Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından

23.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59014

⸱

5 Nisan 2019

 ,  , 
1Department of Neurology and Neuroscience Center, The First Hospital of Jilin University

Bu makalede

Özet

Hücre tabanlı tahlil serum anti-aquaporin-4 immünglobulin G. algılamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir Bu yöntem, klinik tanı ve Nöromyelitis optik spektrum bozuklukları, bilimsel araştırmalar için uygulanabilir.

Özet

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immünoglobulin G (IgG) Nöromyelitis optica spektrum bozuklukları (NMOSD) için temel tanılama biyomarker olduğunu. Hücre tabanlı tahlil (CBA) yüksek duyarlılık ve özgüllük ile insan serumu anti-AQP4 IgG algılamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Kısaca, serum Anti-AQP4 IgG biochip üzerinde sabit o zaman floresein etiketli bir ikincil antikor tarafından tespit AQP4 transfected hücre tarafından ele geçirdi. Floresans mikroskobu Floresans görselleştirmek için kullanılmaktadır ve floresan yoğunluğu en az iki deneyimli klinisyenler tarafından değerlendirilir. NMOSD son tanısı anti-AQP4 IgG algılama sonuçları, klinik bulgular ve neuroradiological bulgular kombinasyonuna göre yapılabilir. Önceki çalışmalara göre daha hassas ve diğer anti-AQP4 IgG algılama yöntemleri daha belirli CBA ve klinik tanı ve NMOSD çalışmaları için uygulanabilir. Yöntemi sınırlamaları vardır; Örneğin, serum anti-AQP4 IgG titreleri değerlendirmek için uluslararası bir ölçüde hala eksik. Burada, insan serumu anti-AQP4 IgG algılama CBA için detaylı bir protokol açıklanmıştır.

Giriş

AQP4 serum IgG Nöromyelitis optica spektrum bozuklukları (NMOSD)1için bir çekirdek tanılama biyomarker olduğunu. Hücre tabanlı tahlil (CBA) yaygın olarak kullanılan anti-AQP4 IgG algılama yüksek duyarlılık ve özgüllük ile yöntemidir. Burada, CBA için detaylı bir protokol tanıttı.

AQP4, bir su kanalı protein altı membran kapsayan birimler bulunmaktadır ve sulu bir çevreleyen iki Helisel etki alanı2gözenek. Anti-AQP4 IgG NMOSD patogenezinde hedefine AQP4, esas olarak astrocytes3endfeet üzerinde bulunan bağlama ile ilgilenmektedir. Bu anti-AQP4 IgG yaklaşık üçte içinde NMOSD hastalar4olumlu gösterilmiştir. En son uluslararası tanı ölçütlerini içinde NMOSD, anti-AQP4 IgG göbek tanılama biyomarker5olarak kabul edilir. Bu bağlamda, insan serumu algılamak için güvenilir bir protokolü kurmak önemlidir anti-AQP4 IgG ve NMOSD klinik tanı kolaylaştırmak.

