Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Ultra-thin Polydimethylsiloxane mikrosıvısal çip su tutma ile kullanarak canlı Caenorhabditis elegans bireylerin immobilizasyon

7.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59008

⸱

19 Mart 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Bu makalede

Özet

İmmobilizasyon yöntemleri bir dizi canlı Caenorhabditis elegans hedeflenen ışınlama izin vermek için kurulmuş olup son zamanlarda gelişmiş Ultra-ince polydimethylsiloxane mikrosıvısal kullanarak bireyler çip ile su tutma. Bu roman üstünde-küçük parça immobilizasyon gözlemler görüntüleme için yeterlidir. Detaylı tedavi ve çipin uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Özet

Radyasyon iyon-ışın ıslah ve biyolojik uygulamalar için yaygın olarak kullanılır ve bu yöntemler arasında microbeam ışınlama canlı organizmalar radiosensitive siteleri tanımlama için güçlü bir yol gösterir. Bu kağıt üstünde-küçük parça immobilizasyon yöntemleri Caenorhabditis eleganscanlı bireylerin hedeflenen microbeam ışınlama için geliştirilen bir dizi açıklar. Özellikle, daha önce anestezi ayrıntılı olarak açıklamak için gerek kalmadan C. elegans bireyler hareketsiz için geliştirdiğimiz polydimethylsiloxane (PDMS) mikrosıvısal çip tedavisinde. Bu çip bir solucan sayfası anılacaktır, genişletilecek mikrosıvısal kanalları izin esnektir ve hayvan yavaşça saran için esneklik sağlar. Ayrıca, PDMS öz adsorpsiyon kapasitesi sayesinde hayvanlar kanallarında hangi hayvanlar koymak gibi muhafaza için itilir değil bir ince kapak film ile solucan levha yüzeyini örten tarafından mühürlenmiş. Kapak film üzerinde dönüm tarafından kolayca hayvanlar toplayabilirsiniz. Ayrıca, solucan sac su tutma gösterir ve C. elegans kişilerin canlı koşullar altında uzun süre mikroskobik gözlem tabi olanak sağlar. Buna ek olarak, sayfayı sadece 300 µm kalınlığında, böylece iyon parçacıkları tespit edilmesini sağlayan hayvanlar, ekte sayfa boyunca geçmek için karbon iyonlar gibi ağır iyonları ve doğru bir şekilde ölçülecek uygulanan radyasyon dozu izin olduğunu. Seçim hayvanları kapsayan için kullanılan kapak filmlerin başarılı uzun süreli immobilizasyon için çok önemli olduğu için biz uygun kapak filmlerin seçimi yapılan ve önerilen bir bazı filmler arasında gösterdi. Çip uygulama örneği, hayvanların solucan sayfası, hem de microbeam ışınlama mikrosıvısal kanal çevreleyen kas faaliyetleri görüntüleme gözlem tanıttı. Bu örnekler solucan sayfaları biyolojik deneyler için olanaklar büyük ölçüde genişlettik gösterir.

Giriş

Radyasyon, x-ışınları, gama ışınları ve ağır iyon demeti, dahil olmak üzere yaygın kanser tanı ve tedavi gibi biyolojik uygulamalar için ve iyon-ışın ıslahı için kullanılır. Şu anda çok sayıda çalışmalar ve teknik gelişmeler radyasyon1,2,3etkileri üzerinde duruluyor. Microbeam ışınlama yaşayan radiosensitive siteleri tanımlama güçlü bir demektir organizmalar4. Takasaki gelişmiş radyasyon Araştırma Enstitüsü, ulusal kurumları kuantum ve radyolojik bilimi ve teknolojisi (QST-Takasaki) ışınlatayım ağır iyon kullanarak mikroskobik gözlem altında tek tek hücreler için bir teknoloji geliştirme microbeams5ve hedeflenen microbeam ışınlama Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans4,6, silkworms7ve Oryzias gibi birkaç modeli hayvanların etkinleştirmek için yöntemleri kurmuştur latipes (Japon medaka)8. Nematot C. elegans hedeflenen microbeam ışınlama böylece hareket gibi süreçlerde bu sistemlerin rolleri tanımlamak için yardımcı sinir ringde baş bölge gibi belirli bölgelerde etkili nakavt sağlar.

