Adrenal korteks tarafından salgılanan hormon stres ve hastalıklara karşı hayvanlar için hayati önem taşımaktadır. Burada, adrenal hücreler kültür birincil fare için bir iletişim kuralı mevcut. Adrenal steroidogenesis ve lipit sentezi ilgi reaktif mekanizmalarının araştırılması için iyi bir tüp bebek platform olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür
Bu makalede
Özet
Özet
Adrenal korteks salgılar hormon stres ve hastalıklara karşı hayvanlar için hayati önem taşımaktadır. Burada açıklanan yordam birincil kültürlü sıçan adrenal hücrelerin ve ilgili fonksiyonel deneyleri (ayirt corticosterone analiz yanı sıra lipit damlacık yüzey proteini boyama) yöntemidir. İçinde vivo bir model, aksine interexperiments adrenal monolayer kültürlerde varyasyonu daha az ve deneysel durumu kontrol etmek kolaydır. Ayrıca, kaynağın Rats'in da daha sığır olanlar gibi diğer hayvanların daha kararlıdır. Aynı zamanda adrenal çalışmalarda kullanılan birçok insan adrenal hücre satır (ncı-H295, ncı-H295R, SW13, vb) vardır. Ancak, bu satırları steroid üretimi hala serum lot numarası, geçiş numarası, mutant/zarar farklı genler, vb içeren birçok faktör tarafından etkilenir. 17α-hidroksilaz eksik dışında birincil fare Adrenokortikal hücre adrenal Fizyoloji için daha iyi ve daha uygun bir yüntem kültürdür. Özet olarak, birincil fare adrenal kültürleri iyi bir tüp bebek platform mekanizmaları böbreküstü bezi sistemi ilgi reaktif araştırmak araştırmacılar için olabilir.
Giriş
Endokrin sistemi fizyolojik faaliyetleri ve homeostasis1düzenleyen sorumludur. Böbreküstü bezleri böbrekler kafatası kutbunda yer alan mineralocorticoids, glukokortikoid ve androjen2,3salgılar önemli endokrin organ biridir. Böbreküstü bezinin iki ayrı parçadan oluşur: korteks ve medulla. Adrenal korteks üç katmandan oluşur: dış glomerulosa, ara fasciculata ve iç reticularis3. Zona glomerulosa aldosteron, sodyum iyon ve su böbrekler3reabsorbing AIDS bir mineralocorticoid orijinal secreting sitedir. Zona fasciculata öncelikle glukokortikoid normal fizyolojik şartlarda3Bazal bir seviyede üretir. Kortikosteroidler rodents ve kortizol insanlarda kan glikoz3düzenleyerek vücudun stres ile başa çıkma yardımcı olan hareket. Bir dereceye kadar onlar inflamatuar yanıt inhibe ve bağışıklık sistemi4,5düzenler. Diğer memeliler, fare ve sıçanların aksine bir işlevsel zona reticularis 17α-hidroksilaz ifade eksikliği nedeniyle böbrek üstü bezi6,7' var mı. Böylece, adrenal fareler ve sıçanlar adrenal C-19 steroidler (kortizol ve adrenalin androjenler) salgılanmasını yoksun bulunmaktadır.
Birincil kültürlü Adrenokortikal hücreler adrenal Fizyoloji8kontrol mekanizmaları araştıran için yararlı olduğu gösterilmiştir. Steroidogenic diğer dokular gibi adrenal her bölge kendi steroid ücretsiz kolesterol9sentezler. Adrenocorticotropic hormon (ACTH) stimülasyon, üzerine ücretsiz kolesterol arıza lipid damlacıkları serbest bırakmak ve böylece, steroid üretim fasciculata ve reticularis10artırır.
