Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.
Yöntem makalesi
Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Adeno ilişkili virüs (AAVs) dayalı gen teslim araçlardır gen terapisi uygulamaları da dahil olmak üzere transgenes teslim edilmek üzere merkezi sinir sistemi (MSS), popüler bir seçim. AAV vektörleridir olmayan çoğaltılıyor, güçlü-e doğru bölme ve bölme hücreleri enfekte ve uzun vadeli transgene ifade sağlar. Önemlisi, bazı serotipleri, yeni açıklanan PHP gibi. B, kan-beyin-bariyer (BBB) hayvan modellerinde çapraz olabilir sistemik teslim takip. AAV vektörel çizimler verimli laboratuvarda üretilebilir. Ancak, sağlam ve tekrarlanabilir AAV vektörleri ile yeterli saflık düzeyleri ve titresi değerleri vivo içinde uygulamaları için yüksek almak için gerekli iletişim kurallarıdır. Bu iletişim kuralı bir iodixanol degrade arıtma stratejisi dayalı AAV vektör üretim için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji açıklar. İodixanol arıtma yöntemi dizi-in yüksek-titresi AAV vektörel çizimler yüksek saflık, diğer arıtma yöntemleri karşılaştırıldığında elde etmek için uygundur. Ayrıca, şu anda açıklanan diğer yöntemlerden daha genellikle daha hızlı iletişim kuralıdır. Buna ek olarak, nicel bir polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)-tabanlı strateji vektör toplu saflığı belirlemek bir hızlı ve doğru belirlenmesi vektör titresi yanı sıra bir gümüş boyama yöntemi için açıklanmıştır. Son olarak, sistemik yönetim AAV-php takip MSS, gen teslimat temsilcisi sonuçları. B, sunulmaktadır. Bu sonuçlar bu makalede açıklanan protokolleri kullanarak tüm Labs'de mümkün olmalıdır.
Giriş
Son 30 yılda, vahşi tipli AAVs CNS1,2,3,4içine gen transferi için son derece yararlı araçlar olduğu kanıtlanmıştır rekombinant AAV vektörler oluşturmak için tasarlanmış, 5,6 ve gen terapisi (FDA ve EMA onaylanmış tedaviler de dahil olmak üzere) hastalığı4,7' ye yaklaşıyor. MSS kullanımda için Uygunluk Sigara bölen, sonrası Mitotik hücre bulaştırmak, genellikle CNS8' bulunan yeteneğini büyük ölçüde türetilmiştir. Ancak, AAV tabanlı vektörel çizimler de diğer viral vektörler7'göre daha hafif bir immün yanıt alabilme ise uzun vadeli bir ifade herhangi bir verilen terapötik transgene4,9 izin vermenin avantajına sahip, 8,10,11,12.
Herhangi bir AAV vektör ana unsurları genom ve kapsid vardır. Vahşi tipli AAVs tek iplikçikli (ss) DNA virüsleri ile genom yaklaşık 5 kilobases (kb)13. Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi için temsilcisi ile kap gen (genom çoğaltma ve viral kapsid montajı için gerekli) vahşi tipi AAV genom silinir ve içinde transiçin oda bırakarak, sağlanan bir transgene14,15içeren ifade kaset. Bu çoğaltma ve3,10,14paketleme için temel olarak ters terminal tekrar dizileri (ITRs) özgün viral genom kopyası yalnızca tutulan bir AAV vektör öğelerdir. AAV vektörel çizimler transgene ifade geliştirmek için tasarlanmış; ITRs biri bir mutasyon etkili tamamlayıcı DNA strand3,7,15nesil sağlayan bir saç tokası döngü oluşumuna yol açar. İkinci-strand sentez AAVs önemli ölçüde transgene ifadesi düzeyi ve hızını artırarak, geleneksel yaşam döngüsünde tipik gereksinimini atlar bir öz-tamamlayıcı (sc) genom olarak adlandırdığı bu yapılandırma büyük avantajı olduğunu 1. Bununla birlikte, bir scAAV genom kullanarak vektör kargo kapasitesi yaklaşık 2,4 KB azaltır. Bu transgene dizileri yanı sıra Rehberleri veya mikroRNA bağlayıcı siteleri, ifade belirli hücre türleri16sınırlamak için gibi herhangi bir düzenleme dizileri içerir.
AAV kapsid vektör-konak hücre etkileşim belirler ve bir ölçüde de transgene ifade belirli konumlara sınırlamak için yararlanılabilir AAV serotip için hücre türü veya doku tropism confers. Diğerleri rekombinant yaklaşımlar (yani, PHP. aracılığıyla laboratuarlarında üretildi, ancak birkaç AAV serotipleri doğada bulunur B). Buna ek olarak, bazı capsids bestow da sistemik yönetim sonra transgenes MSS boyunca teslimini sonuçlanan BBB, çapraz yeteneği gibi diğer yararlı özellikleri. Bu AAV9, yanı sıra son zamanlarda açıklanan PHP için gösterilmiştir. B kapsid17. Sonuç olarak, bu serotipleri nörodejeneratif hastalıkları1,17,18için yeni gen terapisi yaklaşımlar için özellikle alakalı olacak şekilde kanıtlamaktadır.
