İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

Seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz her nükleotit bir RNA dizisinin ilgi içinde kinetik ölçme ve tek nükleotid çözünürlük¹ikincil yapı elucidating bir yöntemdir. Şekil metodolojileri, tüp bebek koşulları^2,3,4 (arıtılmış RNA içinde tanımlanmış arabellek sistem) her ikisi de ve içinde yaşayan memeli hücreleri^5,6, ikincil araştırmak için geliştirilmiştir Orta uzunlukta RNA dizilerinin yapısı (genellikle < hücre içi şekil için 1.000 nukleotid ve < tüp bebek şekil için 200 nukleotid). Bağlama küçük molekül metabolitleri^2,4,7,8 RNA etkileşim üzerine reseptör RNA yapısal değişiklikler değerlendirmek ve mekanik eylemler Çalışmaya özellikle yararlıdır hedefleme-RNA molekülleri sırasında ilaç geliştirme^9,10.

İlaç keşif RNA hedefleme son zamanlarda ilgi gibi akademik laboratuvarları ve ilaç endüstrisi^11,12 farklı yaklaşımlar ve stratejileri^{13,14,15 çekti ,16}. Son RNA hedefleme küçük moleküller klinik kullanım için iki yapısal olarak farklı deneysel ilaç, LMI-070¹⁷ ve RG-7916^18,19, umut verici gösterdi kas spinal atrofisi (SMA), için örnekler Aşama II klinik çalışmalar²⁰sonuçlarında. Her iki moleküller vardı motor nöron (SMN) hedef yaşama 2 pre-mRNA gösterdi ve Tutkallama işleminin SMN2 gen^6,17,21düzenler. Biz daha önce vitro ve hedef RNA yapısal değişiklikler RG-7916 SMN-C2⁶bilinen bir analog huzurunda incelenmesi şeklinde hücre içi uygulama gösterdi.

Prensip olarak, şekil tarafsız bir şekilde her nükleotit bir kendi kendine su verme asilasyonu reaktif aşırı miktarda huzurunda bir RNA dizisinin 2'-OH asilasyonu oranını ölçer. Asilasyonu reaktif su kısa bir yarı ömrü ile kararlı değil (örneğin, T_1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhidrit; veya 1 M 7, 2-methylnicotinic asit imidazolide ~ 20 dakika veya NAI)²² ve duyarsızlık kimliğine üsleri²³. Her nükleotit dinamiklerini doğru bir değerlendirme dönüştürülebilir esnek bazlar 2'-OH grupları daha uygun bir asilasyonu sonuçlanır. Özellikle, bir nükleotid baz çifti içinde genellikle daha az reaktif NAI ve 1 M 7 gibi bir 2'-OH değiştirme reaktif için unpaired bir tane daha.

RNA şablonu ve nereye 2'-OH asilasyonu gerçekleşir kaynak bakarak, şekil genellikle tüp bebek ve hücre içi şekle kategorilere ayrılabilir. Vitro şekli kullanır saf T7 RNA transkripsiyonu ve Deneysel tasarımlar hücresel bir bağlamda yoksun. Hücre içi şeklinde RNA şablon transkripsiyon ve 2'-OH asilasyonu canlı hücreler içinde oluşur; Bu nedenle, sonuçlar RNA yapısal modeli hücresel bir bağlamda özetlemek. Hücre içi şekil için şekil vivo olduğu gibi edebiyat²⁴canlı hücrelerde taşınan şekil için anılır olmuştur. Beri bu deney bir hayvan gerçekleştirilmez, doğruluk için hücre içi şekil olarak bu deneme olarak.

Tüp bebek ve hücre içi şekli astar uzantısı aşaması için stratejiler de farklıdır. Tüp bebek şeklinde Ters transkripsiyon huzurunda Mg^{2 +}2'-OH asilasyonu konumunda durur. ³²P-etiketli astar uzantısı bu nedenle bir grupta polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) olarak görünür ve grup yoğunluğunu asilasyonu oranı¹' e orantılıdır. Hücre içi şeklinde Ters transkripsiyon 2'-OH, rastgele mutasyonlar oluşturur pozisyon huzurunda Mn^{2 +}sigara. Her nükleotit mutational oranı tarafından derinlik yeni nesil sıralama içinde yakalanabilir ve şekil reaktivite tek nükleotid çözünürlükte sonra hesaplanabilir.

Düşük sinyal-gürültü oranı hücre içi şekil için potansiyel sorun (değiştirilmemiş dizileri yeni nesil sıralama okuma çoğunu işgal yani, 2'-OH grupları çoğunluğu değiştirilmemiş, ise). Son zamanlarda, bir yöntem 2'-OH zenginleştirmek için RNA değiştiren, vivo olduğu gibi şekli (icSHAPE)'yi anılacaktır, Chang laboratuvar²⁵tarafından geliştirilmiştir. Bu zenginleştirme yöntemi RNA etkileşimleri, özellikle transcriptome çapında sorgulama gibi zayıf küçük moleküller okumak avantajlı olabilir.

1 vitro şekil.

Not: Protokol¹yayımlanmış iletişim kuralı değiştirilir.

