Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

Özet

Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Özet

Lösin zengini tekrarlayan kiziaz 2 (LRRK2) kalıtsal Parkinson hastalığında (PH) en sık mutasyona uğrayan gendir ve tüm patojenik LRRK2 mutasyonları kizaz fonksiyonunun hiperaktivasyonuile sonuçlanır. Burada, fizyolojik substratlarından biri olan Rab10'un threonine 73'teki LRRK2 kontrollü fosforilasyonunu ölçerek insan periferik kan nötrofillerindeki LRRK2 kiyazı yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir tahkikat tanımlıyoruz. Açıklanan immünolot analizi, MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor gibi LRRK2 tarafından fosforile rab10 Thr73 epitopunu tanıyan tam seçici ve fosfospesifik antikor gerektirir. Periferik kan kolayca erişilebilir ve nötrofiller bol ve homojen bir bileşen dir, çünkü insan periferik kan nötrofilkullanır. Daha da önemlisi, nötrofiller hem LRRK2 hem de Rab10'un nispeten yüksek düzeylerini ifade eder. Nötrofillerin potansiyel bir dezavantajı yüksek içsel serin proteaz aktivitesidir, bu da lisis tamponunun bir parçası olarak organofosfor nörotoksin diisopropilorofosfat (DIFP) gibi çok güçlü proteaz inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo LRRK2 kiyazı yolu aktivitesi araştırma için değerli bir kaynak ve PD biyorepozitory koleksiyonlarına dahil edilmesi için düşünülmelidir.

Giriş

Parkinson hastalığını (PH) yavaşlatmaya veya durdurma girişimleri şimdiye kadar başarısız oldu. Lösin zengin tekrar kilaz 2 hiperaktivasyon mutasyonlarının keşfi (LRRK2) neden ve / veya PH riskini artırmak LRRK2 kiyaz inhibitörleri^gelişimineyol açmıştır^{1 ,2,3}. Bunlar artık klinik^{çalışmalara}girdik 4 . LRRK2 tam işlevi belirsizdir, ama büyük bir ilerleme Rab GTPase proteinlerin bir alt kümesinin belirlenmesi olmuştur, Rab10 dahil, LRRK2 kisenin ilk iyi niyetli fizyolojik substratları olarak^5,6,7. Hastalık değiştirici terapötikler çağında kisa ların temel zorlukları LRRK2 kizaz aktivasyon durumunun biyokimyasal belirteçleri ve LRRK2 kiyaz inhibitörlerinin hedef katılımıdır.

Şimdiye kadar, vivo LRRK2 inhibitörleri için temel farmakokinetik belirteç lrrk2 kurucu fosforile serin kalıntıları bir küme olmuştur, özellikle serine 935, çeşitli LRRK2 inhibitörleri yanıt olarak fosforilted hale^8,9. Ancak, serine 935 fosforilasyon doğrudan LRRK2 tarafından fosforile değildir ve hala kilaz-inaktif LRRK2¹⁰fosforile çünkü içsel hücresel LRRK2 kiziz aktivitesi ile ilişkili değildir. LRRK2 kinasaktivitesi serin1292 otofosforilasyon ile iyi ilişkilidir, ama pratik açısından bu site için güvenilir ve fosfospesifik antikorların mevcut eksikliği nedeniyle tüm hücre özleri immünoblot analizi ile endojen LRRK2 kinaz aktivitesi için uygun bir okuma değil^10,11.

Biz threonine 73¹¹de fizyolojik hedef protein Rab10 LRRK2 kontrollü fosforilasyon ölçer insan periferik kan hücrelerinde LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için sağlam ve kolay bir taht geliştirdik. Periferik kana, düşük riskli ve en az rahatsızlığa neden olan hızlı bir işlem olan venekesit ile kolayca ulaşılabilir. Onlar bol (tüm beyaz kan hücrelerinin% 37-80) ve hem LRRK2 ve Rab10¹¹nispeten yüksek düzeyde ifade homojen hücre popülasyonu oluşturmak çünkü biz insan periferik kan nötrofiller odaklanmak. Ayrıca, periferik kan nötrofilleri immünomanyetik negatif yaklaşım la hızlı ve verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonraki gözlenen Rab10 fosforilasyon LRRK2 aracılık olduğundan emin olmak için, nötrofil her toplu veya güçlü ve seçici LRRK2 kiyaz inhibitörü olmadan kuluçka (biz kullanmak ve MLi-2 tavsiye)^2,12. Bu daha sonra proteaz inhibitörü diisopropil florofosfat içeren bir tampon hücre lisis i takip (DIFP), nötrofiller yüksek olduğu bilinen içsel serin prote proteaz aktivitesini bastırmak için gerekli olan¹³. Kantitatif immünoblotting tarafından son analiz için, özellikle Rab10 Thr73-fosfoepitop algılar ve diğer fosforile Rab proteinleri ile çapraz tepki vermez MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor kullanmanızı öneririz¹⁴. Bu antikor seçiciliği ve özgüllüğü farklı Rab proteinleri ve A549 Rab10 knock-out hücre hattı¹⁴aşırı ekspresyon modellerinde doğrulanmıştır. Böylece, güçlü ve seçici LRRK2 kinaz inhibitörü²ile tedavi edilmiş nötrofil lysates Rab10 fosforilasyon farkı ölçmek . Alternatif olarak, örnekler nicel kütle spektrometresi gibi diğer yöntemlerle de analiz edilebilir.