Anestezi için gerek kalmadan C. elegans bireylerin üstünde-küçük parça immobilizasyon için bir yöntem microbeam ışınlama4için izin vermek için geliştirilmiştir. Ayrıca, önceki çalışma4' te kullanılan mikrosıvısal çip artırmak için biz son zamanlarda ıslanabilir, iyon-geçirgen, polydimethylsiloxane (PDMS) mikrosıvısal cips, solucan sayfaları ( Tablo malzemelerigörmek) için adlandırılan geliştirdik C. elegans bireyler9immobilizing. Bunlar ultra-ince yumuşak yaprak oluşturan (kalınlığı 300 µm; = genişlik = 15 mm; uzunluğu = 15 mm) birden fazla (20-25) düz mikrosıvısal kanal ile (derinlik 70 µm; = genişlik = 60 µm veya 50 µm; uzunluğu 8 mm =) (Resim 1A-D) yüzeyde. Mikrosıvısal kanalları açık ve onları aynı anda alınması birden fazla hayvan izin (şekil 1E). Çarşafları (~ % 10, şekil 1F) açılacak mikrosıvısal kanalları izin esnektir ve hayvan yavaşça saran için esneklik sağlar. Ayrıca, PDMS öz adsorpsiyon kapasitesi sayesinde hayvanlar kanallarında hangi hayvanlar koymak gibi muhafaza için itilir değil bir ince kapak film ile solucan levha yüzeyini örten tarafından mühürlenmiş. Kapak film üzerinde dönüm tarafından kolayca hayvanlar toplayabilirsiniz.

Ne zaman onlar içine alınır veya toplanan olduklarında kanalları solucanlar zarar vermeyin. Ayrıca, çarşafları aslında hidrofobik olan PDMS yapılır ama su tutma hydrophilicity malzeme için imparting tarafından elde edilebilir. Su tutma ve kalınlığı solucan sayfaları olumlu özellikleridir. Su tutma kapasitesi hayvanlar susuzluktan sonra uzun süreli immobilizasyon önler ve uzun süreli gözlemler uygulanacak sağlar.

Ayrıca, daha önce9açıklandığı gibi çarşafları sadece 300 µm kalınlığında, karbon iyonları (ile su yaklaşık 1 mm aralığı) gibi ağır iyonları hayvanları kapsayan sayfa boyunca geçmek için izin vardır. Bu iyon parçacıkları tespit edilebilir ve doğru bir şekilde ölçülecek uygulanan radyasyon dozu sağlar. Ayrıca, solucan sayfaları yeniden kullanılabilir ve dolayısıyla ekonomik. Geleneksel enjeksiyon yöntemi ile alınmış hayvanlar bazen ölü ve kanal dışında alınamaz; yumurta kanalları yapışmasına neden olabilir. Bu çip kullanılamaz yapar. Fiş vardır, bu nedenle, temel olarak tek kullanımlık ve maliyet-fayda oranı düşük.

Bugünkü yazıda, biz canlı C. elegans üstünde-küçük parça immobilizasyon yöntemleri bir dizi ayrıntılı olarak tarif solucan sayfası kullanmayı bireyler. Hareket deneyleri 3 h üstünde-küçük parça immobilizasyon sonra hayvanların uygun kapak film değerlendirildi. Buna ek olarak, biz üstünde-küçük parça immobilizasyon görüntüleme gözlemler ve microbeam ışınlama için örnekler gösterdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. suşları ve bakım

  1. C. elegans ve Escherichia coli (Gıda) uygun bir tür deney amacına bağlı olarak seçin.
    Not: mevcut yazıda, vahşi tipi N210C. elegans (Şekil 2A) genel olarak kullanılır ve HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 sadece tahlil görüntüleme için istihdam. E. coli OP50 C. elegansgıda olarak kullanıldı. Anormal vücut şekli, sarmal şeklinde (Şekil 2B), unc-119(e2498) III mutant gibi bazı mutantlarla düz mikrosıvısal kanalları (Şekil 2C) içine alınması.
  2. 6 cm Petri gecede inkübe (37 ° C de)10. daha önce açıklandığı gibi E. coli yaymak nematodunun büyüme orta (NGM) 10 mL içeren yemekleri 20 ° C'de C. elegans korumak Mümkünse, C. elegans gelişim aşamalarında embriyo Sahne Alanı'ndan eşitleyin.
  3. İyi beslenmiş Yetişkin Hayvanlar, yaklaşık 3-4 gün sonra tarama hakkında uzunluğuna sahip kullanmak en iyi şekilde uygun mikrosıvısal kanalları solucan tablolarında büyüklüğüne 50-60 µm.