1. RNA şablon hazırlama
   Not: T7 transkripsiyon için şablon olarak sentetik çift DNA (dsDNA) iplikçikli ve EcoRI/BamHI kısıtlama endonükleaz siteleri, PCR tarafından veya pET28a gibi benzersiz bir çifti taşıyan bir E. coli vektör içine her iki ekleme tarafından güçlendirilmiş emri verildi. PCR güçlendirme için protokol aşağıda gösterilmektedir.
   1. Aşağıdaki malzeme karışımı: 50 μL PCR Master mix (bkz. Tablo reçetesi) 2 μL 10 mikron her astar için (bkz. Tablo 1 için serileri), 200 ng dsDNA şablonunun 2 μL ve dimetil sülfoksit (DMSO) 3 μL ve H₂iki PCR içine O. Aliquot 41 μL tüpler (50 μL tepki karışımı her tüp içerir).
   2. Termal cycler kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 1) 95 ° C 30 sahne s; Aşama 2) 20 95 ° C s; sahne 3) 56 ° C 20 s; Aşama 4) 20 72 ° C s; 5. aşama) döngü geri sahne 2 30 döngüleri için; Sahne 6) 72 ° C 3 dakika; ve Etap 7) aşağıdaki adım kadar 4 ° C'de tutan sonsuz.
   3. PCR amplicon jel dilimleri çıkarma tarafından arındırmak ( Tablo malzemeleri görmek ve üreticinin iletişim kuralı kullanın). Tris-EDTA (TE) arabelleği, 10 mM Tris (pH 8.0) içeren 35 μL ürünüyle DNA elute ve 1 mM EDTA 0.1 – 0.5 vermeye, μg/μL şablonu. Saf DNA şablon 0.10 μg/μL normalleştirmek.
      Not: İsteğe bağlı olarak, şablon kalitesini % 1,8 özel jel elektroforez ile DNA'ın 0.10 μg üzerinde analiz. İstediğiniz şablon DNA'ın tek bir bant üzerinde jel bekleniyor.
   4. T7 transkripsiyon tepki (Toplam hacim 40 μL) kadar küme PCR tüp içine aşağıdaki belgeleri ekleyerek: 10 tepki arabellek, ATP, CTP, GTP, UTP, 4 μL T7 enzim 4 μL 4 μL 4 μL 4 μL x 4 μL ( Tablo malzemelerigörmek) , Saf PCR amplicon adım 1.1.3 (0.4 μg) 4 μL ve dietil pyrocarbonate (DEPC) 12 μL-tedavi su. Yukarı ve aşağı 4 x pipetting karıştırın. 4-16 h termal cycler veya 37 ° C kuluçka için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: 1.1.4. adımda reaksiyon devam eden ise adım 1.1.6 başlamadan.
   5. DNaz 2 μL ekleyin, karıştırın yukarı ve aşağı 4 x pipetting tarafından ve 15 dk. Mix 2 eşit hacmi ile 37 ° C'de kuluçkaya Tris-bor-EDTA (TBE) x-üre örnek arabellek ( Tablo malzemelerigörmek). Devre dışı bırakabilirsiniz için 3 dakika için 70 ° C'de ısı.
   6. 75 mL % 40 akrilamid/bisacrylamide çözeltisi RNase free bir şişede karıştırın (29:1, Tablo malzemelerigörmek), üre, 180.2 g ve 10 x TBE arabellek (RNase içermeyen, bkz: Malzemeler tablo) 50 mL. Üre bütün kristalleri çözünene kadar şişe bir orbital çalkalayıcı (250 devir/dakika) koymak (en fazla 2 saat sürebilir). 500 ml su DEPC tedavi ile ses düzeyini ayarlayın. 0,2 mikron membran ile çözüm filtre ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Bu süreçte önlemek aynasal kullanarak ve heyecan-bar RNase kontaminasyonu önlemek için. Çözüm için ilâ 1 yıl 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
   7. İki Elektroforez cam tabak uygun boyutta (16,5 cm x 24 cm) deiyonize su ve % 70 ile temiz kağıdı silerek bir parça kullanılarak alkol. Plakayı 2.0 mm mesafe tutucular (siliconized bir yüzey ile plaka içe dönük) bir çift ile hizalamak ve kenar bandı ile plakaların mühür. Çift-teyp sızıntı önlemek için plaka köşesinde.
   8. Bir ölçek akrilamid eriyik--dan adım 1.1.6, 2.0 mL % 10 amonyum Persülfat çözeltisi ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 100 μL 200 mL RNase free pipet ucu ile karıştırma 30 s. Tilt için hızla tarafından biteviye-in benchtop kapak tabaklarda mix ve dökün Plakayı boşluk çözümden. Herhangi bir kabarcıklar Asansör ve plaka düz benchtop kapağına koymak için plaka dokunun. Hemen tarak takın ve en az 1 h için polimerize jel izin.
      Not: Jel içinde ertesi gün kullanılacak ise, bir parça ıslak kağıt havlu ve şal ile jel üst plastik wrap daha büyük bir parça ile ört. Yer o düz 4 ° C'de yalan
   9. Bandı çıkarın ve plaka bir elektroforez tribünde kelepçe. Tarak kaldırın ve üst ve alt baraj gölünün yeterli 1 x TBE arabellek ekleyin. Jel 30 dk 20 W. Önceden çalıştırın
      Not: İsteğe bağlı olarak, istenen RNA içeriği % ~ 90 veya daha fazla ise, mini bir jel bir partiye hazırlık jel ikame kullanılabilir.
   10. Her yükleme Wells pipetting tarafından yukarı ve aşağı iki kez rezervuar sıvı ile yıkayın. Ham RNA--dan adım 1.1.5 kuyu içine ekleyin. Ksilen cyanol FF boya (açık mavi) jel'ın uzunluğu (~ 60 dk) yaklaşık üçte geçene kadar jel 20 W çalıştırın.
       Not: Kuyu yüksekliği en fazla üçte birini yüklemek için emin olun (gerekirse, birden çok kuyu kullanın).
   11. 1 x TBE tampon 1:10,000 seyreltme güvenli ile jel sokmak için jel büyük bir kapta ( Tablo malzemelerigörmek) boya. Kapsayıcı bir orbital çalkalayıcı 80 rpm'de 5 min için koymak.