Bu iletişim kuralının amacı AAV vektörler yüksek titresi ve saflık ile küçük ölçekli üretim için uygun maliyetli bir yöntem tarif etmektir. Her ne kadar burada sunulan sonuçlar PHP kullanın. B kapsid ve scAAV ifade kaset, protokol birkaç AAV vektör serotipleri ve genom yapılandırmaları, en fazla deneysel esneklik sağlayan üretimi için uygundur. Ancak, vektör verim ve son saflık seçilen serotip bağlı olarak değişebilir.
Protokolün kendisi klasik tri-transfection yöntem viral vektör üretim için bir türevi ve bir iodixanol degrade kullanım için vektör hangi sezyum klorür (CsCl) degradeler, klasik kullanımı ile karşılaştırıldığında olmuştur temizlik, birleştirmek AAV vektörel çizimler daha zaman verimli bir şekilde19,20,21daha yüksek saflık üretmek için bildirilen.
Transfection, arıtma ve toplama adımları iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre yapılması için viral vektör çalışma için dekor doku kültürü Laboratuvarında yöneliktir. Her görev viral vektör üretim ile ilgili ilgili yerel ve ulusal mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmesi ve kullanmak gerekiyor. Laminar akış başlık altında ve steril koşullarda çalışma yapılmalıdır. Vektör tesis içinde ek olarak normal doku kültürü laboratuar önlüğünü bir laboratuar önlüğü giymek tavsiye edilir. Ayrıca, Çift kişilik bir çift eldiven yanı sıra plastik bütünleşik, her zaman giyilmelidir.
Önce vektör üretim başlangıç sağlamak tüm gerekli ekipman ve plazmid bulunmaktadır. 1) pCapsid plazmid çoğaltma için yani Rep78, Rep68, Rep52 ve Rep40, gerekli dört yapısal olmayan protein kodlayan temsilcisi gen ve üç yapısal kapsid protein, yani VP1, VP2 ve VP3 kodlayan kap gen içerir. 2) pHelper plazmid kolaylaştırmak AAV üretim HEK293T hücrelerdeki genler E4, E2Ave VA adenovirus, üzerinden içerir. 3) pTransgene plazmid tarafından iki ITRs çevrili transgene ifade kaset içerir. Bu Plasmid'ler sentezlenmiş de novo dizileri kullanılabilir çevrimiçi22kullanarak laboratuvar olabilir. De novoyapılan plazmid için özellikle roman transgenes, içeren sıralama, transgene ve ITRs doğru olduğundan emin olmak için gereklidir. Alternatif olarak, hazır plazmid doğrudan online plazmid depoları elde edilebilir. Gerektiğinde, plazmid çoğaltılabilir ve standart kitleri kullanarak üreticinin yönergeleri23göre saf.
Vektör titresi ve saflık vektör iletim yeteneği olumsuz yönde etkilenebilir. Ek protokolleri üretilen vektör niteliğini değerlendirmek için sağlanır. Son vektörel çizimler CNS hücre işlevi vitro ve in vivo uygulamalarında çalışmaları yararlı olacaktır.