Şu anda, çeşitli anti-AQP4 IgG algılama yöntemleri CBA, doku tabanlı tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay ve Akış Sitometresi6,7gibi kullanılabilir. CBA anti-AQP4 IgG yakalamak için insan AQP4 ile transfected EU90 hücreleri kullanır. Yakalanan anti-AQP4 IgG floresan ikincil antikorlar tarafından algılanır ve daha sonra mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. Kanıt biriken CBA daha hassas ve diğer anti-AQP4 IgG algılama yöntemleri6,7' den belirli olduğunu göstermiştir. Bir meta-analiz göre duyarlılık ve özgüllük CBA % 76 ve doku tabanlı daha yüksekti % 99 olarak gösterildi ve enzim bağlı immunosorbent6deneyleri. Ayrıca, tanı testleri anti-AQP4 IgG kadınlarında karşılaştırılması yürütülen7yaşındaydım. Toplam 193 eğitim 15 Avrupa tanı merkezleri bir konu vardı7kayıtlı. Dört farklı yöntem serum anti-AQP4 IgG7algılamak için kullanılmıştır. CBA daha hassas ve belirli diğer yöntemleri7' den gösterilmiştir. AQP4 iki büyük izoformlarının (AQP4-M1 ve AQP4 M23) ifade edildiği gibi anti-AQP4 IgG yakalama hücre AQP4-M1 veya AQP4 M23 ile transfected. Ancak, yakalama hücre hangi tip daha iyi tartışmalı kalır. Bir soruşturma AQP4-M1 dayalı desteklenen iken diğerleri AQP4 M23 CBA dayalı belirttiler CBA8olduğunu, daha iyi7,9,10. Ancak, AQP4 M23 esaslı CBA yanlış pozitif belirsiz IgG bağlama8nedeniyle sonuçlar verebilir. Jarius ve ark. 11 AQP4-M1 ve AQP4 M23 esaslı CBAs arasında anlamlı bir fark anti-AQP4 IgG algılama oranları olduğunu bildirdi.

İçinde Özet, serum anti-AQP4 IgG NMOSD için bir çekirdek biyomarker olduğunu. CBA daha yüksek özgüllük ve diğer anti-AQP4 IgG algılama yöntemleri daha duyarlılık vardır. AQP4-M1 veya AQP4 M23-tabanlı CBA iyidir tartışmalı kalır. Bu makalede, AQP4 M1-tabanlı CBA için detaylı bir protokol, klinik tanı ve NMOSD çalışmaları için uygulayabileceğiniz açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu yordamı Jilin ilk hastane Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi ve yaklaşık 1500 konularda gerçekleştirildi.

1. hasta kayıt ve kan örnek koleksiyonu

  1. Anti-AQP4 IgG Şef şikayet ve belirtiler klinik hastaları için aşağıda listelenen serum laboratuvar tespiti uygulanır. Fiziksel muayene de gerçekleştirmek.

    Optik nörite: hastaların acı kaybı visual alanlarının ve görme keskinliği azaltma gibi görsel açıkları ile.
    Akut miyelit: hasta felç, duyusal açıkları ve otonomik disfonksiyon ile mevcut.
    Alan postrema sendromu: hastaların açıklanamayan hıçkırık, bulantı veya kusma belirtileri olabilir.
    Akut beyin sapı sendromu: beyin sapı lezyonları sonucu farklı semptom ve fizik bulguları lezyonlar yere bağlı olarak.
    Semptomatik Narkolepsi veya NMOSD tipik diencephalic Mr lezyonları ile akut diencephalic klinik sendrom.
    NMOSD tipik beyin lezyonlar ile semptomatik serebral sendromu.

    Not: Hastanın serum anti-AQP4 ise uluslararası bir fikir birliği tanı ölçütlerini göre NMOSD5, NMOSD tanısı yapılabilir IgG pozitif ve sahip en az bir çekirdek klinik özellikleri yukarıda bahsedilen. Ancak, biz anti-AQP4 IgG hastalarda optik nörite yalnızca test tavsiye etmiyoruz.
  2. Kan örneği koleksiyonu
    Not:     hastalarda açlık olması gerekmez.
    1. 2-3 mL Venöz kan bir 4 mL vakumlu kan toplama tüp çizmek.
    2. (RT) oda sıcaklığında 30 dakika pıhtısı serum izin.
      Not: Uzun süreli pıhtılaşma trombosit gelen sızıntı nedeniyle serum düzeyleri artırabilir.
    3. 5 dakika süreyle santrifüj 2100 x g de dikkatli bir şekilde yeni bir tüp serum aktarın.
    4. Hemen serum veya aliquot analiz ve mağaza -20 veya-80 ° C.
      Not: -80 ° C yıl depolanması için depolama-20 ° C'de ay, depolama için ise.

2. anti-AQP4 antikor algılama

Uyarı: Hasta numuneleri ve kullanılan seti Kimyasalları bulaşıcı malzemeler kabul. Sodyum azid içeren reaktifler seti zehirlidir. İletişim kuralının akış şeması şekil 1' de verilmiştir.

  1. Hazırlık
    1. Belgili tanımlık teçhizat RT için kullanmadan önce getir.
      Not: Mağaza 2-8 ° C'de kiti
    2. En az 200 mL % 0,2 içeren PBS yıkama arabelleği hazırlamak ara 20. Yıkama arabelleği 100 mL, 500 mL kabı dökün.
    3. Seyreltik serum örnekleri yıkama arabelleği ile 10 x. Dağıtımcı talimatları doğrultusunda pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın.
  2. Örnek kuluçka
    1. Önceden seyreltilmiş örnekleri, olumlu denetim veya negatif kontrol 30 µL reaktif tepsi (Şekil 2) reaksiyon alanları ekleyin.
      Not: Hava kabarcıkları kaçının.
    2. Biochip slaytlar üzerindeki koruyucu kapağı çıkarın.
      Not: Dekolmanı ve sabit hücre kontaminasyonu önlemek için biochips dokunmayın. Slayt yan yana Kapaðý çýkarmadan önce tutun.
    3. Biochip slayt reaktif tepsi (Şekil 2) uygulanır. RT, bir 30 dk kuluçka başlatmak
      Not: Her örnek için karşılık gelen biochip diğer damlacıkları ile karıştırma olmadan bağlı bireysel bir damlacık olmalıdır.
    4. Yavaşça biochip slaytla bir kez yıkama arabellek durulayın. Biochip slayt yıkama arabellek en az 5 dk. yer kabı bir shaker mümkünse üzerinde 100 mL dolu 500 mL kabı içine bırakın.
    5. Yıkama arabellek biochip slayttan dışarı çıkar. Dikkatlice uzakta bir kağıt havlu ile reaksiyon alanları dışında kalan yıkama arabellek silin. 1-2 dk tepki alan üzerinde kalan yıkama arabellek buharlaşır için açık havada biochip slayt maruz.
      Not: Reaksiyon alanları kuru değil. Kağıt havlu ile biochips dokunmayın.
  3. İkincil antikor kuluçka
    1. İkincil antikor çözüm dağıtımcı talimatları doğrultusunda hazırlamak.
    2. İkincil floresan antikor 25 µL temiz reaktif tepsi reaksiyon alanları ekleyebilirsiniz.
    3. Biochip slayt yüklü ile ikincil Antikor Reaktif tepsi uygulanır. 30 dk RT. az için kuluçkaya
  4. Montaj
    1. El yıkama arabellek dökmek ve taze yıkama arabellek 100 mL kabı ekleyin. Çamaşır 2.2.4 ve 2.2.5 adımlarda açıklandığı gibi tekrarlayın.
    2. Dikkatle gömme orta biochip slayttaki (tepki alan başına bir damla) reaksiyon alanları ekleyin. Biochip slayt bir cam parçası ile kapatın. Hava kabarcıkları kaçının.
  5. Floresans algılama
    1. Floresan lamba mikroskop ve 15 dk. Seç 488 nm filtre öncesi ısı açın.
    2. Açık fotoğraf yazılım. Transfected ve untransfected alanları farklı büyüklüklerde ile tüm reaksiyon alanların fotoğraf çekmek. İlk olarak, genel bir bakış için 4 x büyütme ile bir resim çekmek, sonra 10 x ve 20 x büyütme ile daha fazla fotoğraf çekmek.
      Not: Detaylı iletişim kuralı Tablo 1' de gösterilen. Sonuçların yorumlanması temsilcisi sonuçları bölümünde ele alınmıştır.