   12. UV ışık altında istenen RNA grubu tanımlamak ve hızla temiz bir jilet kullanarak jel ince bir bant kesme. 1-2 jel dilimleri bir 1.7 mL tüp içinde yerleştirin.
   13. RNA tarafından pasif elüsyon jel dilimden kurtarmak. Her tüp için yeterli elüsyon/yağış karıştırmak (dilim başına ~0.3 mL) ekleyin: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2.5 M LiCl, 1 mM EDTA, % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) suda DEPC tedavi. 16 h için 4 ° C'de jel splice(s) içeren tüp döndürün.
       Not: Bu adımda % ~ 75 tipik kurtarma oranıdır. Verimi artırmak için kaldırmak ve eluent toplamak ve elüsyon arabellek aynı birim eklemek, sonra bu adımı yineleyin.
   14. Eluent yeni bir 1,7 mL tüp birleştirin. Tüpler altı kez sıvı karışımı ters çevir ve tüpler için en az 1 h-80 ° C'de yer 2.5 x buz gibi alkol ekleyin.
   15. 10.000 x g ve 4 ° c ' 10 dk santrifüj Dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. % 80'i ekleyerek RNA Pelet yıkama alkol (1 mL tüp başına), 15 s ve 10.000 x g ve 4 ° c ' 10 dk santrifüj için girdap
   16. Süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı 10 kez pipetting 5 dk. 50 ekleyin μL RNase free su ve karışımı için RNA Pelet kuruması. RNA konsantrasyon için 0,10 μg/μL normalleştirmek. Arıtılmış RNA-80 ° C'de depolayın
       Not: RNA Pelet aşırı kuru değil.
   17. İsteğe bağlı olarak, RNA kalitesini analiz etmek için 1 μL seyreltik (100 ng) kimden adım 1.1.16 5 μL su ve karışımı ile 2 x TBE-üre örnek arabelleği 5 μL RNA'ın. Sonra ısı 3 dk ve % 6 TBE-üre mini jel üzerindeki yükü için 70 ° c.
       1. Jel 180 V 1 h. gerçekleştirmek için adım 1.1.11 yapılır gibi boyama çalıştırın. UV jel bir görüntüleme sistemi görselleştirin. Tek bir bant istenilen uzunluğa bekleniyor.
2. ³²P olarak etiketlenmiş astar hazırlama
   1. Ardından Malzemeler karıştırılarak tepki kadar ayarla: 10 μL γ -³²P-ATP (~1.5 MCI, ~ 25 mikron, Malzemeler tablobakınız), 2 μL ters Transkripsiyon (RT) astar (sıra bkz: Tablo 1için 100 mikron), 10 x T4 polinükleotit kinaz (PNK) 2 μL reaksiyon tampon, T4 PNK 1 μL (bkz. Tablo reçetesi) ve 5 μL RNase free su. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Uyarı: Uygun koruma adımları 1.2-1.5 radyoaktif malzemeler için yetkili bir işyerinde için ihtiyaç vardır.
   2. 65 ° C'de 20 dk için ısı devre dışı bırakma 2 x TBE-üre örnek arabellek 25 μL ile eluent 1 dk. karıştırmak için bir sütun desalting ve santrifüj üzerine örnekleri de 1000 x g ekleyin. .
      Not: Eğer değil hemen saf için etiketli ham ürün-20 ° C'de depolayın.
   3. 20 W 1 h için % 10 akrilamid jel çalıştırın.
      Uyarı: Adım 1.2.1 jel üzerine ³²P olarak etiketlenmiş astar yüklemek ve radyoaktivite üst rezervuar içine kanama önlemek. Jel üzerinde ince bir bant sağlamak için kuyu yüksekliği fazla üçte biri yük değil (gerekirse, birden çok kuyu kullanın). Sıvı alt rezervuar içinde yüksek oranda radyoaktif olabilir.
   4. Cam plakanın jel kaset kaldırmak ve jel plastik wrap bir parçası üzerinde yatıyordu. Hava geçirmez bir sandviç yapmak için jel üst kapak için plastik wrap katlayın. Jel sandviç kalsiyum tungstate fosfor ekrana koyun ve görüntüleme bir aletle bulaşmasına neden. Jel ile jel kenarlarını nerede olduğunu bilmek tekrar normal ışık görüntü.
   5. İki görüntü bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Yazdırılan görüntünün üzerine jel hizalayın. İstenen grup jel dışarı kesmek için taze bir jilet kullanın. 1-2 jel dilimleri bir 1.7 mL tüp içinde yerleştirin.
      Not: Yazdırılan görüntünün gerçek jel aynı boyutta olduğundan emin olun. Çift hizalamayı jel dilim kesmek sonra tekrar artık jel görüntüleme tarafından kontrol edin.
   6. ³²P olarak etiketlenmiş astar aşağıdaki adımlarla 1.1.13 1.1.16 kurtarmak. Çözüm 1.0 μL 0.4 mL tüp içine alın ve 1 x TE arabellek 1.0 μL ~ 100.000 BGBM, radyoaktivite almak için astar sulandırmak. Arıtılmış ³²P olarak etiketlenmiş astar-80 ° C'de RNA 2'-OH değişiklik tepki kadar ama en fazla 4 hafta için saklayın.
3. Küçük molekül bağlama ve RNA 2'-OH değişiklik
   1. Dört örnekleri hazırlamak için 8 pmol RNA 0.5 x TE arabellek 32 μL içinde 1.7 mL Tüp, 2 dk ve ek-cool buz için en az 1 dk 80 ° C'de ısı ekleyin.
      Not: RNA'ın yaklaşık molekül ağırlığı hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: MW = (# üslerinin) x 340 Da.
   2. 5 x 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl₂ve 500 mM NaCl içeren mix katlama 8 μL ekleyin. Aliquot 9 μL RNA karışımın içine her biri dört PCR tüpleri ve onları #1-#4 etiket. #1 Tüp, konsantre küçük molekül çözüm (% 10 DMSO) #2, içine 1 μL içine % 10 DMSO 1 μL ekleyin 1 μL seyreltilmiş küçük molekül çözüm (% 10 DMSO) içine #3 ve #4 içine su 1 μL.
