Yöntem makalesi

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

DOI:

10.3791/59021

⸱

30 Ocak 2019

 ,  , 
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her iki tüp bebek ve hücre içi seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu pre-mRNA dizileri bir RNA hedefleme küçük molekül huzurunda ilgi ikincil yapısını belirlemek için astar uzantısı (SHAPE) deneyler tarafından analiz için detaylı iletişim kuralları Bu makalede sunulan.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç geliştirme sürecinde küçük moleküllerin RNA hedefleme, yapısal değişiklikler hedef RNA serileri ile ilişkileri üzerine elucidating arzu edilir. Biz burada detaylı vitro sağlamak ve hücre içi seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu (SHAPE) iletişim kuralı RNA yapısal değişim varlığında spinal kas atrofisi (SMA), yaşama için deneysel bir ilaç çalışmaya astar uzantısı tarafından analiz motor nöron (SMN)-C2 ve pre-mRNA SMN2 gen 7 exon. Tüp bebek şeklinde 140 nükleotit SMN2 exon 7 içeren bir RNA dizisinin T7 RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu, SMN-C2 huzurunda katlanmış ve daha sonra bir hafif 2'-OH asilasyonu reaktif tarafından 2-methylnicotinic asit imidazolide (NAI) değiştirilmiş. Bu 2'-OH-NAI adduct daha fazla 32tarafından P olarak etiketlenmiş astar uzantısı probed ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) tarafından çözüldü. Bunun tersi olarak, hücre içi şeklinde 2'-OH asilasyonu SMN-C2 bağlı Hücresel RNA ile yerinde yaşayan hücrelerde gerçekleşir. Exon 7 şekil kaynaklı mutasyonların astar Uzantısı ile birlikte SMN2 gen pre-mRNA dizisi sonra PCR ve yeni nesil sıralama tabi güçlendirilmiş. İki metodolojiler karşılaştırılması, tüp bebek şekli daha düşük maliyetli bir yöntemdir ve sonuçları görselleştirmek için bir işlem gücü gerektirmez. Ancak, tüp bebek RNA şekli elde edilen modeli bazen RNA bağlanıcı proteinler ile tüm etkileşim kaybı nedeniyle büyük olasılıkla hücresel bir bağlamda ikincil yapıdan sapma sergiliyor. Hücre içi şekli radyoaktif malzeme işyeri ihtiyacı yoktur ve bir daha doğru RNA ikincil yapı hücresel bağlamda verir. Ayrıca, hücre içi şekli genellikle geçerlidir tarafından yeni nesil sıralama, tüp bebek için karşılaştırıldığında kullanan daha büyük bir aralığı RNA dizileri (~ 1000 nukleotid) (~ 200 nukleotid) genellikle bu şekil için sayfa analizine dayanır. -Dibi takdirde eXoN 7 içinde SMN2 pre-mRNA, tüp bebek ve hücre içi şekil elde RNA modelleri birbirine benzer.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz her nükleotit bir RNA dizisinin ilgi içinde kinetik ölçme ve tek nükleotid çözünürlük1ikincil yapı elucidating bir yöntemdir. Şekil metodolojileri, tüp bebek koşulları2,3,4 (arıtılmış RNA içinde tanımlanmış arabellek sistem) her ikisi de ve içinde yaşayan memeli hücreleri5,6, ikincil araştırmak için geliştirilmiştir Orta uzunlukta RNA dizilerinin yapısı (genellikle < hücre içi şekil için 1.000 nukleotid ve < tüp bebek şekil için 200 nukleotid). Bağlama küçük molekül metabolitleri2,4,7,8 RNA etkileşim üzerine reseptör RNA yapısal değişiklikler değerlendirmek ve mekanik eylemler Çalışmaya özellikle yararlıdır hedefleme-RNA molekülleri sırasında ilaç geliştirme9,10.

İlaç keşif RNA hedefleme son zamanlarda ilgi gibi akademik laboratuvarları ve ilaç endüstrisi11,12 farklı yaklaşımlar ve stratejileri13,14,15 çekti ,16. Son RNA hedefleme küçük moleküller klinik kullanım için iki yapısal olarak farklı deneysel ilaç, LMI-07017 ve RG-791618,19, umut verici gösterdi kas spinal atrofisi (SMA), için örnekler Aşama II klinik çalışmalar20sonuçlarında. Her iki moleküller vardı motor nöron (SMN) hedef yaşama 2 pre-mRNA gösterdi ve Tutkallama işleminin SMN2 gen6,17,21düzenler. Biz daha önce vitro ve hedef RNA yapısal değişiklikler RG-7916 SMN-C26bilinen bir analog huzurunda incelenmesi şeklinde hücre içi uygulama gösterdi.