Protokol
| Çözüm | Kompozisyon | |
| Hücre kültürü ve transfection | ||
| DMEM1 | DMEM 1 x | |
| % 1 FBS (v/v) | ||
| %1 GlutaMAX (v/v) | ||
| DMEM10 | DMEM 1 x | |
| % 10 FBS (v/v) | ||
| %1 GlutaMAX (v/v) | ||
| 150 mM NaCl | 4.380 g NaCl | |
| 500 mL Ultrasaf Su | ||
| AAV arıtma ve desalting | ||
| 5 M NaCl | 146.1 g NaCl | |
| 500 mL Ultrasaf Su | ||
| 1 M Tris HCl (pH 8,5) | 12.11 g Tris Bankası | DİKKAT |
| 100 mL Ultrasaf Su | ||
| 1 M HCl pH 8,5 için azaltmak için bir Pasteur pipet kullanarak ekleme | ||
| Lizis arabellek | 5 M NaCl 15 mL | |
| 25 mL 1 M Tris HCL (pH 8,5) | DİKKAT | |
| 500 mL Ultrasaf Su | ||
| Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 | 80 gr NaCl | |
| 2 g KCl | DİKKAT | |
| 14.4 g Na2HPO4 | ||
| 2.4 g KH2PO4 | ||
| En çok 1 lt ddsu | ||
| 1 M MgCl2 | 20.33 g MgCl2-6 H2O | |
| 100 mL Ultrasaf Su | ||
| 1 M KCl | 7,45 g KCl | DİKKAT |
| 100 mL Ultrasaf Su | ||
| PBS magnezyum-potasyum (PBS-MK) hisse senedi çözüm x 5 | 10 x PBS 250 mL | |
| 1 M MgCl2 2.5 mL | ||
| 6.25 mL 1 M KCl | DİKKAT | |
| Kadar su 500 mL Ultrapure H2O | ||
| % 15 Iodixanol | Optiprep yoğunluğu degrade orta 12,5 mL | DİKKAT |
| 5 M NaCl 10 mL | ||
| 5 10 mL PBS-MK x | ||
| Ultrasaf Su 17.5 mL | ||
| % 25 Iodixanol | Optiprep yoğunluğu degrade orta 20.8 mL | DİKKAT |
| 5 10 mL PBS-MK x | ||
| Ultrasaf Su 19.2 mL | ||
| Fenol kırmızı 100 µL | ||
| % 40 Iodixanol | Optiprep yoğunluğu degrade Orta 33,3 mL | DİKKAT |
| 5 10 mL PBS-MK x | ||
| Ultrasaf Su 6.7 mL | ||
| % 60 Iodixanol | Optiprep yoğunluğu degrade orta 50 mL | DİKKAT |
| Fenol kırmızı 100 µL | DİKKAT | |
| AAV saflık kontrolü | ||
| Tris asetat EDTA (çay) arabellek x 10 | 44,8 g Tris Bankası | DİKKAT |
| 11,4 mL buzul asetik asit (17.4M) | ||
| 3.7 g EDTA | ||
| En çok 1 L Ultrasaf Su | ||
| Özel jel | 0.8 g ultrasaf özel | |
| 100 mL 1 x çay arabellek | ||
| Jel arabellek | 181.7 g Tris Bankası | DİKKAT |
| 1.5 g SDS | DİKKAT | |
| 8.45 ile 1 M HCl pH ayarlama | DİKKAT | |
| 500 mL Ultrasaf Su | ||
| Katot arabellek 10 x | 121.14 g Tris Bankası | DİKKAT |
| 179.2 g Tricine | DİKKAT | |
| % 1 SDS (w/w) | DİKKAT | |
| En çok 1 L Ultrasaf Su | ||
| Anot arabellek 10 x | 242.3 g Tris Bankası | DİKKAT |
| En çok 1 L Ultrasaf Su | ||
| 8,9 ile 1 M HCl pH ayarlama | DİKKAT | |
| Örnek arabellek 5 x | 20 mL için: | |
| 605 mg Tris Bankası | DİKKAT | |
| 4 g SDS | DİKKAT | |
| 10 mg Serva mavi G | ||
| 12 g gliserol | ||
| -20 ° C'de depolayın ve pH 6.8 ile 1 M HCl, aliquot için ayarlamak | DİKKAT | |
| Yığın jel | 2 tırnaklar için jeller: | |
| 400 µL akrilamid | DİKKAT | |
| 750 µL jel arabellek | ||
| 1.85 mL Ultrasaf Su | ||
| 4 ΜL TEMED | DİKKAT | |
| 20 µL % 10 APS (v/v) | DİKKAT | |
| TEMED ve % 10 ekleyin hemen önce jel dökme APS. Her iki kimyasalları kimyasal bir başlık altında kullanın. | ||
| Jel çözme | 2 tırnaklar için jeller: | |
| 3.32 mL akrilamid | DİKKAT | |
| 3.35 mL jel arabellek | ||
| 1.14 mL Ultrasaf Su | ||
| 2.12 mL % 50 gliserol | ||
| 6 ΜL TEMED | DİKKAT | |
| 50 µL % 10 APS (w/v) | DİKKAT | |
| TEMED ve % 10 ekleyin hemen önce jel dökme APS. Her iki kimyasalları kimyasal bir başlık altında kullanın. | ||
| Su doymuş butanol | 10 mL n-butanol | DİKKAT |
| 1 mL Ultrasaf Su | ||
| Uyarı: Tehlikeli kimyasalların kullanımı hakkında yönergeler için malzemeler tabloya bakın. | ||
Tablo 1: Kompozisyon gerekli çözümleri.
1. HEK293T hücre Tri-transfection
Not: Edilmesi ile arabellekleri ve çözümleri iletişim kuralında kullanılan Tablo 1 ' e bakınız.
Not: Performans iletişim kuralının bu bölümün yaklaşık 4 gün sürer.
- İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri bir su banyosunda 37 ° C'de ayarla şişe tezcan
Not: Sadece pasajlı hücreleri daha az 20 x en iyi transfection verimliliği garanti altına almak için kullanın. - Tohum HEK293T hücreleri bir yoğunluk 2 x 103 6 x 103 hücreleri/cm2 ' e DMEM10 15 cm çapında, kültür yemekleri hücre.
