Yöntem makalesi

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

DOI:

10.3791/58966

⸱

1 Şubat 2019

 , 
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gap kavşak (GJs) bitişik hücreler arasında 1 kDa daha küçük moleküllerin difüzyon izin hücre zarı kanallar vardır. Fizyolojik ve patolojik rollere sahip olduğu ilaç bulma ve toksikoloji deneyleri GJ modülatörler tanımlamak için lüzum-in yüksek-den geçerek (HTS) eleme deneyleri. Bir roman iyodür-Sarı floresan protein-gap junction hücreler arası iletişim (ı-YFP-GJIC) tahlil bu ihtiyacı karşılamaktadır. Stabil olan floresans hassas iyodür veya SLC26A4, bir iyodür taşıyıcı tarafından sırasıyla söndürülür bir sarı floresan protein (YFP) değişken ifade etmek için tasarlanmıştır alıcısı ve donör hücreleri de dahil olmak üzere hücre tabanlı bir tahlil olduğunu. İyodür iki hücre tiplerinin karışık bir kültüre eklendiğinde, donör hücreleri ile SLC26A4 taşıyıcı girin ve nereye YFP floresan gidermek GJs ile bitişik alıcısı hücrelere diffüz. YFP floresan iyi iyi bir kinetik modunda ölçülür. YFP su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Güvenilir ve HTS. için kullanılacak hızlı tahlil LN215 hücreleri, insan gliyom hücreleri, kullanarak ben-YFP-GJIC tahlil için protokol açıklanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gap kavşak (GJs) hareket hücreler arası kanalları küçük moleküllerin difüzyon izin vermek için < 1 kDa besin, metabolitleri ve bitişik hücreler arasında sinyal molekülleri gibi. Bileske öğeleri hemichannel veya connexon her hücrede içerir ve her connexon altı connexins (Cxs)1teşkil eder. GJs ve Cxs gibi GJ inhibitörleri2,3,4olan aromatik polisiklik hidrokarbonlar (PAH), karsinojenler, toksikoloji deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Kesintiye GJIC nongenotoxic karsinojenezis5,6ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Potansiyel terapötik hedef olarak, belirli alt türlerinden nöbetler7,8, kalp ve beyin iskemi/reperfüzyon hasarı9, migren aura10ile koruma GJ tutulum bildirilmiştir, ilaca bağlı karaciğer hasarı6,11ve12şifa yara. Yüksek işlem hacmi (HTS) eleme deneyleri GJ oransal kimyasal madde veya ilaç bulma, toksikoloji deneyleri için için antikorlar tanıtmakta ve Roman hücresel düzenleyiciler GJ faaliyet tanımlamak için gereklidir. HTS deneyleri GJ modülatörler2,13,14,15yapısı-aktivite ilişkileri araştırmak için kullanabilirsiniz.

Bazı GJIC deneyleri boya transferi veya ikili yama kelepçe teknikleri içerir. Lucifer sarı CH (LY) ve calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) boya-devret deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Hücreler LY, mikroenjeksiyon, yükleme kazıma veya Elektroporasyon tarafından kullanılmaya geçirgen değildir. Bir kez hücre içindeki komşu hücreleri yoluyla GJs LY yayılır ve GJ etkinlik LY geçiş16ölçüde tarafından denetlesinler. Calcein-AM deneyleri genellikle photobleaching17,18sonra boşluk-floresan kurtarma içerir. Calcein-AM intracellularly geçirimsiz calcein tarafından içsel bir esteraz dönüştürülür bir hücre permeant boya var. Tahlil bu lazer photobleaching takip çevresindeki bir hücreye calcein-AM transferini gözlemlemek için confocal mikroskop gerektirir. Fonksiyonel GJs varsa, calcein-AM bitişik hücrelerde photobleached hücreleri girer ve floresan kurtarılır. GJ faaliyet photobleached hücrelerinin floresans kurtarma ölçüde tarafından denetlesinler. Boya-devret deneyleri zahmetli ve zaman alıcı veya düşük hassasiyetleri sahip. İkili yama sıkma bileske gürültülerinden ölçer elektrofizyolojik bir yöntemdir. Gürültülerinden doğrudan bir bağımlılık açık GJs19sayısı ile oldukça hassas; Ancak, bu teknik olarak talep, zaman alıcı ve pahalı20. Ben-YFP-GJIC tahlil HTS. kullanım için geliştirilmiştir