   3. PCR tüpleri termal cycler 30 dk içinde 37 ° C'de kuluçkaya.
   4. 2'-OH değişiklik tepki hemen önce NAI hisse senedi çözüm (2 M) 1 μL 0,5 M çalışan bir çözüm vermeye DEPC tedavi su 3 μL ile oranında seyreltin. Gecikme olmadan çözüm #1, #2 ve #3 tüpler içine çalışma Nai 1 μL ve % 25 DMSO #4 içine 1 μL ekleyin. Termal cycler 15 dakika içinde 37 ° C'de kuluçkaya.
   5. 100 μL elüsyon/bulutlu (bkz. Adım 1.1.13 tarifi için), glikojen (15 mg/mL) 2 μL mix ve sıvı her PCR tüp içinde 1.7 mL tüp içine aktarmak ekleyin. Buz gibi 200-proof alkol 0,34 mL ekleyin (3 x birim) her tüpün içine. Karıştırmak yanında vortexing 5 s ve yer için en az 1 h için-80 ° C dondurucu tüplerde.
      Not: Bu dönemde 1.5.1 adımda kullanılacak sıralama jel ayarlamaya başlayın.
   6. 14.000 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj Süpernatant RNA Pelet bozmadan kaldırın. % 80'i ekleyerek RNA Pelet yıkama alkol (tüp başına 0.5 mL), 15 s ve 20.000 x g ve 4 ° c 15 dakika santrifüj için girdap Süpernatant tekrar kaldırın.
      Not: İsteğe bağlı olarak, bir Gayger sayacı tüp istinat radyoaktif Pelet emin olmak için kullanın.
   7. 5 dk. 9 eklemek μL RNase free su için RNA Pelet kurumasına ve aşağı yukarı 10 kez pipetting karıştırın.
      Not: RNA Pelet aşırı kuru değil. Bütün yağış bu adımın sonunda çözülmüş bekleniyor.
4. Marker hazırlık ve astar uzantısı
   1. Değiştirilmiş RNA 4 yeni PCR tüpler içine aktarmak ve onları #1-#4 olarak daha önce etiket. 2 pmol kontrol RNA DEPC tedavi su 7 μL içinde 4 ek PCR tüpleri için eklemek ve onları #5-#8 etiket. Radiolabeled astar (adım 1.2.6) 2 μL tüm sekiz tüplerde ekleyin. 65 ° c 5 min için TAV, sonra hemen aşağı 4 ° C termal cycler içinde serin için ısı.
   2. RT arabellek x 5 4 μL ekleyin (bkz. Tablo malzemeler), dithiothreitol (DTT, 0,1 M) 1 μL ve 1 μL dNTP Mix (10 mM her) her sekiz PCR tüpleri.
   3. DEPC tedavi H₂O 2 μL Tüpler #1-#4 ekleyin. 4 μL ddATP (5 mM), ddTTP (5 mM) 4 μL ve ddCTP (5 mM) 4 μL tüpler içine #5-#7, sırasıyla ekleyin. DdGTP (5 mM) 1 μL ve DEPC tedavi su 3 μL tüp #8 ekleyin. Dört kez pipet karıştırmak için.
   4. Termal cycler 1 dk 52 ° C'de ısı. Ters transkriptaz 1 μL ekleyin (bkz. Tablo malzemeler), sonra yukarı ve aşağı dört kez pipetting karıştırın. 20 dk 52 ° C'de tepki kuluçkaya.
   5. 5 M NaOH 1 μL her RNA hidrolize tüpler içine ekleyin. 95 ° c 5 min için tüpler ısı.
   6. 1 M HCL 5 μL ekleyin ve etanol yağış (adım 1.3.5 ve 1.3.6), tekrar glikojen ve sıvı aktarma ihmal dışında.
      Not: Adım 1.4.6 sonuçları "tuz açık" bilinen jel ortasında yitirmesi bölgesinde atlama.
   7. 5 dk. eklemek 10 μL H₂O DNA Pelet kurumasına ve 2 x 10 μL TBE-üre örnek yükleme tampon ve pipet yukarı ve aşağı redissolve için 10 kez. 5 dk. 70 ° C ısıda jel üzerine yüklemeden önce buzda tüpler yerleştirin.
5. SAYFA Analizi
   1. Bir % 8 polyacrylamide sıralama jel hazırlamak için aşağıdaki değişiklikler ile 1.1.6-1.1.10 adımları izleyin: % 8 akrilamid çözümünü hazırlamak için 100 mL % 40 akrilamid/bisacrylamide çözeltisi (29:1) kullanın ve sıralama jel cam plakanın (Örneğin, 46 57 cm) x 0.4 mm rondela ile.
   2. 10 μL örnek--dan adım 1.4.7 yükleyin. Jel 65 2 h için veya alt boya 3/4 jel ulaşıncaya kadar W çalıştırın.
      Not: Gerekli yinelenen için-80 ° C'de örnekleri geri kalanı saklayabilirsiniz.
   3. En iyi silikonlu cam levha spacer kaldırma ve yavaşça bir spatula ekleme kaldırın. Bir parça kağıda büyük filtre jel kapsayacak şekilde yerleştirin ve nazikçe jel filtre kağıdı bağlı kalmak izin vermek için tuşuna basın. Alt ucundan başlayarak, filtre kağıdı kaldırın ve jel cam tabaktan birlikte çıkarın.
   4. Jel filtre kağıdı ile birlikte bütün jel (filtre yukarı bakacak şekilde kağıdı) karşılamak için yeterli büyüklükte plastik wrap bir parça yerleştirin. Filtre kağıdı/jel/plastik wrap sandviç bir jel Kuru filtre kağıdı yüzü aşağı bakacak şekilde aktarın.
      Uyarı: Radyoaktif malzeme kirlenmesini önlemek için 3-4 daha fazla jel sandviç arasında büyük filtre kağıt parçaları kullanın ve kurutucu jel.
   5. 70 ° c için 1 h bir vakum ile jel kuru. Jel sandviç fotoğraf ağartılmış fosfor depolama ekran kaset üzerine aktarın. 4-16 h için ekran jöleye radyoaktivite maruz.
   6. Fosfor depolama ekran bir görüntüleme aygıtı ve orta çözünürlükte (~ 30 min) ile tarama üzerine koyun.
      Not: Jel resmin üzerine bir gülümseme benzeri yapı varsa, düzeltme yazılımı (Örneğin, SAFA) yayınlanabilir kaliteli bir görüntüye işlemek için kullanın. Standart marker lane 1 nükleotit 2'-OH değişiklik şerit uzun olduğunu göz önünde bulundurun.