Sonuçlar
AAV9 olarak kabul, yakın zamana kadar en etkili AAV vektör serotip BBB geçiş ve çevresel yönetim takip MSS, hücrelerin transducing olmak. Kapsid tasarımında önemli bir ilerleme elde edildi zaman Deverman ve ark. Cre AAV hedefli evrim (Oluştur) rekombinasyon tabanlı17adlı bir kapsid seçimi Yöntem kullanım rapor etmiştir. Bu yöntemi kullanarak, PHP adında yeni bir kapsid teşhis ettiler. B olarak astrocytes ve birden fazla CNS bölgesi, nöronlarda sistemik enjeksiyon17takip çoğu transduce güçlü-e doğru rapor ettiler. Bu noktada, olması gerektiği belirtti rağmen PHP. B (ki ilk yalıtım deneylerde kullanılan zorlanma) C57/Bl6 farelerde olumlu sonuçlar sağlar, verimlilik bir zorlanma bağlı şekilde değişebilir ön raporları öneririz. Hiç şüphesiz, daha fazla deneyler bu sorunu31daha fazla ışık tutacak.
Ancak, bu sorunları rağmen PHP. B kanıtı-of-concept gen terapisi deneyler hastalık modelleri dahil olmak üzere fare, MSS noninvaziv gen manipülasyon için heyecan verici olanaklar sunmaktadır. Bu nedenle, PHP kullanarak transgene ifade verimliliğini değerlendirmek seçtik. Periferik yönetiminden beri 20092takip CNS iletim için 'altın standart' vektör olmuştur B karşı AAV9. Transgene ifade için en uygun koşullarda her iki serotipleri doğrudan karşılaştırılması gerçekleştirmek için bir sc genom yapılandırma32kullanılır. Her iki vektörel çizimler transgene yeşil flüoresan protein (GFP) için her yerde tavuk β-aktin (CBA) düzenleyici denetimi altında yapılır. Kadın C57/Bl6 fareler postnatal gün 42 (yaklaşık 20 g ağırlık), 1 x 1012 vg fare ya da scAAV2/php başına bir doz aldı. B-CBA-GFP veya scAAV2/9-CBA-GFP. Vektör yönetim kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirilen üzerinden yapıldı. Deneyler KU Leuven Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
Üç hafta postinjection, fareler transcardial perfüzyon %4 (w/v) buz gibi paraformaldehyde (PFA) tarafından takip buz gibi PBS ile uygulandı. Beyinleri hasat edildi ve daha fazla % 0,01 (w/v) Na-azid/PBS için depolama için daha fazla çözümleme kadar aktarmadan önce gecede bir kuluçka aynı sabitleştirici olarak tarafından postfixation uygulandı. Daha sonra beyni bir titreşimli microtome kullanarak kesitli ve immünhistokimya 50 µm kalınlığında kesitler üzerinde gerçekleştirildi.
Transgene ifade düzeyini değerlendirmek için bölümler GFP (tavşan anti-GFP), karşı birincil antikorlar ile floresan bir boya (Anti-tavşan Alexa Fluor 488) Birleşik ikincil antikorları kullanarak algılama ile lekeli (Şekil 4A, B ). Floresan yoğunluğu ölçüm sonuçları (rasgele adet [au]) doğruladı GFP ifade bir sc ne zaman önemli bir artış genom ve PHP. B kapsid AAV9 göreli olarak kullanılmıştır. GFP artışlar cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; gözlendi p 0.0032 =), beyincik (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p 0.0032 =) ve beyin sapı (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p 0.0038 =) (Şekil 4 c).
Şekil 4: scAAV2/PHP sistemik teslim. B-CBA-GFP MSS yüksek GFP ifadesinde yol açar. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP veya scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/fare) 6-hafta-yaşlı C57/Bl6 farelere kuyruk ven enjeksiyon yolu ile yönetiliyordu. GFP immünhistokimya koronal beyin bölümleri 3 hafta postinjection üzerinde kullanarak tespit edildi. (A)cerebrum ve (B) serebellum ve beyin sapı gösterilir. Ölçek çubukları 1 mm göreli floresans yoğunluklarını miktar her vektör (fare başına 10 bölümler; vektör grubu başına üç fare) ile elde GFP sinyal düzeylerini belirlemek için gerçekleştirilen. (C) =. Bir tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilen, iki kuyruklu öğrenci ttarafından takip-test; verileri ortalama ± standart sapma ifade edilir; p < 0,01; au. rasgele birimleri. AAV vektör üretim için kullanılan pCapsid, serotip 2 üzerinden gen temsilcisi ve serotip PHP gen kap içerir. B ya da AAV9, ona göre. Bu rakam Rincon değiştirildi vd.32. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tartışma
Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi burada kullandığı malzeme ve ekipman çoğu Moleküler Biyoloji Laboratuvarları ve hücre kültür imkanları için ortak nitelendirdi. Vitro ve in vivo uygulamaları bir dizi birden çok hücre ve doku türü hedeflenecek kullanılan saf, preklinik sınıf AAV vektörel çizimler elde etmek kullanıcı sağlar. Bu iletişim kuralı, (yani, CsCl tabanlı arıtma), diğerlerine göre en büyük avantajlarından biri gerekli kısa çalışma zamanı. Kullanıma hazır AAV elde edilebilecek en fazla HEK293T hücrelerinin ilk transfection 6 işgünü içinde vektörleridir.