2. üstünde-küçük parça immobilizasyon için arabellek çözüm yelpazesi

  1. Islanabilir solucan sayfaları için deneyler amacına bağlı olarak herhangi bir arabellek çözüm kullanın.
    Not: Uygun tampon çözeltiler üstünde-küçük parça immobilizasyon PDMS mikrosıvısal çip olmuştur Tarih için önceden tanımlanmış9 ve aşağıdaki tampon çözeltiler immobilizasyon sonra hayvanların hareket üzerinde etkisi gösterilmiştir: S Bazal arabellek çözüm (5.85 gram NaCl, kolesterol (5 mg/mL etanol) 1 mL, 1 M pH 6.0 potasyum fosfat, H2O için 1 L; 50 mL tarafından ısıyla sterilize) NaCl, M9 fosfat tampon çözüm (5 gr NaCl büyük miktarda içeren10 , KH2PO43 g, Na2HPO46 g, 1 mL 1 M MgSO4, H2O 1 M'ye; tarafından ısıyla sterilize)10, yıkama arabellek çözüm (1 M pH 6.0 potasyum fosfat 5 mL, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 0.5 g pf jelatin, H2O için 1 L; 1 mL tarafından ısıyla sterilize) jelatin içeren12 ve ultrasaf su9. Bugünkü gazetede yıkama arabellek çözüm genellikle kullanılır ve S Bazal arabellek çözüm sadece farklı kapak filmler bölümünde 3 kullanma üstünde-küçük parça immobilizasyon değerlendirmek için istihdam edilmektedir.
  2. Wettability olmadan geleneksel mikrosıvısal çip için çipin mikrosıvısal kanallarda nem bakımı en etkili yolunun sağlar ve böylece kurutma C. elegans bireyler () bir yıkama arabellek çözüm kullanın wettability ne olursa olsun) mikrosıvısal fiş.

3. üstünde-küçük parça immobilizasyon için uygun kapak film seçkisi

  1. Aşağıdaki gibi farklı kapak Filmler hazırlayın. Biyouyumlu kapak Filmler (Yani, 10-15 mm genişlik ve uzunluk 30-50 mm) uygun bir boyut için işleme aşağıdaki şeffaf, kesmek, kolaylığı: 130-170 µm kalınlığında cam, 125 µm kalınlığında polyester (PET) film ve ~ 130 µm kalınlığında polistiren (PS) film.
  2. 3 h üstünde-küçük parça immobilizasyon farklı kapak filmleri aşağıdaki gibi kullanarak gerçekleştirin. Adımları 4.1-4,6, temel ≥10 solucan sayfası her kapak film sırasıyla kullanarak Yetişkin Hayvanlar (tarama sonra 3,5 gün) yıkanmış alın ve 3 h bırakın.
  3. Karşılaştırma amacıyla, aşağıdaki gibi 3 h serbest dolaşımı sağlar. Yer ≥10 3 mL içeren 3,5 cm tabak içinde yetişkin hayvanlar yıkanmış taze NGM, kapak kapak ile ve 3 h bırakın.
  4. Hayvanlar üstünde-küçük parça immobilizasyon adımları 5.1-5,3 göre 3 h hemen sonra toplamak. Kapak film solucan sayfasından kaldırın ve her hayvan için arabellek çözüm bir damla ekleyin. Platina Seçici'yi kullanarak damlacık Yüzme hayvan almak ve onları 3 mL içeren bir 3,5 cm tabak transfer taze NGM gıda (tahlil plaka) olmadan.
  5. Hayvanlar serbest dolaşımı 3 h sonra toplamak. Arabellek çözüm bir damla her hayvan için ekleyin. Damlacık NGM plaka üzerinde Yüzme hayvan almak ve bir platina Seçici'yi kullanarak bir tahlil plakasına aktarabilirsiniz.
  6. Motilite (hareket tahlil) kapak film etkilerini değerlendirmek.
    1. Tahlil plaka sayısı transferden sonra en az 5 dk ' vücut kıvrımları (20-s aralıklarla anterior vücut bölgesinde virajlı sayısı olarak tanımlanmış) el ile mikroskop13altında.
    2. Hareket deneyleri beş kez bağımsız olarak her kapak film için taşırlar.
      Not: içinde birden fazla hayvan aynı anda, yalnızca beş hayvan önceki çalışma13' te sayılan ile karşılaştırıldığında içine her deneme için 10 hayvan temsilcisi sonuçlarında gösterilen deneylerde değerlendirildi.
    3. Vücut kıvrımları 10 hayvan her deneme için her grup için ortalama sayısını hesaplayın. O zaman üstünde-küçük parça immobilizasyon effects değerlendirmek için beş bağımsız deneyler değerleri ortalama. İstatistiksel olarak bir elektronik tablo yazılımı, 0,01 ve 0,05 önem düzeylerindeki içinde bir tek yönlü Varyans analizi (ANOVA) testi kullanarak veri analiz.
      Not: Bu deneyler üzerinde bağlı olarak, yüksek oksijen geçirgenliği ile bir PS kapak film uygun kabul edildi (temsilcisi sonuçları görmek). Bu PS filmler ile solucan tabloları dahil edilir. Çünkü hayvanlar ile uzun süreli immobilizasyon solucan sayfalardaki sırasında Eğer boğmak eğiliminde düşük oksijen geçirgenliği olan evde beslenen hayvan film, uygun kabul edildi değil. Kapak film işlemler bir dizi sırasında kırmak önemlidir; cam kapaklar bu nedenle de uygun olmayan (temsilcisi sonuçları görmek).