Şekil 1 gösterir bileşenleri ve alıcısı hücreleri H148Q ve I152L taşıyan bir iyodür duyarlı YFP değişken ifade kullanır-YFP GJIC tahlil adımlardan (YFPQL) ve donör hücreleri bir iyodür ışınlama (SLC26A4) ifade21 . YFPQL tarafından yapılan iki mutasyon floresans iyodür22tarafından Şoklama izin. İodides Co kültürlü alıcısı ve donör hücreleri eklenir; alıcısı hücreleri girmez ancak mevcut SLC26A4 taşıyıcıları tarafından donör hücreleri alınır. İodides donör hücreleri işleyen GJs nerede YFPQL floresans gidermek bitişik alıcısı hücrelere yaygın. GJs kapalı veya inhibitörleri tarafından bloke, iyodür floresans gidermek için alıcısı hücreleri giremezsiniz. YFPQL su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Ben-YFP GJIC tahlil ne karmaşık ne de zaman alıcı bir işlemdir. HTS ile uyumlu ve nispeten kısa bir süre içinde GJ etkinlik bileşikler çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılabilir. Sadece alıcısı ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözüm gerektirir. Aşağıda açıklanan protokol önemli olan Cx Cx4321yaşında LN215 hücreleri temel alan. LN215-YFPQL reseptörü ve LN215-ı− donör hücreleri YFPQL veya SLC26A421,23ifade lentiviruses ile iletim tarafından üretilen.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. nesil YFPQL ve SLC26A4 ifade lentiviruses

  1. HEK293T insan embriyonik böbrek hücreleri % 80 100 mm Kültür tabaklarda confluency büyümek. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM) boyunca protokolünün HEK293T ve aşağıda belirtilen diğer hücreleri korumak için kullanılan kültür ortamıdır.
  2. Her şey 10 dakika süreyle 2 mL steril poli-L-lizin (PLL) çözüm %0,005 ekleyerek kat 6-şey kültür tabak PLL çözüm Aspire edin ve yüzey iki kez 2 mL steril su ile durulayın.
  3. Yıkama HEK293T hücreleri ile fosfat 10 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış ve 3 dk. eklemek 5 mL kültür ortamının için 37 ° C'de 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile her 100 mm çanak içinde hücre monolayers tedavi ve hücreleri resuspend.
  4. Bir hemasitometre hücreleri saymak ve 250.000 hücre/ml kültür ortamında hücre süspansiyon yoğunluğunu ayarlamak ve 500.000 hücreler kültür orta 2 mL için lisin kaplı de 6-şey plakaları ekleyin. Oksijen 5 hücrelerde kuluçkaya % CO2/95% hava atmosfer 24 h 37 ° C'de ve kültür orta DMEM ile penisilin veya streptomisin değiştirir.
  5. Bir 1,5 mL tüp transfection reaktif 20 µL DMEM 500 µL serum veya antibiyotik olmadan ile sulandırmak. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve 5 min için oda sıcaklığında bekletin.
  6. Bu arada, DMEM 250 µL her iki 1,5 mL tüpler içine pipet ve 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL veya pLenti6P-SLC26A4, psPAX2, 1225 ng ve 375 ekleyin her pMD2.G ng. İki lentiviral plazmid yukarıda açıklanan21olmuştur. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya seyreltilmiş transfection reaktif 250 µL her plazmid tüp ekleyin.
  7. 20 dk sonra transfection reaktif ve plazmid kompleksleri 500 µL 1,5 mL tüplerde dropwise her kültür tabağına de adım 1.4 ve mix tabak ileri geri sallanan tarafından ekleyin. CO2 kuluçka için 12 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  8. Orta ile 2.5 mL taze orta değiştirmek ve ek bir 48 saat için kuluçkaya. Sonra kültür plaka buz infektivite korumak için soğutulmuş lentivirus içeren şartına orta tutmak 5 min için yerleştirin.
  9. Lentiviruses içeren medya hasat ve 15 mL konik tüpler için transfer. 3000 x g 3 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve kayan HEK293T hücreleri süpernatant 0.4 µm, filtrasyon sayesinde kaldır.
  10. Lentiviruses 2 gün içinde kullanılmak üzere 4 ° C'de içeren medyayı depolamak. Daha sonra kullanmak üzere saklamak 200 µL aliquots −80 ° C.

2. nesil LN215-YFPQL ve LN215-ı− hücreleri tarafından lentiviral iletim

  1. 100 mm Kültür plakaları LN215 hücrelerde % 80 ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) 100 U/mL penisilin ve yukarıda açıklandığı gibi 100 µg/mL streptomisin takıma DMEM confluency büyür.
    Not: Eğer ben-YFP-GJIC tahlil farklı hücre satırı kullanarak yapılır, uygun kültür aracı kullanın. LN215-YFPQLve LN215-ı- hücreleri Yonsei Üniversitesi Üniversite-Sanayi Vakfı tarafından sağlanan. Lütfen ilgili yazarına başvurun.
  2. Bir gün önce iletim, yıkama hücreleri iki kez PBS 10 mL ile % 0.25 tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° C'de 2 mL ile tedavi 5 mL 10 mL gonore pipet ile kültür ortamının hücrelerde Resuspend ve 50. 000 hücre/ml yoğunluğu ayarlayın. 20.000 hücre medya 400 µL içinde her şey için tedavi hiçbir virüs denetimi, YFPQLve SLC26A4 hücreleri olarak 24-şey kültür plaka ekleyin.
  3. PLVX-EIP-YFPQL veya pLenti6P-SLC26A4 lentivirus ve taze kültür polybrene, 4 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma orta 1:1 karışımı 400 µL kültür orta değiştirerek, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra iki kuyu transduce. Hiçbir virüs denetimler için kültür orta ile değiştirin.
  4. 15 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya, lentiviruses içeren orta Aspire edin, taze kültür orta eklemek ve bir ek 72 h için hücreleri kuluçkaya.
    Dikkat: kültür lentivirus içeren orta Aspire edin veya taze büyüme orta dağıtmak lentivirus kuyular arasında kirlenmesini önlemek için yeni ip uçlarına ya da pipets her şey için kullanın.
  5. 3 dk. Resuspend için kültür orta 2 mL hücrelerde ve 2 µg/mL puromisindir ile altı-şey kültür tabak tabak her hücrelere de iki kez PBS 0.5 mL ile tripsin-EDTA 300 µL ile tedavi yıkama.
  6. Denetimdeki tüm hücreleri de ölünceye kadar 2 µg/mL puromisindir içeren medya hücrelerde Kültür (yuvarlak şekilli veya mikroskobu gözlenen yüzen), genellikle bir hafta sürer. Kültür puromisindir her geçen gün seçim döneminde içeren medya yenileyin. Eğer LN215 YFPQL veya LN215-ı- seçim tamamladı önce haline kültürler birleşmesi, 100 mm hücrelere plaka ve seçim adım 2,5 olduğu gibi devam transfer.