Çeşitli faktörler son verim veya AAV vektör kalitesini olumsuz etkileyebilir. Zavallı transfection verimliliği düşük viral verim33için ana nedenlerinden biri. Önemli bir tavsiye daha--dan 20 kere pasajlı değil ve bir hücre izdiham 90 %'den büyük transfection21anda var mı HEK293T hücreleri kullanılır. Ayrıca, seçilen transfection yöntemi sonuçları üzerinde büyük bir etkisi vardır. Bu iletişim kuralı PEI kullanımına dayanır. PEI eksojen DNA hücre çekirdeği kompleksleri polimer ve nükleik asit, hücre ve ticareti yoluyla endosomes34tarafından alınır polyplexes olarak bilinen nesil aracılığıyla teslim alma olanağı katyonik bir polimerdir. PEI tabanlı transfection, kalsiyum fosfat35ile DNA'ın yağış Co gibi diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerin aksine gerçekleştirmek için hızlı ve kolay. Ayrıca, PEI tabanlı transfection katyonik lipidler ve mıknatıs-aracılı transfection36kullanımı gibi yeni tanıtılan diğer yöntemlere göre çok daha ucuz.
Arıtma strateji protokolünde önemli bir rol oynar. Diğer yöntemlerine göre iodixanol tabanlı purifications boş viral parçacıkların (% 20)20daha yüksek bir yüzdesi içeren eğilimindedir. Bu, bir dereceye kadar gerçeği iodixanol tabanlı arıtma rutin AAV vektör hazırlıkları az 100 bir parçacık infektivite oranı ile sonuçları ile dengeleniyor. Bu parçacık infektivite önemli kaybı bildirilen37olduğu geleneksel CsCl tabanlı yordamlara ile karşılaştırıldığında önemli bir gelişme gösterir. AAV vektörel çizimler arındırmak için başka bir ortak alternatif Kromatografi dayalı saflaştırma yöntemidir. Ancak, bu yöntem özel bir sütunda kullanılan her vektör kapsid için gerekli olan önemli dezavantajı vardır: AAV2 heparin sütunları kullanarak klasik izole olmakla birlikte, örneğin, bu yöntemi AAV4 ve AAV5, hangi heparin bağlama sahip olmayan çalışmıyor onların capsids38sitelerinde. Kromatografi arıtma aynı zamanda pahalı olduğunu göz önünde bulundurursak, arıtma iodixanol tabanlı genellikle daha yüksek kaliteli toplu işlemleri AAV vektörlerin tarihinde bir küçük ölçekli33,39, üretmek istediğiniz laboratuarlar için uygundur 40. ancak, son verim ve vektör saflığı en üst düzeye çıkarmak için aşırı kaygı iodixanol degradeler yaparken gereklidir. Çeşitli iodixanol kesirler olan ucu tüp duvarına dokunmadan steril bir Pasteur pipet kullanarak ultrasantrifüj tüp aktarılması gerektiğini: iodixanol ihraç pipet yavaş yavaş ve sürekli olarak. Vektör parçacıklar % 40 iodixanol katmanında biriktikçe, bakım degrade arabirimleri20rmay sağlamak için alınması gerekiyor. Son olarak, vektör içeren kesir bir göstergesi 20 G. değil daha büyük bir paslanmaz çelik künt iğneyle ekleme tarafından kurtarıldı Vektör kurtarma en üst düzeye çıkarmak için açık kesir tam olarak alınması. Bu adım sırasında zamanlama çok önemlidir. Hazırlık saflığı ödün önlemek için koleksiyon (bulaşıcı) diğer aşamalarında geçişin toplanan önce durdurmak için esastır.
Elde edilen vektör titresi farklılıkları da paketlenmiş parçacıklar üretmek için iç yetenek vektör için bağlanabilir. Farklı AAV serotipleri arasında bir karşılaştırma bazı AAV vektörel çizimler (örneğin, AAV2) diğerlerinden daha yüksek bir titresi, üretmek daha zor olduğunu gösterdi41. Vektör, yağış sırasında desalting adım daha düşük bir titresi olası bir neden olabilir ve kolayca overconcentration33kaçınarak engelledi. Ayrıca, iodixanol gradyan tabanlı arıtma verimliliğini biraz serotipleri arasında değişir ve bu nedenle, farklı serotipi ile elde edilen titresi tutarsızlıkları41dikkat edilmesi mümkündür.