Birçok grup Adrenokortikal Karsinom istikrarlı hücre satırlarından kurmaya çalıştılar. Ancak, birkaç endişeleri Adrenokortikal hücre hatları vitro modelleri8olduğu gibi kullanımı sınırlı olabilir. Hücre hatları steroid yanıt pasajlar, serum lot numarası ve serum kalitesi arasında farklı olabilir. Ayrıca, ticari adrenal hücre hatları (Y1 ve SW13) corticosterone, adrenal steroidogenesis8çalışmaya daha zor hale salgılar değil. Düz-se bile bu pazarlara dokulardan bilinmeyen bazı riskler belirsiz sığır ve at adrenal kullanarak ex vivo modelleri iyi bir seçim olabilir. Onlara göre sıçan böbrek üstü bezleri yönetmek daha kolaydır ve nispeten daha istikrarlı ve patojen ücretsiz kaynağıdır. Birlikte ele alındığında, burada mevcut olan yöntemi sıçan adrenal fasciculata hücre corticosterone sentezinde ilgili mekanizması araştırmak için kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaohsiung Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. deneysel bir işlem
- Yetişkin (8-12 haftalık) kadın/erkek SD fareler CO2 ötenazi tarafından kurban.
- % 70 etanol uygulamak ve cilt içine emilir ve kağıt mendil ile cildinizi silin sağlar.
- Sırtüstü pozisyonda temiz plastik tabakta sıçan koymak.
- Orta çizgi, "dış" kavisli Forseps ile cilt kaldırın ve "Y" şekil (subcostal açıyla kalça seviyesinden) oluşturarak bir künt diseksiyon gerçekleştirmek.
- Makas % 70 etanol ile durulayın ve sonra aynı zamanda bir "Y" şekil oluşturma kas kesti.
-
Mide arkasında sol böbreküstü bezi bul.
Not: sağ böbrek üstü derinden karaciğer bulunabilir.- Bir çift forseps mide veya karaciğer Asansör ve adrenal başka bir eğri Forseps ile ayırmak için kullanın.
- Böbreküstü bezleri steril bir tabak içine koyarak sonra iyi Forseps ile adrenal kapsül dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Makas hassas çifti ile adrenal biraz küçük parçalar halinde kesip serum-Alerjik Dulbecco bit'ın modifiye kartal orta (DMEM) / F-12 orta.
-
Üç farklı gözenek ölçekli Pasteur pipets hazırlamak ve adrenal taşlarını collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL) ile orta içeren bir 50 mL konik tüp içine Aspire edin için ilk Pasteur damlalıklı kullanın.
- Yavaşça doku parçaları 10 x hakkında triturate. Pipets kullanabilir ve tüm parçaları daha küçük olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın.
Not: Pasteur pipets farklı gözenek boyutları ateşle Isıtma tarafından oluşturulabilir. İlk damlalıklı özgün boyutu (yaklaşık 1 mm) ikinci bir gözenek boyutu yaklaşık 0.8 mm ve üçüncü Pasteur damlalıklı yaklaşık 0.5 mm. Sindirim sırasında böbrek üstü parçaları daha küçük olacak. Böylece, mekanik yordamın daha tamamlanmış adrenal sindirmek. Su banyosu (37 ° C'de) tüp kuluçkaya ve her 5 dk, salla toplam 4 x.
- Yavaşça doku parçaları 10 x hakkında triturate. Pipets kullanabilir ve tüm parçaları daha küçük olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın.
- 20 dk kuluçka sonra serin ve taze orta (sixfold birimi; Örneğin, doku 5 mL + 25 mL serin DMEM/F-12 orta) içeren % 2.5 fetal sığır serum (FBS) ve % 5 at serum enzim etkisi durdurmak için ekleyin.
- Santrifüjü vasıl 800 x g 10 dk tarafından hücre topakları toplamak.
- Orta hücreleri askıya almak için uygun bir hacmi ekleyin.
Not: Her bezi yaklaşık 3 ~ x 10 yapabilirsiniz5 ~ 4 x 105 hücreleri. - İstenen plakaları veya yemekleri hücrelerde büyüme orta ile plaka (1:1 [v/v] karışımı F-12 orta, DMEM ve Ham'ın takıma 25 mM HEPES ve % 1 penisilin ve streptomisin) % 95 hava ve % 5 CO2oksijen bir ortamda 37 ° c gece (0 gün).
Not: Genellikle, biz 24-şey tabak (dört bezleri/plaka) hücrelerde corticosterone tahlil için plaka ve 35 mm yemekleri (yemekler bir bezi/yaklaşık 1-2) için tıklayın: western analiz leke.. - Dikkatli bir şekilde hücreleri 2 yıkama x ile serum ücretsiz sıcak DMEM/F-12 orta (gün 1). Yeni büyüme orta yerine.
- Hücreleri oksijen ortamında % 95 hava ve % 5 CO2 37 ° C'de 3 güne kadar korumak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan yordamı kullanarak, birincil kültürlü adrenal hücreleri (şekil 1A) faz kontrast mikroskop altında seçkin. Daha fazla veziküller içinde sitoplazma lipid damlacıkları olduğunu doğrulamak için ayirt adipose farklılaşma ile ilgili protein (ADRP) Boyama gün-3 kültürler (şekil 1B) yürütülen. Hücreleri üzerinde cam coverslips yetiştirilmiştir. Hücreler fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkanmış ve % 4 paraformaldehyd...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Böbreküstü bezleri çevresel adaptasyon3' te önemli bir rol oynar. Hangi tarafından adrenal korteks salgılar hormon düzenleyen ve fizyolojik fonksiyonları ve homeostasis3ayarlayın. İçinde vivo modeli gerçek fizyolojik etkileri vücuttaki yansıtır. Ancak, o hala kararsız etkileri deneylerde neden birçok karmaşık faktörlerden etkilenir. Buna ek olarak, in vitro hücre modeli hayvan modeli için eşsiz kılan avantajları vardır. İlk olarak, çevre koşulu tüp bebek sisteminde kontrol ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser Ulusal Bilim Konseyi Tayvan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) ve bir ulusal Cheng-Kung Üniversitesi Hastanesi araştırma bursu (NCKUH-10102045) bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dişi/erkek, SD/Wistar sıçanları (8-12 hafta) | BioLASCO | erkek veya dişi sıçanlar deneyler için uygundur. Dişilerin adrenal bezleri erkek sıçanlardan daha büyüktür, ancak dişi sıçanlar deneyleri etkileyebilecek östrus döngülerine sahiptir | |
| Kollajenaz, tip II | Sigma | C-6885 | adrenal hücrelerin izolasyonu |
| Adrenal hücreler için DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | toz besiyeri Böbreküstü |
| Jambon F12 | ThermoFisher | 21700-075 | toz besiyeri |
| HEPES | JT.baker | 4018 | tampon (toz) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| At serumu | Hiklon | 16050014 | |
| Fetal sığır serumu | SAFC | 12103C | |
| Penisilin (10.000 U)-streptomisin (10.000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiyotikler |
| Kavisli forseps | BRAUN | BD343R | |
| Forseps | BRAUN | BD331R | |
| Makas | BRAUN | BC224R | sıçan derisi ve kası kesti |
| Hassas makas | BRAUN | BC101R | kesilmiş adrenal bezler |
| Yağ farklılaşması ile ilgili protein | Abcam | ab108323 | lipid damlacığı ile ilişkili protein için antikor |
| Kortikosteron ELISA kiti | cayman | 500655 | kortikosteron sentezi için test |
| Ters çevrilmiş ışık mikroskobu | Leica | ||
| Floresan mikroskobu | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | immünofloresan boyama için |
| Keçi anti-tavşan IgG Alexa 488 Fluor ikincil antikor | İmmünofloresan boyama | ||
| için ThermoFisher A-11034 | İmmünofloresan boyama için | Abcam | 108323 |
| boyama için | ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 |
Kaynaklar
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24(2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