2. hücre içi şekil

1. Astar tasarım
   Not: Tüp bebek şekli farklı olarak, hücre içi şekli bir ifade kaset tasarım gerekmez. Ancak, bir en uygun astar kümesi kullanılması gerektiğini ve şekil önce değerlendirilecek gerekir deneme.
   1. En az üç benzersiz astar çift bir patlama astarın tasarım aracı tarafından (Örneğin, astar-BLAST) oluşturur. Pre-mRNA insan hücrelerinde çalışmaya, astar çifti özgüllük kontrol parametreleri başvuru veritabanı olarak insan genomu (değil transcriptome) seçin. Amplicon boyutu 200-1000 base-pair (bp) aralığında seç.
   2. ~ 10⁶ hücrelerle tedavi RNase A ve proteaz K sütun tabanlı bir spin yöntemi ile ilgi genomik DNA ayıklamak ( Tablo malzemeleri görmek ve üreticinin iletişim kuralı kullanın). Arıtılmış genomik DNA 0,1 μg/μL TE arabelleği normalleştirmek.
   3. Test PCR protokolü ile gerçekleştirilen adımlar 1.1.1 ve 1.1.2.
      Not: İstenen astar küme tek bir bant üzerinde % 1,8 özel jel verim.
2. Hücre hazırlık ve 2'-OH değişiklik
   Not: Pre-mRNA ilgi zenginliği artırmak için bir minigene altında sitomegalovirüs (CMV) Organizatörü kurucu ifade için doğru sırada ile konak hücreleri transfected.
   1. Kültür orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x antibiyotik karışımı içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) 37 ° C'de içeren önceden ısıtmak Tohum 293T hücreleri % 50 confluency kültür orta transfection önce 24 saat. %2 orta değiştirmek FBS olmadan antibiyotik ~ 1 h transfection önce DMEM.
   2. Minigene plazmid 10 μg 100 μL ( Tablo malzemelerigörmek) indirimli serum medya 1 de bir 96-şey tabak içine ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırmak için dört kez çözüm pipette.
   3. Transfection reaktif 40 μL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) indirimli serum medya plaka başka bir iyi 100 μL içine. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   4. Tüm plazmid çözüm transfection reaktif süspansiyon için ekleyin. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   5. Tüm DNA eklemek / transfection reaktif karışımı orta çanağı boyunca yüzeyinde dropwise. 6-12 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   6. Orta Aspire edin ve yavaşça bir kez fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4, CaCl₂ ve MgCl₂, olmadan görmek Tablo reçetesi) 5 mL ile yıkayın. 3 mL tripsin çözeltisi içeren hücreleri trypsinize. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   7. Yavaşça yemeğin altındaki hücrelerden ayırmak için çanak kesin. Tripsin kültür ortamının 6 mL ile etkisiz hale getirin. Vasıl 300 x g 4 dk santrifüj kapasitesi ve orta kaldırın.
   8. ~ 10⁶ hücreler tepki orta 199 μL her örnek için resuspend (% 1 DMEM içinde FBS) ve hücre süspansiyon bir 96-şey tabak aktarın. Bileşik çalışma çözüm 1 μL veya DMSO 1 μL 37 ° C'de 30 dk için tüm üç denetimlerde hücrelerle kuluçkaya
      Not: Üç kontrol örnekleri-meli var olmak dahil: NAI, denatüre RNA ve NAI NAI DMSO denetimle negatif kontrol.
   9. Denaturing (DC) RNA ve NAI negatif denetimi dışında her örnek için 2 m NAI 10 μL ekleyin. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 15 dk. yavaşça sarsmak için her 5 dk hücreleri yeniden askıya plakalara 37 ° C'de kuluçkaya.
   10. Hücreleri 1.7 mL tüpler ve gecikme olmadan 2 min için 400 x g , santrifüj içine aktarın. Süpernatant hücre Pelet bozmadan kaldırın.
   11. Guanidinium thiocyanate 0.4 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). 15 için girdap homojenize s. Örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
       Not: Örnekleri-20 ° C'de sonraki adıma geçmeden kadar saklanır.
3. RNA çıkarma
   1. Kloroform 0.2 mL her guanidinium homojenize thiocyanate örnekleri için ekleyin. 2 min için oda sıcaklığında 15 s. Incubate için girdap.
   2. 12.000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj Üst renksiz sulu tabaka RNA içerir. ~ 380 μL sulu çözüm yeni bir 1,7 mL tüp içine aktarın.
      Uyarı: Interphase kirlenmesini önlemek için rahatsız etmeyin.
   3. Alkol hacmi 1.5 x ekleyin (~ 570 μL). 15 için girdap karışımı s.
   4. 600 μL RNA karışımı bir RNA izolasyon spin-sütuna aktarmak ( Tablo malzemelerigörmek). 12.000 x g 15 s. atmak için eluent santrifüj kapasitesi. Tüm sıvı ile aynı spin sütuna geçmek için bu adımı yineleyin.
   5. Sütun RW1 arabellek 0,35 mL ile yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) iplik 15 s. 80 eklemek μL RNase free DNaz, için ben RDD arabellekte tarafından (bkz. Tablo malzeme). 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Tüm DNA kirlenme kaldırmak için önemlidir.
   6. Daha sonra sütun 0,35 mL RW1 arabelleği ve 2 x RPE arabellek 0.6 mL ile yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) iplik 15 tarafından s her adımda. Sütun bir boş koleksiyon tüp 12.000 x g 1 dk. için de spin sütunla centrifuging tarafından kuru.
   7. 32 μL RNase free su sütunu Merkezi'ne ekleyin. 1 dk. santrifüj 12.000 x g 30, kuluçkaya s ~ 30 μL arıtılmış RNA çözüm elde etmek için. Örnekleri-20 ° C'de denatüre örnek işlenirken koymak.
4. Denatüre RNA denetim hazırlık
   1. Yer 30 µL RNA örnek DC için 1.7 mL plastik tüp buz üzerinde. Formamide 50 μL ve 300 mM HEPES (pH 8.0) içeren DC arabelleği 15 μL ekleyin ve 25 mM EDTA Tüp içine.
   2. Isı RNA 95 ° c 1 dk. hızla denatüre NAI hisse senedi çözüm (2 M), daha sonra iki kez karıştırın ve tüp Isıtma blok üzerine geri koymak için flick 5 μL ekleyin. Ek bir 1 dk. için 95 ° C'de kuluçkaya sonra hemen tüp buza koy.
   3. Guanidinium thiocyanate 0.4 mL ekleyin. Adımları 2.3.1–2.3.4 tekrarlayın.
   4. Sütun 2 x RPE arabellek 0.6 mL ile yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) iplik 15 tarafından s her adımda. Sütun bir boş koleksiyon tüp 12.000 x g 1 dk. için de spin sütunla centrifuging tarafından kuru.
   5. 32 μL RNase free su sütunu Merkezi'ne ekleyin. 1 dk. santrifüj 12.000 x g 30, kuluçkaya s ~ 30 μL kurtarılmış DC RNA çözüm elde etmek için.
5. Astar uzantısı
   1. 0.5 μg/μL RNase free su ile içine 2.3.7 ve 2.4.5 RNA çözümden normalleştirmek. Taze 30 mM MnCl₂ eriyik--dan MnCl₂∙4H₂O toz hazırlamak.
   2. Her örnek için RNA çözüm 9 μL bir PCR şerit aktarın. 10 mM dNTP 1 μL ve 2 mikron gene özgü astar (GSP) 1 μL her tüpte ekleyin. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 65 ° c termal cycler 5 min için kuluçkaya ve buz koymak > 1 dak.
      Not: Alternatif olarak, rastgele bir nonamer 1 μL GSP ikame içinde kullanılabilir.
   3. Her PCR tüpte 10 RT arabellek x 2 μL karışımı ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) 30 mM MnCl₂ve 2 μL 100 mm DTT 4 μL. Yukarı ve aşağı 4 x-karıştırmak için pipet. 2 dakika 42 ° C'de kuluçkaya.
   4. Ters transkriptaz 1 μL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Yukarı ve aşağı 4 x-karıştırmak için pipet. 3 h için bir termal cycler 42 ° C'de kuluçkaya.
6. Kütüphane hazırlık ve yeni nesil sıralama
   1. DNA polimeraz 1 μL, 10 DNA polimeraz arabellek x 5 μL ekleyerek bir PCR reaksiyonu ayarlayın (bkz. Tablo malzemeler), DMSO, 1,5 μL H₂O 34 μL beher-in (10 mikron), astar ve cDNA adım 2.5.4 5 μL 2 μL.
   2. Termal cycler kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: Aşama 1) 95 ° C için 2 dk; Aşama 2) 95 ° C 30 s; sahne 3) 60 ° C 30 s; Aşama 4) 30 68 ° C s; 5. aşama) döngü geri sahne 2 30 döngüleri için; Sahne 6) 68 ° C 3 dakika; ve Etap 7) aşağıdaki adım kadar 4 ° C'de tutan sonsuz.
   3. Amplicon % 1,8 özel jel kullanarak arındırmak.
      Not: PCR grup jel üzerinde tek bir bant olarak görünmesi gerekir.
   4. Kütüphanede standart parçalanma ve edebiyat^6,26yılında kurulan ligasyonu yöntemlerini kullanarak oluşturun.
   5. Sıra yaklaşık 10 milyon üretmek için 1 x 75 tek taraflı kenar okuma kullanarak bir nesil sıralama ekipman üzerine örnek okur.
   6. ShapeMapper ve SuperFold yazılım kullanarak sonuçları analiz hafta tarafından geliştirilen paketleri grup²⁶.