Prensip olarak, şekil tarafsız bir şekilde her nükleotit bir kendi kendine su verme asilasyonu reaktif aşırı miktarda huzurunda bir RNA dizisinin 2'-OH asilasyonu oranını ölçer. Asilasyonu reaktif su kısa bir yarı ömrü ile kararlı değil (örneğin, T1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhidrit; veya 1 M 7, 2-methylnicotinic asit imidazolide ~ 20 dakika veya NAI)22 ve duyarsızlık kimliğine üsleri23. Her nükleotit dinamiklerini doğru bir değerlendirme dönüştürülebilir esnek bazlar 2'-OH grupları daha uygun bir asilasyonu sonuçlanır. Özellikle, bir nükleotid baz çifti içinde genellikle daha az reaktif NAI ve 1 M 7 gibi bir 2'-OH değiştirme reaktif için unpaired bir tane daha.

RNA şablonu ve nereye 2'-OH asilasyonu gerçekleşir kaynak bakarak, şekil genellikle tüp bebek ve hücre içi şekle kategorilere ayrılabilir. Vitro şekli kullanır saf T7 RNA transkripsiyonu ve Deneysel tasarımlar hücresel bir bağlamda yoksun. Hücre içi şeklinde RNA şablon transkripsiyon ve 2'-OH asilasyonu canlı hücreler içinde oluşur; Bu nedenle, sonuçlar RNA yapısal modeli hücresel bir bağlamda özetlemek. Hücre içi şekil için şekil vivo olduğu gibi edebiyat24canlı hücrelerde taşınan şekil için anılır olmuştur. Beri bu deney bir hayvan gerçekleştirilmez, doğruluk için hücre içi şekil olarak bu deneme olarak.

Tüp bebek ve hücre içi şekli astar uzantısı aşaması için stratejiler de farklıdır. Tüp bebek şeklinde Ters transkripsiyon huzurunda Mg2 +2'-OH asilasyonu konumunda durur. 32P-etiketli astar uzantısı bu nedenle bir grupta polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) olarak görünür ve grup yoğunluğunu asilasyonu oranı1' e orantılıdır. Hücre içi şeklinde Ters transkripsiyon 2'-OH, rastgele mutasyonlar oluşturur pozisyon huzurunda Mn2 +sigara. Her nükleotit mutational oranı tarafından derinlik yeni nesil sıralama içinde yakalanabilir ve şekil reaktivite tek nükleotid çözünürlükte sonra hesaplanabilir.

Düşük sinyal-gürültü oranı hücre içi şekil için potansiyel sorun (değiştirilmemiş dizileri yeni nesil sıralama okuma çoğunu işgal yani, 2'-OH grupları çoğunluğu değiştirilmemiş, ise). Son zamanlarda, bir yöntem 2'-OH zenginleştirmek için RNA değiştiren, vivo olduğu gibi şekli (icSHAPE)'yi anılacaktır, Chang laboratuvar25tarafından geliştirilmiştir. Bu zenginleştirme yöntemi RNA etkileşimleri, özellikle transcriptome çapında sorgulama gibi zayıf küçük moleküller okumak avantajlı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 vitro şekil.

Not: Protokol1yayımlanmış iletişim kuralı değiştirilir.

