik kurul onayı (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, hastane Kliniği, Barcelona; onay numarası HCB/2014/0756) ve yazılı tüm konulardan haberdar izni elde edilmiştir.
1. NBD-kolesterol hazırlık
- NBD-stok (2 mM) elde etmek için kolesterol (MW 494.63; bkz: Malzemeler tablo) saf etanol geçiyoruz. 10 mg flakon için tüm şişe içeriği 2 mM hisse senedi almak için etanol 10,1 mL hacminde geçiyoruz.
- RPMI % 10 fetal Sığır serum ve %5 penisilin/streptomisin ile (R10 orta) takıma 5 mikron son bir konsantrasyon ulaşmak için 1640 stokta NBD kolesterolden oranında seyreltin (örneğin, NBD-kolestero....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kolesterol sızma tahlil vitro bir verilen serum, plazma veya HDL parçacıkları içeren süpernatant kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için amaçtır. Etiketli-kolesterol bir standart makrofaj hücre kültürünü bir kültürün içine yükleme ve FBS ücretsiz medya ile hücre içine seyreltilmiş test örnek ile iletişim inducing yöntemi oluşur. Son olarak, NBD floresan düzeylerinden medya ve hücre lysate olarak ölçülür. Ölçümler en iyi duruma getirmek için hücreleri effluxed kolesterolden medya için etanol içeren bir çözücü bir ha.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Floresan etiketli kolesterol çözümlemek ve özellikleri ve metabolizma doğal kolesterol tüp bebek araştırmak için umut verici bir stratejidir. Başlıca avantajları vardır bu hücreleri tarafından alınabilir, hücre içi sağlar ve membran dağıtım çalışmaları ve kolesterol sızma deneyleri bu Protokolü (Şekil 7) olduğu gibi bu tür uygulanabilir. Bazı floresan etiketli steroller kolesterol izleme BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol ve 22 - ve 25-NBD-kolesterol12<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar mucitler başlıklı patent başvuru (EPO; 18382337.6-1118; 17 Mayıs 2018) olduğunu bildirmek istiyorum "kolesterol sızma belirlemek için yöntem" dayalı bu yöntemi.
Teşekkürler
Bu eser kısmen tarafından desteklenen araştırma FIS (PS12/00866) Instituto de Salud Carlos III, Madrid, İspanya üzerinden; verir. Fondo Europeo para el Desarrollo bölgesel (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-sayımlı (RD16/0025/0002) ve eğer programı / Generalitat de Catalunya. Yazarlar Retrovirology ve Viral Immunopathology laboratuvar Institut d'Investigacions Biomèdiques Ağustos Pi I Sunyer (IDIBAPS) teşekkür ederiz. Biz T. Escribà, C. Rovira ve C. Hurtado onların yardım ve bilgi ve Teknoloji Transfer Ofisi S. Cufí korumak icat onun rehberlik için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 oyuklu toplama plakası | Corning Inc | Costar 3912 | opak şeffaf tabanlı beyaz 96 oyuklu plaka |
| 96 oyuklu kültür plakası | Corning Inc | Costar 3610 | beyaz 96 oyuklu plaka düz şeffaf |
| dipliKolesterol Akış Test Kiti (Hücre bazlı) | Abcam | ab196985 | ticari yüksek verimli hücre bazlı tahlil kiti, kolesterol akışı |
| renksiz RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640, pehnol-kırmızı |
| Gen5 Veri Analiz Yazılımı | olmadan BioTek | Sürüm 2.0 | |
| Glisin | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glisin, hayvansal olmayan kullanım |
| Luminometre | Biotek | SYNERGY HT | Çoklu Algılama Mikroplaka |
| Okuyucu Lizis Çözeltisi 1 | kurum | 50 mM Tris Tamponu, 150 mM NaCl ve H2O | |
| Lizis Çözeltisi 2 | kurum | Saf etanol ve Hücre Lizis Çözeltisi 1:1 (v:v) | |
| NBD-kolesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oksa-1,3-Diazol-4-il)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Fosfat tamponlu tuzlu |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polietilen glikol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-asetat. |
| %10 | fetal sığır serumu ve %5 Penisilin/Streptomisin ile desteklenmiş R10 | kurum | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640, 1.5 g/L sodyum bikarbonat ve 4.5 g/L glikoz içeren 2 mM L-glutamin |
| ile THP-1 hücreleri | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | bir yaşındaki bir bebekten lösemiden türetilen monosit benzeri çizgi |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Kaynaklar
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