Biz daha önce modülatör Uçbirleştirme bir RNA SMN-C2, exon 7 SMN2 gene pre-mRNA üzerinde AGGAAG motifi ile etkileşim kurar ve şekil RNA yapısal değişiklikler SMN-C26huzurunda değerlendirmek için kullanılan olduğunu gösterdi. SMN-C2 bağlama sitenin FDA onaylı antianlamlı oligonükleotid (ASO) SMA, nusinersen, hangi bağlar ve intron 727,28 (Şekil 1A) intronic dikişi susturucu (ISS) bloklar için ayrıdır. En bilinen alışılageldik transformatör, hacim SMN2 exon 7 exon 7 pre-mRNA29~ 100 nükleotit aralığında vardır; Bu nedenle, 140 ve 276 nükleotit uzunluğunda RNA dizilerinin kullanılmıştır tüp bebek ve hücre içi şekil için dinlerinden, hangi exon 7 ve bitişik intron bölge (Şekil 1A) kapsar.

Bu temsilcisi tüp bebek şekil analizi, faiz RNA dizisi için çoğu RNA dizileri1uyumlu hafta laboratuvar tarafından geliştirilen en iyi duruma getirilmiş bir kaset içine yerleştirilmiştir. Zaman zaman, faiz dizi etkileşim veya bu kaset ile müdahale. Bu gibi durumlarda, değiştirilmiş bir kaset aşağıdaki üç özellikleri ile kullanılabilir: i) bir 3' ucu belirli astar bağlama site benzeşimli bir daha verimli hibridizasyon astar için RNA dizisinin, II) bir çok yapısal saç tokası döngü herhangi bir parçası daha bulunan özel ve tekrarlanabilir (Bu hareket edecek her iki iç denetimi deney ve sinyal deney deney hizalamak için yöntemi) şekil sinyal ve III gösterecektir astar bağlama site doğrudan ters yönde) 5' uç saç tokası yapısı öğe, şekil sinyal sonunu gösterir. Şekil kaset daha da ribozyme dizileri her iki 5' kendi kendine fizyon ile çevrili olduğunu- ve 3'-homojen bir RNA30oluşturmak için biter. Çekiç ve hepatit delta virüs çokluğunun şekil kaset uyumludur ve genellikle istenen RNA'ın yüksek verimli vermek bulduk. Ortaya çıkan şablonu RNA bir 3'-2', 3'-döngüsel fosfat ve bir 5' uç hidroksil grubunun hangi astar Uzantısı ile müdahale değil, bitmedi. EXoN 7 SMN2 ve bitişik bölge pre-mRNA kapsayan uzun bir 140-nükleozit sıra düzeni 1' de gösterildiği gibi şekil ve ribozyme kaset içinde sentez.