Son olarak, bu teknik bazı doğal değişkenlik qPCR DNA miktar için çok doğru bir yöntem olsa bile görülebilir işaret gerekir. Titrasyon doğruluk öncelikle kesin pipetting ve tüm çözümleri uygun vortexing bağlıdır. Okuma en doğru titresi garantilemek için qPCR bağımsız olarak tekrar edilebilir ve elde edilen değerlerin ortalaması. Bu protokol için sunulan astar seçimi bizim Laboratuvarda kullanılan pTransgene plazmid bulunan CBA organizatörü sırasını temel alır. CBA organizatörü birden çok hücre tipleri arasında yaygın sürücü ifade vektör alanında kullanılan güçlü bir sentetik organizatörü var. Sitomegalovirüs (CMV) erken artırıcı öğesi dahil olmak üzere birden çok öğe içermektedir; Düzenleyici, ilk exon ve ilk intron CBA gen; ve tavşan β globin gen splice alıcısı. Ancak, astar (organizatörü, transgene ve düzenleyici elemanlarının dahil) ifade kaset içinde bulunan hemen her öğe için tasarlanabilir. Titresi toplu işlemleri arasında karşılaştırılması da astar bölgeleri vektörel çizimler söz konusu ortak karşı kullanılan sağlamak mümkündür.
Sonuç olarak, bu protokolü AAV vektörleri ile capsids, genom yapılandırmaları, organizatörü türleri ve transgene yükler çeşitli üretmek için kullanılabilir. Bu kullanıcılar en iyi deneysel gereksinimlerinize uyacak şekilde kendi vektörel çizimler son özelliklerini kolayca uyum sağlar. Temsilcisi sonuçları sunulan örnekte PHP kullanımı. Verimli bir şekilde BBB haçlar, B kapsid yüksek verimli gen ekspresyonu MSS, aşağıdaki kuyruk ven enjeksiyon32verdi. CNS penetrant vektörel çizimler sistemik yönetim olası yan etkileri2,17,32açısından önemli avantajlar vardır. Periferik enjeksiyon invaziv tekniklerin uyarılar kaçınırken, olası bir alternatif AAV vektör teslimini beyin omurilik sıvısı içine oluşur intratekal teslimat olur. Bu teslim yolu transgene yaygın ifade MSS, periferik organ veya bağışıklık yanıtı42seviyesinin düşük daha az hedef kapalı etkilerini gösteren etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bunlar kuyruk ven enjeksiyon daha yüksek teknik beceri gerektirir gibi çok daha zor, ancak, intratekal enjeksiyonları vardır.
Bu teknolojiyi geliştirmek için daha fazla kapsid geliştirme gen terapisi uygulamalarda AAV vektör kullanmak için fırsatlar tarafından tahrik olacak. Bu tür yaklaşımlar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Parkinson ve Alzheimer hastalığı18gibi şu anda tedavi edilemez CNS hastalıkları tedavi etmek için çekici olanaklar sunmaktadır.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Mr Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (iki) doktora sonrası Bursu (133722/1204517N) tarafından desteklenen ve Fundación kardiyovasküler de Kolombiya ve Yönetim Bilimi Bölümü sürekli destek kabul eder, Teknoloji ve yenilik (Grant CT-FP44842-307-2016, proje kodu 656671250485). Mm bir iki Doktora Bursu (1S48018N) tarafından desteklenmektedir. M.G.H. bir VIB kurumsal grant ve Thierry Latran Vakfı (SOD-VIP), vakıf Alzheimer araştırma (SAO-FRA) (P #14006), iki (Grant 1513616N) ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Grant başlangıç için dış destek tarafından desteklenmiştir 281961 - AstroFunc; ««Kavramı Grant 713755 - reklam-VIP kanıtı). Yazarlar için fare yetiştirme onun yardımıyla Jeason Haughton, Stephanie Castaldo kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirme ona yardım için ve Caroline transfected HEK293T hücrelerin görüntülerini sağlamak için Eykens kabul edersiniz. M.G.H. Michael Dunlop, Peter Hickman ve Dean Harrison kabul eder.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Plazmit üretimi | |||
| pTransgen plazmid | De novo tasarım veya bir plazmit deposundan elde edilmiş | N/A Daha | fazla ayrıntı için ana protokolün 1. adımına bakın |
| pCapsid | De novo tasarımı veya bir plazmit deposundan elde edildi | N/A | Daha fazla ayrıntı için ana protokolün 1. adımına bakın |
| pHelper | Agilent | 240071 | |
| Plasmid Plus maxi kiti | Qiagen | 12963 | |
| QIAquick PCR saflaştırma Kiti | Qiagen | 28104 | |
| AAV Yardımcısız Sistem | Agilent | 240071 | |
| Hücre kültürü ve transfeksiyonu | |||
| Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM), yüksek glikoz, glutamin içermez | Yaşam teknolojileri | 11960-044 | DMEM'i FBS (% 1 veya% 10 v / v) ve GlutaMAX 200 mM (% 1 v / v) ile destekleyin, ardından ortamı 0.22 & mikro kullanarak filtreleyin; m filtre |
| Fetal sığır serumu (FBS) | GIBCO | 10500-064 | |
| GlutaMAX takviyesi | GIBCO | 35050038 | |
| (200 mM) | |||