  1. RNA şablon hazırlama
    Not: T7 transkripsiyon için şablon olarak sentetik çift DNA (dsDNA) iplikçikli ve EcoRI/BamHI kısıtlama endonükleaz siteleri, PCR tarafından veya pET28a gibi benzersiz bir çifti taşıyan bir E. coli vektör içine her iki ekleme tarafından güçlendirilmiş emri verildi. PCR güçlendirme için protokol aşağıda gösterilmektedir.
    1. Aşağıdaki malzeme karışımı: 50 μL PCR Master mix (bkz. Tablo reçetesi) 2 μL 10 mikron her astar için (bkz. Tablo 1 için serileri), 200 ng dsDNA şablonunun 2 μL ve dimetil sülfoksit (DMSO) 3 μL ve H2iki PCR içine O. Aliquot 41 μL tüpler (50 μL tepki karışımı her tüp içerir).
    2. Termal cycler kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 1) 95 ° C 30 sahne s; Aşama 2) 20 95 ° C s; sahne 3) 56 ° C 20 s; Aşama 4) 20 72 ° C s; 5. aşama) döngü geri sahne 2 30 döngüleri için; Sahne 6) 72 ° C 3 dakika; ve Etap 7) aşağıdaki adım kadar 4 ° C'de tutan sonsuz.
    3. PCR amplicon jel dilimleri çıkarma tarafından arındırmak ( Tablo malzemeleri görmek ve üreticinin iletişim kuralı kullanın). Tris-EDTA (TE) arabelleği, 10 mM Tris (pH 8.0) içeren 35 μL ürünüyle DNA elute ve 1 mM EDTA 0.1 – 0.5 vermeye, μg/μL şablonu. Saf DNA şablon 0.10 μg/μL normalleştirmek.
      Not: İsteğe bağlı olarak, şablon kalitesini % 1,8 özel jel elektroforez ile DNA'ın 0.10 μg üzerinde analiz. İstediğiniz şablon DNA'ın tek bir bant üzerinde jel bekleniyor.
    4. T7 transkripsiyon tepki (Toplam hacim 40 μL) kadar küme PCR tüp içine aşağıdaki belgeleri ekleyerek: 10 tepki arabellek, ATP, CTP, GTP, UTP, 4 μL T7 enzim 4 μL 4 μL 4 μL 4 μL x 4 μL ( Tablo malzemelerigörmek) , Saf PCR amplicon adım 1.1.3 (0.4 μg) 4 μL ve dietil pyrocarbonate (DEPC) 12 μL-tedavi su. Yukarı ve aşağı 4 x pipetting karıştırın. 4-16 h termal cycler veya 37 ° C kuluçka için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: 1.1.4. adımda reaksiyon devam eden ise adım 1.1.6 başlamadan.
    5. DNaz 2 μL ekleyin, karıştırın yukarı ve aşağı 4 x pipetting tarafından ve 15 dk. Mix 2 eşit hacmi ile 37 ° C'de kuluçkaya Tris-bor-EDTA (TBE) x-üre örnek arabellek ( Tablo malzemelerigörmek). Devre dışı bırakabilirsiniz için 3 dakika için 70 ° C'de ısı.
    6. 75 mL % 40 akrilamid/bisacrylamide çözeltisi RNase free bir şişede karıştırın (29:1, Tablo malzemelerigörmek), üre, 180.2 g ve 10 x TBE arabellek (RNase içermeyen, bkz: Malzemeler tablo) 50 mL. Üre bütün kristalleri çözünene kadar şişe bir orbital çalkalayıcı (250 devir/dakika) koymak (en fazla 2 saat sürebilir). 500 ml su DEPC tedavi ile ses düzeyini ayarlayın. 0,2 mikron membran ile çözüm filtre ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Bu süreçte önlemek aynasal kullanarak ve heyecan-bar RNase kontaminasyonu önlemek için. Çözüm için ilâ 1 yıl 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
    7. İki Elektroforez cam tabak uygun boyutta (16,5 cm x 24 cm) deiyonize su ve % 70 ile temiz kağıdı silerek bir parça kullanılarak alkol. Plakayı 2.0 mm mesafe tutucular (siliconized bir yüzey ile plaka içe dönük) bir çift ile hizalamak ve kenar bandı ile plakaların mühür. Çift-teyp sızıntı önlemek için plaka köşesinde.
    8. Bir ölçek akrilamid eriyik--dan adım 1.1.6, 2.0 mL % 10 amonyum Persülfat çözeltisi ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 100 μL 200 mL RNase free pipet ucu ile karıştırma 30 s. Tilt için hızla tarafından biteviye-in benchtop kapak tabaklarda mix ve dökün Plakayı boşluk çözümden. Herhangi bir kabarcıklar Asansör ve plaka düz benchtop kapağına koymak için plaka dokunun. Hemen tarak takın ve en az 1 h için polimerize jel izin.
      Not: Jel içinde ertesi gün kullanılacak ise, bir parça ıslak kağıt havlu ve şal ile jel üst plastik wrap daha büyük bir parça ile ört. Yer o düz 4 ° C'de yalan