4. on-chip immobilizasyon

Not: Solucan sayfaları kirletici önlemek için tek kullanımlık, steril eldiven giyilmelidir.

  1. Bir ince şeffaf levha üzerine deneysel Danışma ya da mikroskobik bir alt kapak film olarak kullanmak için hiçbir autofluorescence olan bir PS veya cam kapak film gibi yerleştirin. Bir solucan levha yavaşça düz cımbız kullanarak alt kapak film üzerine yerleştirin.
    Not: 60 µm çapında mikrosıvısal kanal (3-4 gün sonra damızlık yetişkinler için uygun) solucan çarşafa ek olarak 50 µm çapındaki kanalları (genç yetişkinler tarama ve küçük vücut mutantlarla sonra 3 gün içinde yetişkin sahne için uygun) sayfalarıyla da istihdam edilebilir. Kullanılacak hayvan boyutuna göre uygun bir sayfayı seçin.
  2. Hayvanları toplamak için bir bireysel yetişkin C. elegans platina Seçici'yi kullanarak bir stereomicroscope altında kültür plaka almak. Birden fazla hayvan gerekirse işlemi tekrarlayın.
  3. Gıda (bakteri) kaldırmak için hayvanları yıka.
    1. En az üç damlacıkları (5 µL damla) arabellek çözüm 6 cm sigara tedavi (su itici) Petri kabına bir yüzeye yerleştirin.
    2. Hayvanlar bir platina Seçici'yi kullanarak bir damlacık aktarmak ve yüzme ile herhangi bir gıda kaldırmak izin. Onları iki ayrı damlacıkları iki kez yıkamak ve hayvanlar içinde başka bir damlacık durulayın.
      Not: Hızlı bir şekilde herhangi bir deneyler gerçekleştirmeden önce gerçekleştirmek için bu yordam uygulama gereklidir.
  4. 2-3 µL bir solucan levha yüzeyine tampon çözeltinin bırak. Damlacık Petri kabına üzerinde yıkanmış hayvanlardan almak ve damlacık için solucan kağıda aktarmak.
  5. Hayvanlar gibi takip mikrosıvısal kanallarında alın. Bir PS kapak film düz cımbız kullanarak solucan levha yerleştirin ve hafifçe sayfasının bir ucundan diğer kanallar üzerinden4,9(daha önce açıklandığı gibi) nem korumak için tuşuna basın.
    Not: Hayvanlar rastgele kanalların içine alınır. Hayvanları içeren damlacıklar solucan yaprak yaygın olarak birkaç kanalları genişletilmiş damlacıkları sonuçlanan levha, kapsayan tarafından yayılır. Her hayvan bu kanallar herhangi birinde içine alınması. Önemli nokta üstünde-küçük parça immobilizasyon için solucan sayfası kullanımı ile ilgili birden fazla kanal geniş bir alana kullanılabilir olmasıdır.
  6. Hayvanlar mikrosıvısal kanallarında kapsayan hemen sonra onlar baş bir mikroskop altında hareket için kontrol ederek hayatta olduğundan emin olun (Örneğin, 1 x veya 2 x büyütme).
  7. Adım 4,6 taşıyan aynı zamanda hayvanın pozisyon, kaydetmek ve aşağıdaki özel bir kağıt (ek dosya 1) üzerine Not: hangi hayvan içine; kanal sayısı her hayvanın bulunduğu kanal (sağ/sol/orta); ve baş yönünü.
  8. Hayvanın kafası için karşılık gelen ok yönünü ile kanal, her hayvan konumunu işaretlemek için ok çizin.
    Not: Kanal numaraları (Örneğin, 1, 5, 10, 15, 20, 25) mikrosıvısal kanalları (şekil 1B) sol ve sağ kenarları yakınındaki solucan levha yüzeyine kazınmış. Bu bilgiler adanmış sayfa üzerinde hızlı bir şekilde bulunduğu hayvanlar süreci daha verimli hale sağlar ve ayrıca sonraki adımları boyunca radyasyon sızıntısı önlemeye yardımcı olur.