| Corning şişe üstü vakum filtre sistemi | Sigma-Aldrich | CLS430769 | |
| Dulbecco' s Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) | GIBCO | 14190094 | |
| HEK293T hücreleri | Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu | CRL3216 | Alındıktan sonra, hücreleri ve kültürü protokolde açıklandığı gibi çözdürün. Az sayıda pasajdan sonra, alikotlarda gelecek için bir alt fraksiyonu dondurun. Her zaman 20 numaralı pasajın altındaki hücreleri kullanın. Kültürlenmiş hücreler 20 defadan fazla geçildikten sonra, depolanan alikotlardan bir kültürü yeniden başlatın |
| Hücre kültürü kapları | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm çapında kültür |
| kapları Hücre sıyırıcılar | VWR | 10062-904 | |
| Polietilenimin (PEI) | Polibilim | 23966-2 | Toz halindeki PEI, 1 & mikro'da çözülür; g/&mikro; pH=2'de deiyonize suda (ddsu) içinde L (HCl kullanın). Bir beherde hazırlayın ve 2-3 saat karıştırın. Çözündüğünde, NaOH ile pH'ı 7'ye geri getirin. Filtre, sterilize edin ve yeniden askıya alınan stok çözeltisini -20 ° C'de 1 ml'lik alikotlarda saklayın. birden çok kez dondurulabilir/çözülebilir. |
| Virkon çözeltisi | Fisher Scientific | NC9821357 | Birleştirilmiş vektör parçacıklarıyla temas etmiş herhangi bir malzemeyi Virkon çözeltisi |
| Mutexi uzun kollu önlüklerle | Fisher Scientific | 11735423 | Normal bir laboratuvar önlüğünün üzerine bir önlük giyin |
| Fisherbrand maksimum koruma tek kullanımlık galoş | Fisher Scientific | 15401952 | |
| AAV Saflaştırma ve tuzdan arındırma< / güçlü > | |||
| Optiprep yoğunluk gradyan ortamı | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep, suda (steril) %60 (a/h) bir iyodiksanol çözeltisidir. DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Fenol kırmızısı | Sigma-Aldrich | P0290 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın |
| Pastör pipeti | Sigma-Aldrich | Z627992 | Kullanmadan önce sterilize edin |
| OptiSeal Polipropilen tüpler | Beckman | 361625 | |
| Benzonaz (250 U/&mikro; L) | Sigma-Aldrich | E1014 | Kullanıma hazır bir çözüm olarak verilir |
| Acrodisc şırınga filtresi | Pall corporation | 4614 | |
| Omnifix şırınga (5 mL) | Braun | 4617053V | |
| Künt şırınga iğnesi | Sigma Aldrich | Z261378 | Paslanmaz çelik 316 şırınga iğnesi, pipetleme kör 90 derece; uç göstergesi 16, L 4 inç. Metinde künt uçlu iğne Aqua |
| Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Steril endotoksin içermeyen su olarak anılacaktır. 'Ultra saf su' olarak anılırAmicon |
| ultra-15 santrifüj filtre ünitesi | Millipore | UFC910024 | Bu filtreler, vektör parçacıklarını ardışık santrifüjleme adımlarında toplayarak nihai ürünü konsantre |
| Pluronic F68 (100x) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-iyonik yüzey aktif madde. %0,01 (h/h) kullanmak için steril PBS'de |
| seyreltinFisherbrand Vidalı Kapaklı Steril Mikrosantrifüj Tüpleri (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Kolay kullanım için etekli tüpler kullanın |
| AAV Titrasyon | |||
| Restriksiyon enzimi: StuI (10 U/&mikro; L) | Promega | R6421 | |
| DNAse I (1 U/&mikro; L) | Fisher Scientific | EN0521 | |
| Proteinaz K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Ultra saf suda sulandırılır ve 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda kullanılır. Çözelti -20 ° C'de saklanabilir; C |
| EasyStrip Plus Tüp Şeritleri (takılı kapaklı) | Fisher Scientific | AB2000 | |
| Eppendorf mikrotüp 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | |
| LightCycler Multiwell Plakaları, 96 kuyu | Roche | 4729692001 | Beyaz polipropilen plaka (benzersiz tanımlayıcı barkodlu) |
| Microseal 'A' PCR plakası ve PCR Plakası Sızdırmazlık Filmi | Bio-Rad | msa5001 | |
| AAV Saflık kontrolü | |||
| Amonyum persülfat (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Ultra saf suda %10'a (h/h) kadar sulandırılır. DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Tetrametetilendiamin (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | DİKKAT: Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | |
| Rotiphorese® Jel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | 37.5:1 oranında sulu %30 akrilamid ve bisakrilamid stok çözeltisi. DİKKAT: Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | |
| Precision Plus boyalı işaretleyici | Bio-Rad | 1610374edu | |
| 1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | DİKKAT: Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin |
| İmmünohistokimya | |||