3. hazırlık tahlil için gerekli çözümleri

  1. 500 mL C-çözüm (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2ve 1 mM CaCl2) ve ben-çözüm (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glikoz, 5 mM KCl ve 1 mM CaCl2) 500 mL hazırlayın.
  2. 7.4 1 N NaOH ile her iki çözüm pH ayarlama, çözümler depolama için 0.4 µm, filtrations tarafından sterilize. 4 ° C'de 1 ay için saklayın. PH kullanmadan önce kontrol edin.

4. LN215-YFPQL ve LN215 kaplama-ben− hücreleri

  1. LN215-YFPQL ve LN215 kültür-ben 100 mm Levha ayrı ayrı kültür tayini için gerekli populasyonlarının reach için orta− hücrelerde. LN215-YFPQL ve LN215-ı−







  1. figure-protocol-1
    figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

29 96-şey kültür plakaları istimal belgili tanımlık LN215-YFPQL ve LN215-YFP GJIC tahlil tarafından roman GJIC modülatörler tanımlamak için 2,320 kimyasallar ekran için kullanılmıştır-ben− hücreleri. Temsil edici bir plaka ile elde edilen sonuçlar Şekil 2' de gösterilir. Her iyi YFP floresan yüzdesi Şekil 2A bir çizgi grafik olarak gösterilir ve her şey GJIC etkinlik yüzdesini

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlam, hızlı ve ucuz olduğu için ben-YFP-GJIC tahlil HTS için kullanılabilir. Bir HTS tahlil sağlam kabul edilir eğer Z'-0.525bir faktördür. Zhang ve ark. bkz: HTS deneyleri25uygunluğunun değerlendirilmesi için kullanılan istatistiksel analiz açıklaması için. LN215 hücreler kullanıldığında, Z'-faktör oldu > 0,5 olmadan herhangi bir tahlil en iyi duruma getirme. Diğer hücre tipleri tahlil ve onun Z kullanılan Eğer '-faktör < 0.5, sağlamlık geliştirilmiş olabilir tahlil saat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 ve 2018R1A6A1A03023718).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 oyuklu plakaSPL30096
Kalsiyum klorür (CaCl2)SigmaC5670I-çözelti
D-(+)-GlikozSigmaG7021C-çözeltisi, I-çözelti
Dimetil sülfoksit (DMSO)sigma276855
HEPESSigmaRES6003H-B7C-çözeltisi, I-çözelti
Lipofektamin 2000Invitrogen11668-027transfeksiyon reaktifi
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2 6H2O)SigmaM2393C-çözeltisi
Mikroplaka okuyucu ve nbsp;BMG Laboratuvar Teknolojisi POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G Addgene# 12259
PolibrensigmaH9268
Poli-L-lizin çözeltisisigmaP4707
Potasyum klorür (KCl)SigmaP5405C-çözeltisi, I-çözelti
psPAX2 & nbsp;Ekleyin #12260
Puromisin DihidroklorürsigmaP8833
Sodyum klorür (NaCl)SigmaS5886C-çözeltisi, I-çözelti
Sodyum hidroksit (NaOH)SigmaS2770
Sodyum İyodür (NaI)Sigma383112I-çözeltisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
  2. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).
  3. U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
  4. Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
  5. Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
  6. Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
  7. Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
  8. Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
  9. Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
  10. Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
  11. Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
  12. Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
  13. Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
  14. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
  15. Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
  16. el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
  17. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
  18. Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909(2005).
  19. Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
  20. Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
  21. Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
  22. Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
  23. Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
  24. Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
  27. Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
  28. Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
  29. Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
  30. Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gap Ba lant laryod r YFP GJIC AnaliziY ksek Kapasiteli TaramaFloresan iddetiH cre Tabanl AnalizLN215 H creleriSLC26A4 Ta y c syod r S nd rmesiMikroplaka Okuyucu

İlgili makaleler