5. hayvanlardan bir solucan sayfa topluluğu

  1. Hemen immobilizasyon sonra kapak film düz cımbız kullanarak solucan sayfasından kaldırın.
  2. 10-15 µL arabellek çözüm hayvanları kapsayan mikrosıvısal kanalları üzerine bırakın ve bir stereomicroscope altında damlacıkları yüzmek başlangıç hayvanlar gözlemlemek.
    Not: Hayvanlar Yüzme herhangi olmadan kendi ek basınç, yardım veya itme yeni damlacık başlatın. Sadece bazı arabellek üstünde tepe-in onları bırakarak onları dışarı kanal yüzmek için yeterli. Bu hayati adım 7,9 ışınlama veya adımları 4.2-4.5, immobilizasyon sürecinde zarar görmüş bir damlacık bu nadir olmasına rağmen yüzmeyi bir hayvan olabilir. Buna ek olarak, bu kaldırıldığında hayvan kapak filmin bağlı kalır damlacıkları üzerine kapak filmin yerine koymak gibi ekleyin.
  3. Platina Seçici'yi kullanarak damlacık Yüzme hayvan almak ve onları bir tahlil tabağa yerleştirin.

6. gözlemler görüntüleme için solucan sayfaları uygulanması

Not: Solucan sayfaları içinde mikroskobik gözlemler yaygın olarak kullanılabilir. Çip su tutması ve C. elegans bireylerin hareketliliği üstünde-küçük parça immobilizasyon93 h sonra etkilemez. Ayrıca, çip kendisi deneyleri Imaging Floresans kullanım için uygun yapım yok autofluorescence vardır. Bir örnek uygulama Floresans görüntüleme tahlil için aşağıda verilmiştir.

  1. Floresan mikroskop seçin ve bir dijital fotoğraf makinesi dijital video kamera yakalama görüntülere veya videolara için mikroskop sırasıyla sağlayamazsınız (şekil 3A).
    Not: Mikroskop çalışma mesafesi (WD) den fazla 0.2 mm objektif lens belirtimi bağlı olarak mı (bkz. şekil 3B, C). Bu yazıda kullanılan floresan mikroskop sistem tayini Malzemeler tablogösterilir. Bu gözlem bilerek bağlıdır çünkü ancak, belirtimi için bizim örnek sınırlı değildir veya / ve kullanıcılar.
  2. C. elegans ve floresan herhangi bir zorlanma seçin ve 1 bölümünde açıklandığı gibi korumak.
    Not: vücut-duvar kas kasılması gözlemlemek için gerekli olup olmadığını (temsilcisi sonuçlarını görmek), genç yetişkin HBR411C. elegansbir muhabir gen kalsiyum göstergesi GCaMP3.35 tüm vücut-duvar kas hücrelerindeki ifade etmek için kullanılan, kullanın. Solucan sayfasının mikrosıvısal kanalları (50-60 µm) genişliğinden daha ince olan genç yetişkinler (≤3 gün sonra tarama) kullanılması önemlidir. Geçiş izni küçük derecesini hayvanlar biraz, tarama sırasında kas kasılma ve uzantısı gözlemlemek edinerek kalsiyum iyon göstergesi kullanarak bükebilir ki anlamına gelir.
  3. Muhafazanın hayvanlar bölümünde 4 immobilizasyon yordamına uygun olarak yürütmek.
  4. Bir floresan mikroskop kullanarak hayvanların (örneğin, yeşil flüoresan suşları protein etiketli) floresan noktalar gözlemlemek ve mikroskobunun monte bir dijital kamera ile çekim.
    Not: daha önce kurulan yöntemleri14,15,16, mikroskop gözlem yöntemleri (floresan gözlem de dahil olmak üzere) beri izleyin ve mikroskop sistem tayini bağlıdır gözlem amacı.
  5. Vücut-duvar kas kasılması ve HBR4 solucanlar (Video 1) uzantısında gibi dinamik etkinliklerini gözlemlemek için video edinme kullanarak görüntü kalsiyum iyon dalga yayılımı.