| Tavşan anti-GFP | Sinaptik Sistemler | 132002 | 1:300 seyreltme |
| Anti-tavşan Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1.000 seyreltme |
| < güçlü > Ekipman< / güçlü > | < güçlü > Şirket< > | güçlü < güçlü > Katalog numarası< / güçlü> | Comments |
| Vector üretim laboratuvarı | |||
| Rotina 380 tezgah üstü santrifüj * | Hettich | 1701 | |
| Optima XPN 80 ultrasantrifüj * | Beckmann Coulter | A95765 | |
| Tip 50.2 Ti sabit açılı titanyum rotor * | Beckmann Coulter | ||
| ölçek * | Sartorius | 2202-1S | |
| Ilık su banyosu * | 37 &°C'ye ayarlayın; C | ||
| Buz kovası * | VWR | 10146-290 | Vektör üretim laboratuvarında kullanılan malzemeleri standart laboratuvar alanlarında kullanılandan ayrı tutun |
| Pipetboy pro * | Integra | 156.400 | |
| Dereceli pipetler: Hücre yıldızı * | Greiner bio-one | 606180 | 5 mL kapasite |
| Dereceli pipetler: Hücre yıldızı * | Greiner bio-one | 607180 | 10 mL kapasite |
| Dereceli pipetler: Hücre yıldızı * | Greiner bio-one | 760180 | 25 mL |
| CO2 inkübatör kapasitesi CB150 * | Binder | 9040-0038 | 37 &°C'ye ayarlayın; C, %5 CO2 ve %95 nem |
| Nuaire güvenlik kabini NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Kullanmadan önce ve sonra tüm yüzeyleri %70 etanol ve Virkon ile temizleyin |
| Konvansiyonel laboratuvar | |||
| T100 termal döngüleyici * | Bio-Rad | 1861096 | |
| LightCycler 480 Enstrüman II * | Roche | 5015278001 | |
| ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | |
| Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | |
| Mini-Protean Tetra Hücresi* | Bio-Rad | 1658001FC | El yapımı veya prekast jellerle kullanım için |
| ProteoSilver gümüş leke kiti | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | Düşük arka plan ile yüksek hassasiyetli protein tespiti |
| Santrifüj 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | Orta kapasite ihtiyaçları için yüksek hızlı santrifüj (250 mL'ye kadar) |
| Dereceli pipetler Hücre yıldızı * | Greiner bio-one | 606180 | 5 mL |
| Dereceli pipetler Hücre yıldızı * | Greiner bio-one | 607180 | 25 mL |
| Dereceli pipetler Hücre yıldızı * | Greiner bio-one | 760180 | 25 mL |
| Filtre uçları * | Greiner bio-one | 750257 | 1250 ve mikro; L |
| Filtre uçları * | Greiner bio-one | 738257 | 300 & mikro; L |
| Filtre uçları * | Greiner bio-one | 771257 | 10 & mikro; L |
| Kapaklı buz kovası * | VWR | 10146-290 | |
| Mini diyaframlı vakum pompası, VP 86 * | VWR | 181-0065 | |
| Pipetçi P2 | Gilson | F144801 | |
| Pipetçi P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetçi P100 | Gilson | F123615 | |
| Pipetleyici P200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| * Yıldız işaretli malzemeler pahalı ekipman parçalarıdır ve genellikle birden fazla laboratuvar arasında paylaşılan merkezi altyapı öğeleridir. Bu öğeler, varsa eşdeğerleriyle de değiştirilebilir. Farklı bir ultrasantrifüj kullanıldığında, doğru rotor ve santrifüj tüplerinin seçilmesine özen gösterilmesi gerektiğini unutmayın. |
Kaynaklar
- Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
- Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
- Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
- Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
- Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
- Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
- Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
- Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
- Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17(2014).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
- Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
- Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
- Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
- Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
- Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
- QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
- QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
- Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
- Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
- Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
- Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
- Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
- Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
- Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
- Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
- Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28(2014).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste