Tüp bebek kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri için gelecek vaat eden bir araç olarak bir biyomarker ateroskleroz için ölçümdür. Bu da çalışmanın, biz optimize etmek ve bir floresan NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil
Bu makalede
Özet
Özet
Ateroskleroz kardiyovasküler hastalık (CVD) yol açar. Hala belirsiz olup kolesterol HDL (cHDL) konsantrasyon ateroskleroz gelişmede nedensel bir rol oynar. Ancak, önemli bir aterom plak oluşumu, erken evrelerinde kolesterol sızma kapasitesi HDL (makrofajlar kolesterolden kabul etme yeteneği HDL parçacıkların) için faktördür köpük hücre oluşumunu önlemek için. Bu endotel ve ters kolesterol taşıma (RCT) kolesterol karaciğer yoluyla ortadan kaldırmak için bir parçası kolesterol birikimi kaçınmak önemli bir adımdır. Kolesterol sızma kapasitesi serum veya plazma makrofaj hücre modelleri biyomarker ateroskleroz için kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. Geleneksel olarak, [3H]-kolesterol kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılır. Bu çalışmada, floresan etiketli-kolesterol (NBD-kolesterol) kullanarak daha güvenli ve daha hızlı bir strateji geliştirmek için THP 1 türetilmiş makrofajlar kolesterol alımı ve sızma sürecinde izlemek için hücresel bir tahlil amacımız. Son olarak, biz optimize etmek ve NBD-kolesterol sızma yöntemi standartlaştırmak ve 96-şey plakaları kullanarak yüksek üretilen iş çözümlemesi geliştir.
Giriş
Dünya Sağlık Örgütü göre iskemik kalp hastalığı ve inme (muhasebe 15.2 milyon ölüm olmak üzere toplam)1ölüm dünya çapında geçerli asıl nedenleri vardır. Ateroskleroz ve kan damarları2,3' te aterom plak yırtılması tarafından öncesinde kardiyovasküler hastalık (CVD) ikisi de.
Ateroskleroz makrofajlar, T hücreleri, mast hücreleri ve dendritik hücreler endotel sızmak ve sonunda aterosklerotik plaklar oluşturan kan birikir bir gemi Duvar iltihabi bir hastalıktır. Aterosklerotik plaklar çekirdek ve kolesterol kristalleri, yüksek çözünürlüklü B-mod ultrasonografi ölçümleri karotis intima media kalınlığı4,5tarafından kanıtlanan bir lipid mevcut. Makrofajlar, kolesterol sızma lipid alıcısı parçacıklar doğru ve çöpçü reseptör SR-BI aracı ATP-bağlayıcı kaset (ABC) reseptörleri ABCA1, ATP bağlama kaset Alt familya G üye 1 (ABCG1) tarafından yapılır. Kolesterol akını ve sızma makrofajlar içinde dengesizlik ateroskleroz başlatma6anahtar bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol sızma periferik doku için plazma kolesterol eleme önemli bir adım ve karaciğer ters kolesterol taşıma (RCT) denen bir süreç olarak kabul edilir. Kolesterol yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) parçacıklar yüzeyinde bulunan makrofajlar ağırlıklı olarak apolipoprotein A1 (ApoA1) üzerinden aktarılır. HDL kolesterol karaciğere atılımı ve yeniden kullanımı7,8,9sonra taşıma.