7. microbeam ışınlama için solucan yaprak uygulanması

Not: Collimating microbeam ışınlama sistemi5 Takasaki iyon Hızlandırıcılar gelişmiş radyasyon uygulaması (taç) tesis için yüklü azimuthally değişen alan cyclotron dan hızlandırılmış birkaç ağır iyon parçacıklar kullanabilirsiniz KDT-Takasaki (şekil 4A). Işınlama ışın çıkış (şekil 4B) altında için otomatik bir sahne vardır. Bu sistemi kullanarak C. elegans ağır iyon microbeam ışınlama için prosedür aşağıdaki gibidir.

  1. Microbeam-ışınlama tesisi için ısmarlama bir alüminyum çerçeve üzerinde birden fazla hayvan kapsayan solucan sayfası bulun ve otomatik sahne alanı'ndaki ışınlama (şekil 4C) için ayarlayın.
  2. İçin (Yani, bir solucan sayfada bir çerçeve içine alınmış hayvanlar), ışınlama örnek yükseltmek hemen altında (~ 2 mm) ışın çıkış otomatik sahne (şekil 4D) altında bulunan mikroskop monitör görüntü dayalı.
  3. Dikey konumlandırma sonra hedef için her hayvan hayvanlar ve hücre kültürleri hedeflenen ışınlama için özel yazılım kullanarak microbeam ışınlama ile bulun. Mikrosıvısal kanal içine her hayvan bulmak için adım 4.7-(bkz. ek dosya 1) 4.8 içinde açıklanan özel sayfasına bakın ve kanal kanal sayısı sol ve sağ kenarları yakınındaki onaylayın.
  4. X otomatik aşamasında kontrol ve Y yön hayvanlar sadece ışın altında konumlandırmak için bir uzaktan kumanda sistemi kullanarak çıkmak ve bir lazer fare ışınlama yazılımı ile işletilmektedir.
  5. Kabaca nağme--dan mikroskop projeksiyon izleyerek radyoterapi alan örnek ve hedef hayvan ışınlama konumunu imleç taşıma otomatik sahne altında yer alan.
  6. Kaba konumlandırma sonra çıkın ve ışınlama odası kapatın ve işleçler irradiating önlemek için bitişik kontrol odasına taşımak.
  7. İyon parçacıklar hayvanın konsolunu kullanarak belirli bir bölgeye ışınlama için karşılık gelen bir ışınlama prosedürü için istediğiniz sayıyı bir iyon-sayaç sistemine bağlantılı ayarlayın.
    Not: Bu bir plastik scintillator ve bir photoelectron çarpan collimating microbeam ışınlama sisteminde oluşur.
  8. Işınlama kontrol odasından ışınlama odasında (şekil 4E) monitörde öngörülen aynı görüntü otomatik sahne altında bulunan mikroskop monitör görüntü dayalı hayvanlar konumunu ince ayar yapın.
  9. Microbeam ışınlama ışınlama için yazılım ışınlama düğmesini bir tıklama ile hedef.
    Not: şekil 4' teFgösterilen örnekte, biz baş bölgesinde yutak hedef ve microbeam karbon iyonlar uygun sayıda ile ışınlatayım. Konsol ve ışınlama yazılım bağlantılı bir iyon-counter sistemi kullanarak örnek geçen iyon parçacıkları sayısı sayıldığından, ışınlama iyon parçacıklar için istediğiniz sayıyı doğumdan sonra durduruldu.
  10. Özel sayfasında kaydedilen her hayvan bulun ve her hayvan için hedeflenen ışınlama yürütmek. Bütün hayvanlar ışınlanmış 7,8 ve 7,9 tamamlayana dek.
  11. Hemen sonra ışınlama, ışınlama odası girin ve otomatik ışınlama sahne alt. Örnek otomatik sahne alanı'nda bulunan özel yapım çerçeve üzerinde kaldırın.
  12. Hayvanlar 5.1-5,3 adımlarda açıklandığı gibi toplamak.
  13. Davranış ve/veya moleküler analizleri çalışma amacına bağlı olarak hedeflenen ışınlama etkilerini değerlendirmek için gerektiği şekilde taşımak.
    Not: 3.6. adımda anlatılan hareket tahlil ışınlama hareketliliği4,9üzerinde etkilerini değerlendirmek için etkili bir yöntemdir.