Sonuç olarak, LRRK2 kontrollü Rab10 fosforilasyon serin 935 de LRRK2 fosforilasyon LRRK2 kiziaz aktivitesinin üstün bir belirteç ve insan periferik kan nötrofiller LRRK2 içine PD araştırma için değerli bir kaynaktır. Protokolümüz periferik kan nötrofillerinde LRRK2 yol aktivitesini sorgulamak için sağlam ve kolay bir tahkikat sağlar ve artmış LRRK2 kinaz aktivitesi¹⁵olan bireylerin biyokimyasal tabakalaşmasını sağlar. Daha da önemlisi, bu tür bireyler gelecekteki LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilirler.

Protokol

Yerel İngiltere mevzuatına göre insan kanının tüm manipülasyonları ve borulama bir kategori 2 biyolojik güvenlik kabinesinde üstlenilir. Tüm prosedürler yerel etik inceleme kuruluna uygun olarak gerçekleştirildi ve tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay verdi.

1. Hazırlık

1. Fosfat tamponlu salinde (PBS) 100 mM EDTA içeren 0,1 mL EDTA Stok Çözeltisi 1 hazırlayın.
2. PBS'de 1 mM EDTA içeren 60 mL EDTA Stok Çözeltisi 2 hazırlayın.
3. 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), %1 (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF içeren lysis tamponunu hazırlayın, 10 mM β-gliserinosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.27 M sakaroz, %0.1 (v/v) β-mercaptoetanol, 1x proteaz inhibitör kokteyli, 1 μg/mL microcystin-LR ve 0.5 mM diisoylprop florosfat (DIFP).
   NOT: Yazarlar rutin bir EDTA içermeyen ürün kullanmak, ancak edta içeren proteaz inhibitörü kokteyl de çalışması gerekir. Lysis tamponu β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP olmadan önceden yapılabilir ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir. Β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP'nin kullanımdan hemen önce eklenmediğinden emin olun.
   DİkKAT: DIFP toksiktir ve yerel sağlık ve güvenlik risk değerlendirmesi sonrasında bir duman başlık içinde özenle ele alınmalıdır. DIFP lysis tamponekleyebilir ve hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, DIFP dahil diğer tüm bileşenleri içeren tam lisis tampon, aliquoted ve en az 4 hafta boyunca sonraki kullanım için -80 °C'de saklanabilir.

2. Tam kandan nötrofil izolasyonu

1. Bir kan toplama tüpü içine 10 mL kan toplayın. Tüpleri 7−8x ters çevirerek hafifçe karıştırın.
2. 10 mL'lik kanın 50 mL konik tüpe aktarılması.
3. Kana 100 μL EDTA Stok Çözeltisi 1 ekleyin. Yavaşça karıştırın.
4. Nötrofil izolasyon kitinden(Malzeme Tablosu)tüm kan örneğine 500 μL izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin.
5. Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanılmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 s'lik bir giriş için girdap.
6. Kan örneğine manyetik boncukların 500 μL'sini ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
7. 5 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübat.
8. TÜPÜ EDTA Stok Çözümü 2 ile 50 mL'ye doldurun. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3x pipetting tarafından karıştırın.
9. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
10. RT'de 10 dakika kuluçka.
11. Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet.
    NOT: Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyonyaklaşık 10 mL bırakın.
12. Kullanmadan önce 30 s için manyetik boncukvor ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp için manyetik boncuk0.5 mL ekleyin. Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın.
13. 5 dakika RT'de kuluçka.
14. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
15. 5 dakika RT'de kuluçka.
16. Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet.
    NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın.
17. Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin.
18. RT'de 10 dakika kuluçka.
19. Şimdi yeni bir 50 mL konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon dikkatle pipet.
    NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın.
20. İzole hücreleri 1 mM EDTA Stok Çözeltisi 2 ile yaklaşık 41 mL'lik son hacmi karıştırın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.
21. Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mL olan iki tüpe eşit olarak bölün.
22. Santrifüj her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk.
23. Bu santrifüj sırasında MLi-2 inhibitör stokunu (200 μM/1000x konsantrasyon) -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve daha sonra kullanılmak üzere RT'de bırakın.
24. Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün. Rt'de hücre kültürü ortamının 10 mL'lik(Malzeme Tablosu)her hücre peletini, hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı 4 kat borulayarak yeniden askıya alın.