Geleneksel olarak, trityum (3H) radyo etiketli kolesterol kolesterol sızma10dakika sonra kullanılmıştır. Radioisotopes emisyon sinyalinin son derece hassas10' dur; Ancak, radyo etiketli kolesterol uzun iletişim kuralları, iyonizan radyasyona maruz kalma riski ve özel radyoaktivite tesisler ve ekipman radyoaktif emisyon güvenli kullanımı sağlamak için ihtiyaç gibi bariz handikapları sunar. Aksine, floresans başarıyla sadeliği floresan sinyal algılama, fluorophores mevcut çok çeşitli ve emanet11nedeniyle tanı teknikleri dahil edilmiştir. Çeşitli floresan etiketli steroller kolesterol metabolizması (BODIPY) dehydroergosterol (ile içsel floresan), dansyl kolesterol, 4,4 üzerinden-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene de dahil olmak üzere eğitim için kullanılan - kolesterol ve 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Özellikle, NBD-kolesterol verimli bir alımı insan hücreleri12' sunar. İki farklı NBD etiketli-kolesterol Şu anda kullanılabilir: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) ve 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Şekil 1). 25-NBD-kolesterol hücresel zar dinamiği araştırma13,14' te ağırlıklı olarak kullanıldığı gibi kolesterol ile 22-NBD yan etiketli en iyi kolesterol sızma çalışmalar, uygun olmayabilir.
Hücre hatları genellikle tüp bebek kolesterol sızma deneyleri içinde kullanılan insan lösemi kaynaklı THP-1 hücreleri, fare ham 264.7 hücreleri15veya J774.1 gibi monosit benzeri hücrelerdir. Bu hücrelerin tümünü phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) kullanılarak in vitro makrofajlar içine farklılaşmış, ama makrofajlar (dmTHP-1) en iyi THP 1 türetilmiş yansıtmak ve insan makrofajlar16taklit.
Mevcut çalışmada, en iyi duruma getirme ve 22-NBD-kolesterol [3H] Alternatif olarak kullanarak serum numuneleri dmTHP-1, kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için bir floresan yüksek üretilen iş yöntemi standartlaştırmak-kolesterol. Buna ek olarak, biz en iyi duruma getirilmiş floresan tekniği ile standart radyoaktif analog karşılaştırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada, etik kurul onayı (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, hastane Kliniği, Barcelona; onay numarası HCB/2014/0756) ve yazılı tüm konulardan haberdar izni elde edilmiştir.
1. NBD-kolesterol hazırlık
- NBD-stok (2 mM) elde etmek için kolesterol (MW 494.63; bkz: Malzemeler tablo) saf etanol geçiyoruz. 10 mg flakon için tüm şişe içeriği 2 mM hisse senedi almak için etanol 10,1 mL hacminde geçiyoruz.
- RPMI % 10 fetal Sığır serum ve %5 penisilin/streptomisin ile (R10 orta) takıma 5 mikron son bir konsantrasyon ulaşmak için 1640 stokta NBD kolesterolden oranında seyreltin (örneğin, NBD-kolesterol 10 mL, 5 mikron son konsantrasyonu elde etmek) tarafından NBD-kolesterol R10 Orta (2 mM) stokta 25 μL sulandrarak. Bu birim bir 96-şey plaka için yeterlidir.
2. hücre kültür ve tohum (2 gün)
- Kültür THP-1 hücreleri R10 orta 37 ° c, % 5 CO2. 106 hücre/mL x 0,3 için 3 günde ayarlayın.
- Düz, açık alt kısmında 0.2 x 106 hücreler/iyi R10 Orta (iyi başına 100 μL) ile beyaz bir 96-şey plaka hücrelerde tohum.
- 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat hücrelerle tedavi (PMA; 10 mikron stoktan) 48-72 h, 37 ° C'de kuluçka için % 5 CO2 THP-1 ayırt etmek için hücreleri dmTHP-1'e.
Not: R10 orta 500 μL içinde 5 μL PMA stok (10 mikron) kullanmak için önerilir. Bundan önce dimetil sülfoksit (DMSO), aliquot ve hisse senedi-20 ° C'de 10 mL 1 g liyofilize şişede çözülerek PMA hisse senedi 10 mikron hazırlamak - Alternatif olarak (öneri) birleştirmek adım 2.2 ve 2.3 daha iyi homojenizasyon için. THP-1 hücre 15 mL tüp 10 mL hazırlamak, PMA stok (10 mikron) 200 μL eklemek, karışımı yavaşça ve hemen iyi plaka üzerine başına 100 μL tohum. 2.3. adımda açıklandığı gibi hücreleri kuluçkaya.