3. hastaların tanı

  1. Hastanın serum anti-AQP4 ise IgG pozitif ve NMOSD en az bir çekirdek klinik özelliği gösterir (tartışma bölümüne bakın), NMSOD5hastaya teşhis. Hasta anti-AQP4 ise ancak, IgG negatif, NMOSD tanısı atlanabilir değil.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan yordamı kullanarak, belirli anti-AQP4 IgG Serumda saptanabilir. İşlem sırasında önceden seyreltilmiş örnekleri, olumlu bir kontrol ve bir negatif kontrol transfected ve untransfected alanları (Şekil 2) içeren reaksiyon alanları için eklenmiştir. Floresan transfected bir alanda olumsuz denetiminin esas olarak biochips (şekil 3) transfected hücrelerine ikincil antikor belirsiz bağlama belirtti. Homojen zayıf Flores...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Anti-AQP4 IgG insan serumu algılamak için yaygın olarak erişilebilir bir yöntemi anlatmıştık. Anti-AQP4 IgG NMOSD için yakından ilgilidir ve güvenilir anti-AQP4 IgG algılama yöntemi kurulması NMOSD klinik tanısı için çok önemlidir. İlk olarak, anti-AQP4 IgG NMOSD için özeldir. Multipl skleroz da bir immün aracılı hastalığı merkezi sinir sisteminin ve NMOSD12ile büyük benzerlikler paylaşmaktadır. Ancak, anti-AQP4 IgG sadece NMOSD13' te pozitiftir. İkinci olarak, anti-AQP4 Ig...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar için destek hibe Ulusal Bilim Vakfı Çin (No. 31600820), sağlık ve Jilin Province, aile planlaması Komisyonu (Hayır 2016Q036) ve bilim ve teknoloji planlama projesi, Jilin eyaletinde (No dan minnettarız 20180520110JH).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-aquaporin-4 IIFTEuroimmunFA 1128-2005-50AQP4-M1 transfekte edilmiş ve transfekte edilmemiş EU 90 hücreleri ile kaplanmış biyoçip slaytları, floresein etiketli anti-insan IgG, pozitif kontrol olarak anti-AQP4 antikoru, antikor negatif numune, PBS pH 7.2, Tween 20 için tuz ve gömme ortam içerir.
CellSens DimensionOLYMPUSN/Afotoğraf yazılımı
Jel ve pıhtı aktivatör tüpüTıbbi 623040202 iyileştirinYerel bir Çinli şirketten

Kaynaklar

  1. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).
  2. Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).
  3. Takeshita, Y., et al. Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro. in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).
  4. Sato, D. K., et al. Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders. Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).
  5. Wingerchuk, D. M., et al. International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders. Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).
  6. Ruiz-Gaviria, R., et al. Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).
  7. Waters, P., et al. Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).
  8. Fryer, J. P., et al. AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).
  9. Long, Y., et al. Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China. The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).
  10. Pisani, F., et al. Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity. PloS One. 8 (11), 79185(2013).
  11. Jarius, S., et al. Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate. Journal of Neuroinflammation. 11, 129(2014).
  12. Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).
  13. Chen, H., et al. Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders. Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).
  14. Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 3 (3), 231(2016).
  15. Jarius, S., et al. Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance. Journal of Neuroinflammation. 7, 52(2010).
  16. Asgari, N., et al. Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (4), 343(2017).
  17. Kim, H. J., et al. MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update. Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).
  18. Jarius, S., et al. MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134(2018).
  19. Narayan, R., et al. MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).
  20. Ogawa, R., et al. MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322(2017).
  21. Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317(2016).
  22. Kessler, R. A., et al. Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).
  23. Mealy, M. A., et al. Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders. Multiple Sclerosis. , (2017).
  24. Yang, Y., et al. The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica. Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).
  25. Kitley, J., et al. Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan. Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Anti-AQP4 IgGnöromyelitis optikafloresan mikroskobiserum tespitiAQP4 transfekte edilmiş hücrelersekonder antikorPBS yıkama tamponubiyochip lamıdiyagnostik biyobelirteç
İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.