8. tekrar tekrar kullanımı için solucan yaprak tedavisinde

Not:-Ebilmek var olmak solucan sayfaları art arda en az 10 kez9 hayvanlar üzerinde hiçbir olumsuz etkisi ile temiz ve düzgün kullandıktan sonra aşağıdaki gibi sterilize kullanılır.

  1. Temizleme
    1. Kullanılan solucan sayfası bir 6 cm Petri kabına yerleştirin ve yaklaşık 100 µL sterilize ultrasaf su tam sayfa üzerine bırak.
    2. Su sayfasını kullanarak yüzeyi kir toz, bakteri gıda ve herhangi bir yumurta gibi kapalı yıkamak için parmak eldivenli kürek kanallarında koydu.
    3. Solucan sayfası iyice tek kullanımlık mendil kullanarak kapalı nem silin.
  2. Sterilizasyon
    1. Yaklaşık 5 mL % 70 etanol Petri kabına solucan sayfası içeren enjekte edip kürek kir yıkamayı eldivenli parmaklarını kullanarak levha yüzeyine.
  3. Kurutma
    1. % 70 etanol ile dolu Petri kabına fişleri kaldırmak ve doğal olarak kurumasını bekleyin.
  4. Depolama
    1. Kurutma sonra solucan sayfası üzerinde steril Petri kabına yerleştirin ve yeterli. Yaprak da % 70 etanol ile dolu bir steril Petri saklanabilir.
      Not: Kapak filmleri kullanımdan sonra atın ama eğer onlar yeniden kullanılan olmak için solucan sayfası olarak temizlemek iyidir. Ancak, kıvrımları kapağı filmde geliştirirseniz kullanımdan sonra bu artık hayvanlar, dehydration içinde kaynaklanan çip, uygun ve bu nedenle değiştirilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Etkin C. elegans bireyler etkisiz hale başarılı bir şekilde bir ultra-ince, ıslanabilir PDMS mikrosıvısal çip (solucan levha) kullanarak. Biz Bölüm 3 iletişim kuralında tanımlandığı gibi farklı kapak filmleri solucan levha, sızdırmazlık için uygunluğu araştırdık. Kapak filmleri mühürleme etkilerini değerlendirmek için biz kararlı hayvanlar 3 h hareket cam kullanarak üstünde-küçük parça immobilizasyon sonra (kalınlığı: 130-170 µm), evde beslenen hayvan film (kalınlığı: 125 µm) ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

C. elegans üstünde-küçük parça immobilizasyon ıslanabilir PDMS mikrosıvısal çip kullanarak canlı koşullar altında birden fazla hayvan verimli hedeflenen microbeam ışınlama sağlar. Kullanım ve kurutma önlemek için özellikleri kolaylığı microbeam ışınlama değil sadece, aynı zamanda çeşitli davranış deneyleri içinde bu sistem uygulamaları için uygun hale. Bu solucan çarşafları zaten ticari ve kolayca elde edilebilir. Koku cips gibi geleneksel mikrosıvısal çip hayvan ve yumurta hayvanları toplamak üzere kapalı mikro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Dr. Atsushi Higashitani C. elegans ve Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota ve Yasuhiko Kobayashi tedavisi için değerli tartışmaları ile ilgili olarak tür tavsiye için teşekkür ederiz. Yazarlar Caenorhabditis genetik Merkezi C. elegans ve E. colisuşları sağlamak için teşekkür ederiz. Biz taç cyclotron mürettebatı QST-Takasaki ışınlama deneyleri ile onların tür yardım için teşekkür ederim. Dr Susan Furness bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada kısmen KAKENHI (Grant numaraları JP15K11921 ve JP18K18839) tarafından JSP'ler M.S. için destek verdi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