Genel olarak, faiz ifade kasete bakmaksızın dizisi yapısı potansiyel ikincil veya daha yüksek sırasını karşılamak yeterince uzun olmalıdır. SMN2 7 exon söz konusu olduğunda, iki sap-ilmik yapılar6,31140-nükleotit bölge içerir. Faiz bölgesinin yapısını duruma göre değişir ve deneme-yanılma tarafından değerlendirilmesi gerekir.

Polyacrylamide sıralama jel 32P olarak etiketlenmiş astar uzantılı ürünler ile temsilcisi bu deney vitro şekil profilinde görselleştirmek için seçildi. Bir alternatif görselleştirme Yöntem a fluorescently etiketli DNA astar32ile kılcal Elektroforez kullanmaktır. Polyacrylamide sıralama jelleri, 5' uç ~ 20 nükleozitler yakınındaki ve ~ 10 nükleotit 3'-sonuna yakın ilgi RNA dizisinin kantitatif görüntülenmeyecektir değil, nedeniyle zaman zaman durur başlatma adımları ters transkripsiyon ve yoğun SAYFA jelleri tam uzunlukta transkript1için Bands.

Partiye Hazırlık jel kurtarma bir RNA şablonunun (adım 1.1.6-1.1.12) için alternatif bir yol istenen RNA şablon verimi ise mini bir jel aşırı etmektir > % 90. Bu sütun desalting ve TE arabelleği 50 µL RNA eluting RNA ürününden fazla NTP kaldırmak için tavsiye edilir. RNA konsantrasyonu ölçmek ve her iyi 5.0 µg yükleyin. Arıtma sırasında adım / T7 RNA şablon transkripsiyonu, ksilen cyanol FF boya (açık mavi) vefat ettiğinde sayfa durdurmak %6 üçte denatüre TBE-üre jel. Öz-bölünme RNA parça (< 80 nükleozitler) (Şekil 1B) boyama üzerine jel tek büyük grupta olarak istenen RNA yaptı jel, delip geçmiş.

SMN-C2 (Şekil 1 c) göre yayımlanmış yordamı33 sentezlenmiş ve 10 mM DMSO hisse senedi çözümde çözünmüş. Hisse senedi çözüm daha fazla 500 ve 50 µM son 50 ve 5 µM, konsantrasyonları sırasıyla elde etmek için % 10 DMSO çözümde içine seyreltilmiş. 37 ° C'de 30 dk içinde DMSO veya SMN-C2 huzurunda onun denge aşamasına ek soğutmalı RNA refolded Daha uzun bir kuluçka zamanı denemenin sonucu değiştirmedi. İki deneysel örnek (50 ve 5 µM SMN-C2), iki (DMSO ve NAI-denetimleri) denetimleri ve dört işaretleri (A, T, G, C) astar uzantısı için tedavi. Fosfor depolama ekran jöleye açığa sonra başarılı bir şekil deneme gösterecektir: i) bir tek ve en yoğun grup jel ve Grup II) smear (Şekil 1 d) olmadan tek nükleotid çözünürlükte jel boyunca üstündeki. Bir ortak sayfa Analizi "tuz açık" bilinen bir karalama bölge jel (1E rakam) ortasında görünebilir sorundur. Tuz, DMSO, yüksek konsantrasyon nedeniyle bu veya diğer istenmeyen madde etanol yağış tarafından kaldırılabilir yükleme örnek.

İçinde şekil vitro saf bir RNA şablonu başarılı bir deneme için anahtardır. Saf olmayan bir RNA şablon genellikle istenmeyen-den sonuçlanmak nedenidir. SAYFA analizi 2 sets-in işaretleri desenini açıkça gösteriyorsa, RNA şablon homojen değildir ve hazırlık tarafından repurified için TBE-üre jel gösterir.

Hücre içi şekil için başarılı bir deneme anahtarı bir en iyi duruma getirilmiş astar set güçlendirme için tasarlamaktır. İle 0.10 µg genomik DNA-Alerjik cDNA şablonunun özel jel analiz 25 PCR döngüleri içinde tek bir bant dikkat edilmelidir. Tekrarlayan intron dizileri bu nedenle kaçınılmalıdır. Yapısal çalışmaya SMN-C2 etkisini SMN2 pre-mRNA, üç astar set (Tablo 2) üzerinde test edildi ve tüm tatmin edici (Şekil 2A) vardı.

Bir hedef RNA dizisi düşük kopya sayısı genel olarak hücre içi şekil için bir sorundur. Faiz RNA zenginleştirmek için güçlü bir CMV organizatörü altında faiz RNA dizisini içerir bir minigene 293T hücre içine transfected. SMN2 minigene dikişi desen bu endojen SMN2 ile ya da ezelî SMN-C219,34beyannamedir çünkü biz bu öngörülüyor SMN-C2 etkileşen RNA overexpressed SMN2 pre-mRNA büyük olasılıkla yapıldı aynı yapısını endojen gen ürünü. EC50 SMN-C3'alışılageldik tahlil ~0.1 µM6,19iken, bir konsantrasyon (20 µM) yüksek sonunda küçük molekül ve hedef RNA dizisini bağlama durumu sağlamak için kullanılmıştır.

Yalıtım RNA'ın gene özgü ve rasgele astar uzantısı için kullanılabilir. Söz konusu olduğunda eXoN 7 SMN2, SMN2E7-338-RV (Tablo 2) istenen cDNA PCR güçlendirme SMN2E7-276 astar set (Tablo 2) ile daha yoğun bir grupta kanıtladığı rastgele bir nonamer daha yüksek bir kopyasını verimleri 25 döngüsünden sonra bulduk. 2'-OH değişiklik adımda 91 µM son NAI konsantrasyon 15 dk bir kuluçka dönemi için kullanıldı. Farklı hücre tipi veya orta kullanılırsa, kuluçka süresinin yeniden optimize edilmiş olması gerekir. Kuluçka süresi çok uzun ise, özel jel Analizi amplicon bazen bir grubu göstermek başarısız olur.

Laboratuvar35 [SMN-C2 tedavi hücre içi SMN2 şekil exon 7 pre-mRNA, ham veri başvurmak için sıra okuma Arşiv (SRA) yeni nesil sekanslama tarafından oluşturulan verileri çözümlemeye hafta tarafından geliştirilen bir python tabanlı bir program, ShapeMapper, veritabanı]. Amplicon şekil reaktivite önemli ölçüde değişmedi (> 1), hangi belirtilen ikincil yapı SMN-C2 varlığında (2B rakam) kalır. Bu da SuperFold35tarafından oluşturulan ark araziler tarafından doğrulanır. Bağlantı çizgiler olası temel şekli her nükleotit faaliyete göre eşleştirme gösterir. SMN-C2 ve DMSO tedavi RNA modelleme temelde aynı (Şekil 2C) olduğunu. Farklı hücre içi şekil reaktivite her nükleotit (Şekil 2B) hesaplanır ve TSL-1 (5'-son exon 7) ama (3'-son exon 7) TSL-2 değil çoğu reaktivite değişikliği oluştu. Bu sonucu kabul eder tüp bebek şekli; Her ne kadar baz eşleşmesi tüp bebek dan kaymıştır, hücre içi şeklinde şekil RNA modelleme (2D rakam) inceliyor.

Hücre içi şeklinin ortak bir sorun amplicon boyunca düşük mutasyon oranıdır. Genomik DNA kontaminasyon nedeniyle, genellikle olur. DNA 2'-OH grubu içermiyor; Bu nedenle, hiçbir asilasyonu ürün NAI ile oluşturulur. PCR güçlendirme böylece sadece DNA polimeraz düşük mutasyon oranı yansıtır. RNA izolasyon sütun tarih DNaz sindirim tarafından takip guanidinium thiocyanate tarafından tüm DNA çoğu durumda kaldırmak yeterli olur. DNA kirlenme devam ederse, 2.3 RNA izolasyon için adımları yineleyin.

Düzeni 1: DNA dizisi şablonunun RNA transkripsiyonu. Hammerhead virüs ribozyme dizisi kırmızı içinde 12 bp sıra ilk 12 ters tamamlayıcıdır bp 5'-kaset. Burada sunulan faiz RNA dizisi bir 140'bp pre-mRNA sıra exon 7 insan SMN2 gen içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 1: Deneysel tasarım ve SMN2 exon 7 pre-mRNA SMN-C2 huzurunda için tüp bebek şekil sonucu. Sıralı tüp bebek ve hücre içi şekil çalışmaları SMN2 gen için ilgi(a)genel bakış. SMN-C2 AGGAAG motifi exon 7 üzerinde farklı bir konuma nusinersen bağlama sitesinden bağlar. (B) arıtma T7 transkripsiyon ürün. Her biri üç şerit ham RNA'ın 5.0 µg içerir. TBE-üre jel SYBR-güvenli ile (1:10, 000) 1 x TBE tampon 5 min için lekeli. Kırmızı kesikli kutu eksizyon kenar RNA kurtarma için gösterir. (C) SMN-C2 yapısını. (D) NAI ve bir 140 ile In vitro şekil deneme nükleotit uzunluğunda RNA şablon eXoN 7 içeren. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 MİKRON); 4 NAI; eksik = 5-8 ddATP, ddTTP, ddCTP ve ddGTP eklenmesi sırasında astar uzantısı tarafından oluşturulan merdivenler =. SAYFA taşınan dışarı TBE-üre sıralama jel 60 W 3 h. kırmızı için üzerinde artan bant şiddette, 50 µM SMN-C26yıldız gösterir. (E) kesikli kırmızı kutu "tuz açık" bölgede bir örnek üzerinden ayrı bir deney. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Hücre içi şekil RNA modelleme SMN2 exon 7 pre-mRNA için türetilmiş. Özel jel analizde tek bir bant vermiştir (A) PCR güçlendirme ile tüm üç astar kümeleri (Tablo 2). 1 SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = DNA merdiven =. (B) farklı hücre içi şekil reaktivite 10 µM için SMN2 minigene transfected 293T hücrelerindeki SMN-C2 ve DMSO TSL1 içinde. Şekil reaktivite tek nükleotid çözünürlükte. Onun standart sapma ShapeMapper yazılım35tarafından hesaplanır. Yeşil yıldız belirtmek önemli şekil reaktivite değişiklik 10 µM tarafından indüklenen SMN-C2. 276 bp amplicon xüzerinde gösterilen nükleotid numaralandırma-eksen. Hata çubukları şekil-Mapper yazılım26tarafından tahmin edilmiştir. (C) SuperFold35 için hücre içi şekil verileri tarafından modelleme en makul RNA ikincil yapı tarafından oluşturulan Arc arsa. (D) In vitro ve hücre içi şekil yönetmen modelleme exon 7 ve bitişik bölgeler. Tüp bebek RNA modeli için kaset (turuncu) ve nükleotid 1-19 (mavi) sabitleme şekil kroki gösterilir. Hücre içi RNA modeli için nükleotit numaralandırma tüp bebek Şekil şablon ile hizalanır. Nükleotid 1-18 ve 120-140 göz ardı. Önemli reaktivite değişiklikleri içinde kırmızı ve yeşil yıldız tüp bebek ve hücre içi şekil için sırasıyla gösterilir. Daha önce TSL1 ve TSL231 adlandırılmıştır ikincil yapılar mavi kutu içine alınır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: temsilcisi deneyde kullanılan astar dizileri.

Tablo 2: astar için ilgi pre-mRNA dizisinin amplifikasyon ayarlar. Tüm üç astar kümeleri PCR reaksiyon genomik DNA-Alerjik cDNA şablonu ile tek bir amplicon verim.

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.