3. Apolipoprotein B Serum (ABDS) hazırlık (günde 2 ya da 3) tükenmiş
- Polietilen glikol (PEG) çözüm hazırlamak için glisin (steril H2O ile) % 10 PBS'ye pH 7.4 200 mM bir konsantrasyon içinde oranında seyreltin. PEG PEG elde etmek için 8000 10 g için 200 mM glisin 40 mL ekleyin (w/v). Şiddetle homojenize çözüm mix.
- 4 uygulamak parçalar % 20 serum/plazma her serum/plazma örneği 1,5 mL tüp içinde 10 parça başına PEG ve karışımı buz 25 dk17 bırakmaktır (plazma veya serum, 100 μL eklemek için 40 μL Örneğin, çözüm PEG).
- PEG-apolipoprotein B çökelti, 13.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
- Çökelti atmak. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın.
Not: Biz ABDS gün 3 (taze) hazırlama öneririz. Bu mümkün değilse, ABDS 2 gün hazırlamak ve gecede 4 ° C'de saklayın.
4. NBD-kolesterol hücre yükleme (2 gün)
- DmTHP-1'in kültür orta atın ve hücreleri iki kez 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile yıkayın.
- 5 mikron hücrelerle yük NBD-kolesterol (iyi başına 100 μL) R10 orta ve gecede kuluçkaya 37 ° C, % 5 CO2.
5. kuluçka kolesterol alıcısı (3 gün) ile
- Orta atın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
- 2-%5 ABDS veya renksiz RPMI 1640 Orta (iyi başına 100 μL) için 4-6 h 37 ° C'de seyreltilmiş saf lipid alıcısı (HDL, ApoA, apolipoprotein, vb) istenen konsantrasyonu hücrelerle kuluçkaya
Not: renksiz RPMI 1640 orta alıcısı ve olumlu bir denetimi (C +) (örneğin, sağlıklı bağış bir havuzdan ABDS) veya saf HDL olmadan oluşan bir negatif kontrol (C-) içerir. Not (ek Şekil 1) analiz olumlu denetim özellikle hasta numuneleri (hastalık koşullar) olduğunda geçerlidir. - Hücre lizis çözümü 1 (50 mM Tris arabellek, 150 mM NaCl, H2O) bir 200 mL hazır hazırlamak. Hücre lizis çözüm 1:1 (v: v) 1 oranı lizis çözüm 2 elde etmek için saf etanol ile karıştırın.
6. floresan sinyal yakalama (3. gün)
-
Medya NBD-kolesterol algılama
- Hücre orta plakalar kaldırmak ve yeni bir beyaz 96-şey plaka opak bir düz dipli ile toplamak.
- Medya örneklerinde bir en uygun floresan sinyal algılama için 1:1 oran 96-şey beyaz tabak içinde elde etmek için her Orta örneğinin 100 μL saf etanol 100 μL ekleyin.
- Plaka tedavi medya ile daha fazla ölçmek için luminometer içinde bir 463⁄536 nm (uyarma/emisyon) dalga boyu floresan yoğunluğu (FI) tutun.
-
Hücre içi NBD-kolesterol algılama
- Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
- Hücre içi kolesterol elde etmek için onları 100 μL lizis çözüm iyi 2 ile kuluçka hücreleri parçalayıcı ve oda sıcaklığında (RT) 25 min için plaka sallamak.
- Bir en uygun floresan sinyal algılama hücre lysate örneklerinde yakalamak için hücre lysates aynı beyaz floresan yoğunluğu 96-şey plaka ile açık düz alt (aynı plaka içinde adım 2.2 hücreleri seribaşı).
- 6.3 floresan yoğunluğu (FI) içinde luminometer duyarlılığı parametresi 50 yazılım ayarlarken ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek).