C. elegansC. elegans
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C. elegans vahşi tip suşCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC), Minnesota, ABDBuçalışmada genellikle kullanılan N2 yabani tip C. elegans suşu
C. elegans UNC-119(e2498) III mutant suşCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC), Minnesota, ABDCB4845C. elegans suşu yalnızca anormal vücut şekline sahip mutantlara örnek olarak kullanılır 
C. elegans transgenik suşu HBR4Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC), Minnesota, ABDHBR4Bu transgenik C. elegans suşunun genotipi HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. Bu suş sadece görüntüleme gözlemi için kullanıldı.
E. coli suşuCaenorhabditis Genetik Merkezi (CGC), Minnesota, ABDOP50E. coli suşu için gıda olarak kullanılan coli suşu
Hyogo, JaponyaBCM17-000125 düz 50/60-&mikro ile mikroakışkan çip; Bu yazıda yer alan tüm deney ve gözlemlerde kullanılan m genişlik kanalları 
Solucan Levha 60Biocosm, Inc., Hyogo, JaponyaBCM18-000120 düz 60 ve mikro ile mikroakışkan çip; m genişliğinde kanallar. Bu, yumurtadan çıktıktan 3-5 gün sonra 20 ° C'de yetişkinler için uygundur.
Solucan Levha 50Biocosm, Inc., Hyogo, JaponyaBCM18-000220 düz 50 ve mikro ile mikroakışkan çip; m genişliğinde kanallar. Bu, siz yetişkinler için uygundur ~ 20 ° C'de yumurtadan çıktıktan ~ 3 gün sonra.
MİKRO KAPAKLI CAMMATSUNAMI CAM SANAYİ LTD. ŞTİ.C030401Kapak camı (kalınlık: 130-170 & mikro; m) Protokol 3
Polistiren FilmBiocosm, Inc., Hyogo, JaponyaBCM18-0001 / BCM18-0002Solucan Tabakalarının Paketlenmiş öğelerinde hareket deneylerinde kullanılır. PS filim (kalınlık: ~ 130 &mikro; m) Protokol 3'te yer alan hareket deneylerinde kullanılır.
Polyester Film LumirrorTORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, JaponyaLumirror T60 (t 125 & mikro; m)PET filim (kalınlık: 125 & mikro; m) Protokol 3
IWAKI 60 mm/işlenmemiş çanakAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japonya'da1010-060Japonya'da C. elegans inüvasyonunda kullanılan işlenmemiş çanak
.1010-035Fransa'da hareket deneylerinde kullanılan işlenmemiş çanak
Ultra saf su
Araştırma Stereo Mikroskop SistemiOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japonyamakaledeki tüm deney ve gözlemlerde kullanılanSZX16
SZX16OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponyaSZX2-ILLBBu, Protokol 3-8'de parlak alan gözlemi için kullanılmıştır.
Objektif Lens (× 1)OLYMPUS ŞİRKETİ, Tokyo, JaponyaSDFPLAPO1 ve kez; PFNA: 0.15; Genişlik: 60 mm. Bu ödünç vermeler, Protokol 3-8'de parlak alan gözlemi için kullanılmıştır.
Objektif Lens (× 2)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponyaSDFPLAPO2XPFCNA: 0.3; Genişlik: 20 mm. Bu  Lends, görüntüleme gözlemleri için kullanıldı.
Cıva Işık KaynağıOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponyaU-LH100HGGeniş emisyon spektrumu, tüm yaygın floroforlar kullanılarak bir dizi floresan görüntüleme deneyinin yürütülmesini sağlar.
SZX16 Floresan filtre ünitesi (YFP için yüksek performans)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JaponyaSZX2-FYFPHQÖrn: 490-500 nm; Em: 510-560. Bu, HBR4 suşunun görüntüleme gözlemi için kullanıldı.
Dijital Fotoğraf Makinesi Yüksek Hızlı EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, JaponyaEX-F1 Şekil 1B, 1E, 1F, Şekil 2A-C ve Video 1 bu dijital kamera kullanılarak elde edilmiştir.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, ABDİstatistiksel analizler için kullanılan Excel Yazılımı
Worm Sheet IR (50/60) için gıda olarak kullanılan , hareket testlerinde kullanılır). Protokol 1 IWAKI 35 mm/işlenmemiş çanak AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Protokol 3 Milli-Q Merck, Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japonya 62020 120 mm x 215 mm; 200 yaprak / kutu WormStuff Solucan Toplama Genesee Scientific Corporation, CA, ABD)59-AWP Platina seçici, almak için özel olarak tasarlanmıştır. Bu Mikroskop için Motorlu Odak Standı

Kaynaklar

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Solucan SayfasMikrohuzme I nlamart Filmi Se imiDavran sal DeneylerFloresan MikroskopiUltra ince ip
Bir Ultra-thin Polydimethylsiloxane mikrosıvısal çip su tutma ile kullanarak canlı Caenorhabditis elegans bireylerin immobilizasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.