3. Saf nötrofillerin LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisi

1. Etiket bir tüp "DMSO" ve diğer tüp "MLi-2".
2. "DMSO" etiketli tüpe 10 μL DMSO ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın. "MLi-2" etiketli boruya 10 μL 200 μM MLi-2 stok çözeltisi (son konsantrasyon 200 nM) ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın.
3. Rt. Kuluçka sırasında her 10 dakikada bir inversiyon ile hafifçe karıştırın.
4. Kuluçka döneminde 0,5 M DIFP stoğunu -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde bir duman kaputuna yerleştirin. -80 °C'lik dondurucudan 1 mg/mL mikrosistin-LR stok çözeltisini çıkarın ve erimeye RT'de bırakın. Dondurucudan bir aliquot (0.25 mL) alın, RT'de çözülmesine izin verin ve daha sonra kullanmak üzere buzüzerine yerleştirin.
5. 1 μL DMSO içeren hücre kültürü ortamının 1 mL'sini hazırlayın ve bu DMSO resuspension arabelleği çağırın. 1 μL 200 m MM MLi-2 içeren 1 mL RPMI ortam hazırlayın ve bu MLi-2 resuspension tamponu deyin.
6. 30 dk kuluçka süresinden sonra her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk santrifüj edin.
7. Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.
8. DMSO etiketli numune için pelet, DMSO resuspension tamponunun 1 mL'inde ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 resuspension tamponunun 1 mL'inde peleti hafifçe askıya alın.
9. Resuspended hücre peletlerini "DMSO" ve "MLi-2" etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 3 3 dk boyunca 335 x g'da santrifüj edin.
10. Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputuna 0,25 μL 0,5 M DIFP çözeltisi ve 0,25 μL 1 mg/mL mikrosisin-LR 0,25 mL likörü tamponuna dikkatlice ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.
    NOT: DIFP sulu bir çözeltide nispeten kararsız olduğundan, hücre lisisinin 15 dakika içindeki lysis arabelleğine DIFP ekleyin.
11. Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin.
12. Her tüpe hemen DIFP ve mikrosistin-LR içeren 100 μL likis tamponekleyin. 100-200 μL pipet kullanarak hücre peletlerini yaklaşık 5-10 x yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.
13. Hücreleri 10 dakika boyunca buzüzerinde lyse.
14. Hücre enkazLarını temizlemek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g'lık santrifüj tüpleri.
15. Nötrofil lisatlarını içeren "DMSO" ve "MLi-2" süpernatantlarını yeni santrifüj tüplerine aktarın. Enkaz peletini atın.
    NOT: Nötrofil lysates kullanıma hazır dır veya sıvı nitrojende dondurulmuş ve ileride analiz için -80 °C'de saklanabilir.

Sonuçlar

Bizim taht bir okuma olarak LRRK2 bağımlı Rab10 fosforilasyon ile insan periferik kan nötrofillerinde PD ilişkili LRRK2 kizaz aktivasyonu sorgulama sağlar. Nötrofiller, hem LRRK2 hem de Rab10 proteinlerinin yüksek düzeylerini ifade eden homojen ve bol periferik beyaz kan hücresi popülasyonudur(Şekil 1). Kalan periferik kan mononükleer hücreleri arasında kalan tek hücre popülasyonu (PBMCs) her iki proteinin yüksek kopya numaraları monositler, ancak bu beyaz kan hücrelerinin sadece% 2-12 makya...

