Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi
Bu makalede
Özet
Özet
Bağışıklık hücre karakterizasyonu ağır çok renkli Akış Sitometresi yüzey işaretlerinin fark ifadeye dayalı altgrupları tanımlamak için kullanır. Klasik bir çok renkli panel kurulumu high-end aletleri, özel etiketli antikorlar ve spektral örtüşme en aza indirmek için dikkatli bir çalışma tasarım gerektirir. Büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için multiparametric bir analiz geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) sadece iki fluorochromes kullanarak yedi sülale işaretleri birleştirerek periferik kan içinde. Bizim strateji lineage işaretleri sürekli her hücre nüfus tarafından benzersiz bir bileşimini ifade edilir gözlem temel alır. Bu antikorlar dikkatli bir titrasyon ile birleştirme müfettişler çoğu akışı cytometers optik sınırını genişletme beş ek işaretleri kaydetmek izin verir. Hala ikinci olmasına rağmen kafa kafaya karşılaştırma bağışıklık hücre popülasyonlarının periferik kan içinde büyük çoğunluğu bizim yöntem ve klasik "bir fluorochrome bir işareti yaklaşım", arasında karşılaştırılabilir doğruluk ile karakterize edilebilir gösterdi nüfus NKT hücreleri ve γδ T hücreleri gibi tanımlamak için daha kesin. Karmaşık bağışıklık hücre popülasyonlarının ve klinik örnekler uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers ve hatta 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynakları ile çözümlenmesi için yedi işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme sağlar. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi birkaç hücre popülasyonlarının hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler durumunda eleme için uygundur.
Giriş
Akış Sitometresi birden çok parametre birkaç bin olaylar başına ikinci1oranında tek parçacıklar analiz etmek için geliştirilmiş bir tekniktir. Akış Sitometresi tarafından analiz örnekleri örnekleri içerir, ancak hücreleri, boncuk, bakteri, veziküller ve kromozomlar için sınırlı değildir. Sıvı sistemi sorgulama nerede her parçacık yolunda bir veya daha fazla lazerler ile kesişiyor ve birden çok parametre daha fazla çözümleme için kaydedilir noktada parçacıklar yönlendirir. Ön ve yan scatter, saf lazer ışık saçılma tarafından oluşturulan hedef popülasyon tanımlamak ve sırasıyla göreli boyutu ve iç karmaşıklık/parçalı yapı parçacıkları, hakkında b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan malzemelerin tüm çalışmaları Johns Hopkins kurumsal inceleme kurulu sağlık, sigorta taşınabilirlik ve Accountability Act altında tarafından kabul edildi. Hasta ve kontrol de-tespit edildi. PBMCs ve sağlıklı kontrol kan Onam tarafından elde edilmiştir.
Not: Bu protokol üzerinde taze test veya izole dondurulmuş periferik kan hücreleri ve tam kan.
1. hücre hazırlık
-
Yalıtım tam kan periferik kan hücre (PBMC)
- Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
Not:<....
- Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kurulum ve bir Akış Sitometresi deney insan periferik kan hücrelerinin analizini lekeli yedi sülale işaretleri ile (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorları) sadece iki fluorochromes sunulmaktadır.
Anti-CD8 ve CD56 antikor titrasyonu için - temsilcisi sonuçları açıklanmıştır. Her antikor için (Bu örnekte, anti-CD8), on ardışık logosuna 2 kat dilutions verilerden bir leke dizin eğrisi (Şekil 1A-C
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan Protokolü oldukça esnek ve duyarsız arabellek, sıcaklık ve periferik kan hücresi hazırlık lineage işaretleri hücre yüzeyindeki yüksek ifadesi nedeniyle boyama değişiklikler göstermiştir. Yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik antikor titrasyonu adımdır. Antikor titrasyonu her zaman bir akış sitometrik panel kurulumu sırasında gerçekleştirilmesi gereken bu yana belirtmek gerekirse bizim iki fluorochrome yaklaşım için ekstra tezgah-zaman bu adımı eklemez. Anti-CD3, titrasyon-CD8,-CD1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu çalışmada artrit Ulusal Enstitüsü ve Musculoskeletal ve deri hastalıkları, tarafından desteklenmiştir < https://www.niams.nih.gov/>, Ödülü numarası P30-AR053503; Stabler Vakfı, www.stablerfoundation.org; Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina İrlanda Program için akciğer Sağlığı (NIPLH) https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Boyama için Antikor RRID< / strong>: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Boyama için Antikor RRID< / strong>: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Boyama için Antikor RRID< / strong>: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Boyama için Antikor < güçlü >RRID< / güçlü >: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Boyama için Antikor RRID< / güçlü >: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Boyama için antikor RRID< / strong>: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Boyama için antikor RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Boyama için Antikor RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Boyama için antikor RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Boyama için antikor RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Boyama için antikor RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Boyama için antikor RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Boyama için antikor RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Boyama için antikor RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Boyama için antikor RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Boyama için antikor RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Boyama için antikor RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Boyama için antikor RRID: AB_2744293 |
| Ölü hücreler | Yaşam teknolojileri | L-23105 | Canlı/ölü ayrımcılık |
| Falcon 5 mL hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü | BD Bioscience | , | akış sitometresinden geçmeden önce hücre süspansiyonunu filtrelemek için |
| Falcon 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü | BD Bioscience | tam | kanı lekelemek için |
| Geri Kazanım Hücre Kültürü Donma Ortamı | Termo fisher | 12648010 | Dondurucu hücreler |
| 96 oyuklu V-alt plaka | Thermo fisher | 249570 | boyama plakası |
| FACSAria IIu Hücre Sıralayıcısı | BD Biosciences | Akış sitometresi | |
| FCS Express 6 | De Novo Yazılım | FACS analizi | |
| Graphpad Prism | GraphPad yazılımı | Veri analizi |
Kaynaklar
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