7. sonuçları analiz
- Bir örnek kolesterol sızma oranı formülüne göre hesaplanan yüzde olarak ifade:
- Kolesterol sızma (CE) son ölçü negatif kontrol (NBD-kolesterol ile yüklü ama kolesterol alıcısı olmadan renksiz RPMI 1640 orta ile inkübe örnek) CE çıkararak CE elde bir tane verdim:
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kolesterol sızma tahlil vitro bir verilen serum, plazma veya HDL parçacıkları içeren süpernatant kolesterol sızma kapasitesini belirlemek için amaçtır. Etiketli-kolesterol bir standart makrofaj hücre kültürünü bir kültürün içine yükleme ve FBS ücretsiz medya ile hücre içine seyreltilmiş test örnek ile iletişim inducing yöntemi oluşur. Son olarak, NBD floresan düzeylerinden medya ve hücre lysate olarak ölçülür. Ölçümler en iyi duruma getirmek için hücreleri effluxed kolesterolden medya için etanol içeren bir çözücü bir ha...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Floresan etiketli kolesterol çözümlemek ve özellikleri ve metabolizma doğal kolesterol tüp bebek araştırmak için umut verici bir stratejidir. Başlıca avantajları vardır bu hücreleri tarafından alınabilir, hücre içi sağlar ve membran dağıtım çalışmaları ve kolesterol sızma deneyleri bu Protokolü (Şekil 7) olduğu gibi bu tür uygulanabilir. Bazı floresan etiketli steroller kolesterol izleme BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol ve 22 - ve 25-NBD-kolesterol12<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar mucitler başlıklı patent başvuru (EPO; 18382337.6-1118; 17 Mayıs 2018) olduğunu bildirmek istiyorum "kolesterol sızma belirlemek için yöntem" dayalı bu yöntemi.
Teşekkürler
Bu eser kısmen tarafından desteklenen araştırma FIS (PS12/00866) Instituto de Salud Carlos III, Madrid, İspanya üzerinden; verir. Fondo Europeo para el Desarrollo bölgesel (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-sayımlı (RD16/0025/0002) ve eğer programı / Generalitat de Catalunya. Yazarlar Retrovirology ve Viral Immunopathology laboratuvar Institut d'Investigacions Biomèdiques Ağustos Pi I Sunyer (IDIBAPS) teşekkür ederiz. Biz T. Escribà, C. Rovira ve C. Hurtado onların yardım ve bilgi ve Teknoloji Transfer Ofisi S. Cufí korumak icat onun rehberlik için teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 oyuklu toplama plakası | Corning Inc | Costar 3912 | opak şeffaf tabanlı beyaz 96 oyuklu plaka |
| 96 oyuklu kültür plakası | Corning Inc | Costar 3610 | beyaz 96 oyuklu plaka düz şeffaf |
| dipliKolesterol Akış Test Kiti (Hücre bazlı) | Abcam | ab196985 | ticari yüksek verimli hücre bazlı tahlil kiti, kolesterol akışı |
| renksiz RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640, pehnol-kırmızı |
| Gen5 Veri Analiz Yazılımı | olmadan BioTek | Sürüm 2.0 | |
| Glisin | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glisin, hayvansal olmayan kullanım |
| Luminometre | Biotek | SYNERGY HT | Çoklu Algılama Mikroplaka |
| Okuyucu Lizis Çözeltisi 1 | kurum | 50 mM Tris Tamponu, 150 mM NaCl ve H2O | |
| Lizis Çözeltisi 2 | kurum | Saf etanol ve Hücre Lizis Çözeltisi 1:1 (v:v) | |
| NBD-kolesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oksa-1,3-Diazol-4-il)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Fosfat tamponlu tuzlu |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polietilen glikol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-asetat. |
| %10 | fetal sığır serumu ve %5 Penisilin/Streptomisin ile desteklenmiş R10 | kurum | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640, 1.5 g/L sodyum bikarbonat ve 4.5 g/L glikoz içeren 2 mM L-glutamin |
| ile THP-1 hücreleri | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | bir yaşındaki bir bebekten lösemiden türetilen monosit benzeri çizgi |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Kaynaklar
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