Tartışma

Zorlayıcı klinik, genetik ve biyokimyasal kanıtlar LRRK2 için önemli bir rol doğru işaret ve özellikle Parkinson hastalığında kizaz fonksiyonu⁷. LRRK2 kiyaz inhibitörleri geliştirilmiştir ve klinik çalışmalara giriyorsunuz^2,4,12. Bu nedenle, lrrk2'nin hedef katılımı ve hasta tabakalaşması için bir biyomarker olarak sömürülmesine ihtiyaç vardır. Protokolümüz, insan periferik kan nötrofillerinin homojen hav...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL Pipet uçları	Sarstedt	70.762	veya eşdeğeri
1,5 mL Mikro tüpler	Sarstedt	72.690.001	veya eşdeğeri
10 mL Pipet uçları	Sarstedt	86.1254.025	veya eşdeğeri
10 & mu; L Pipet uçları	Sarstedt	70.113	veya eşdeğeri
15 mL falcon tüpü	Cellstar	188 271	veya eşdeğeri
200 μ L Pipet uçları	Sarstedt	70.760.002	veya eşdeğeri
25 mL Pipet uçları	Sarstedt	86.1685.001	veya eşdeğeri
50 mL şahin tüpü	Cellstar	227 261	veya eşdeğeri
BD Vacutainer Hemogard Kapatma Plastik K2-EDTA Tüpü	BD	BD 367525	veya eşdeğeri
Beckman Coulter Allegra X-15R santrifüj	Beckman		veya 1000-1200 x g hızında 50 mL şahin tüpleri için yüzme kovası döndürücülü eşdeğer santrifüj
Kategori 2 biyolojik güvenlik kabini.
cOmplete(EDTA içermeyen) proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836170001
DIFP (Diizopropilflorofosfat)	Sigma	D0879	Özel önlemler kullanarak izopropanol içinde 0.5M stok çözeltisi hazırlayın
Dimetil sülfoksit ve nbsp;	Sigma	6250
Kuru buz veya sıvı nitrojen
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu	ThermoFisher	14190094	veya eşdeğeri
Easy 50 EasySep Magnet	1 x 50ml konik tüp tutmak için	Kök Hücre	18002
EasySep Doğrudan İnsan Nötrofil İzolasyon Kiti	Kök Hücre	19666	Bu, " adı verilen Çözeltiler içerir. İzolasyon Kokteyli" ve " RapidSpheres manyetik boncuklar
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf santrifüj 5417R santrifüj	Eppendorf
Etanol, sprey şişesinde
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma	E6758
Buz
İzopropanol (susuz sınıf)	Sigma	278475
Lizis tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7.5, %1(h/h) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-gliserofosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.27 M sükroz, %0.1 (h/h) β-merkaptoetanol, 1x cOmplete(EDTA içermeyen) proteaz inhibitör kokteyli (Roche), 1 & mu; g/ml Mikrosistin-LR, 0.5 mM diizopropilflorofosfat (DIFP).			alternatif olarak Microcystin-LR, DIFP içermeyen alikotlarda donmuş lizis tamponu MRC-PPU Reaktifleri (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitörü II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	veya eşdeğeri (güçlü ve seçici LRRK2 inhibitörü)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	DMSO'da 1 mg / ml stok ve -80 oC'de saklayın.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx tarama Western Blot görüntüleme sistemi	Odyssey
Kalıcı işaretleyici kalem
Kişisel koruma ekipmanı
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	veya eşdeğeri
sodyum pirofosfat	Sigma	S22
sükroz	Sigma	S0389
ve beta; -gliserofosfat	Sigma	50020
ve beta; -merkaptoetanol	Sigma	M3148
< güçlü > Western blot için önerilen antikorlar< / güçlü>
Anti-RAB10 (fosfo T73) antikoru [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-&alfa;-tubulin	Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri	5174	1:2000 seyreltmede kullanılır
Keçi anti-fare IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	1:10.000 seyreltmede kullanılır
Keçi anti-fare IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	1:10.000 seyreltmede kullanılır
Keçi anti-tavşan IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	1: 10.000 seyreltme
MJFF-total Rab10 fare antikorunda		uygulanamaz *	2 & mu'da kullanılır; g/ml nihai konsantrasyon; * nanoTools (www.nanotools.de) [11] tarafından üretilen MJFF-total Rab10 antikoru, 2018'de Michael J Fox Vakfı tarafından ticarileştirilecektir
Fare anti-LRRK2 C-terminal antikoru	Antikorları Dahil...	75-253	1 & mu'da kullanılır; g/ml nihai konsantrasyon
pS935-LRRK2	MRC PPU Reaktifleri ve Hizmetleri	UDD2	1 & mu'da kullanılır; g/ml nihai konsantrasyon