    9. Bandı çıkarın ve plaka bir elektroforez tribünde kelepçe. Tarak kaldırın ve üst ve alt baraj gölünün yeterli 1 x TBE arabellek ekleyin. Jel 30 dk 20 W. Önceden çalıştırın
      Not: İsteğe bağlı olarak, istenen RNA içeriği % ~ 90 veya daha fazla ise, mini bir jel bir partiye hazırlık jel ikame kullanılabilir.
    10. Her yükleme Wells pipetting tarafından yukarı ve aşağı iki kez rezervuar sıvı ile yıkayın. Ham RNA--dan adım 1.1.5 kuyu içine ekleyin. Ksilen cyanol FF boya (açık mavi) jel'ın uzunluğu (~ 60 dk) yaklaşık üçte geçene kadar jel 20 W çalıştırın.
      Not: Kuyu yüksekliği en fazla üçte birini yüklemek için emin olun (gerekirse, birden çok kuyu kullanın).
    11. 1 x TBE tampon 1:10,000 seyreltme güvenli ile jel sokmak için jel büyük bir kapta ( Tablo malzemelerigörmek) boya. Kapsayıcı bir orbital çalkalayıcı 80 rpm'de 5 min için koymak.
    12. UV ışık altında istenen RNA grubu tanımlamak ve hızla temiz bir jilet kullanarak jel ince bir bant kesme. 1-2 jel dilimleri bir 1.7 mL tüp içinde yerleştirin.
    13. RNA tarafından pasif elüsyon jel dilimden kurtarmak. Her tüp için yeterli elüsyon/yağış karıştırmak (dilim başına ~0.3 mL) ekleyin: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2.5 M LiCl, 1 mM EDTA, % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) suda DEPC tedavi. 16 h için 4 ° C'de jel splice(s) içeren tüp döndürün.
      Not: Bu adımda % ~ 75 tipik kurtarma oranıdır. Verimi artırmak için kaldırmak ve eluent toplamak ve elüsyon arabellek aynı birim eklemek, sonra bu adımı yineleyin.
    14. Eluent yeni bir 1,7 mL tüp birleştirin. Tüpler altı kez sıvı karışımı ters çevir ve tüpler için en az 1 h-80 ° C'de yer 2.5 x buz gibi alkol ekleyin.
    15. 10.000 x g ve 4 ° c ' 10 dk santrifüj Dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. % 80'i ekleyerek RNA Pelet yıkama alkol (1 mL tüp başına), 15 s ve 10.000 x g ve 4 ° c ' 10 dk santrifüj için girdap
    16. Süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı 10 kez pipetting 5 dk. 50 ekleyin μL RNase free su ve karışımı için RNA Pelet kuruması. RNA konsantrasyon için 0,10 μg/μL normalleştirmek. Arıtılmış RNA-80 ° C'de depolayın
      Not: RNA Pelet aşırı kuru değil.
    17. İsteğe bağlı olarak, RNA kalitesini analiz etmek için 1 μL seyreltik (100 ng) kimden adım 1.1.16 5 μL su ve karışımı ile 2 x TBE-üre örnek arabelleği 5 μL RNA'ın. Sonra ısı 3 dk ve % 6 TBE-üre mini jel üzerindeki yükü için 70 ° c.
      1. Jel 180 V 1 h. gerçekleştirmek için adım 1.1.11 yapılır gibi boyama çalıştırın. UV jel bir görüntüleme sistemi görselleştirin. Tek bir bant istenilen uzunluğa bekleniyor.
  2. 32P olarak etiketlenmiş astar hazırlama
    1. Ardından Malzemeler karıştırılarak tepki kadar ayarla: 10 μL γ -32P-ATP (~1.5 MCI, ~ 25 mikron, Malzemeler tablobakınız), 2 μL ters Transkripsiyon (RT) astar (sıra bkz: Tablo 1için 100 mikron), 10 x T4 polinükleotit kinaz (PNK) 2 μL reaksiyon tampon, T4 PNK 1 μL (bkz. Tablo reçetesi) ve 5 μL RNase free su. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Uyarı: Uygun koruma adımları 1.2-1.5 radyoaktif malzemeler için yetkili bir işyerinde için ihtiyaç vardır.
    2. 65 ° C'de 20 dk için ısı devre dışı bırakma 2 x TBE-üre örnek arabellek 25 μL ile eluent 1 dk. karıştırmak için bir sütun desalting ve santrifüj üzerine örnekleri de 1000 x g ekleyin. .
      Not: Eğer değil hemen saf için etiketli ham ürün-20 ° C'de depolayın.
    3. 20 W 1 h için % 10 akrilamid jel çalıştırın.
      Uyarı: Adım 1.2.1 jel üzerine 32P olarak etiketlenmiş astar yüklemek ve radyoaktivite üst rezervuar içine kanama önlemek. Jel üzerinde ince bir bant sağlamak için kuyu yüksekliği fazla üçte biri yük değil (gerekirse, birden çok kuyu kullanın). Sıvı alt rezervuar içinde yüksek oranda radyoaktif olabilir.
    4. Cam plakanın jel kaset kaldırmak ve jel plastik wrap bir parçası üzerinde yatıyordu. Hava geçirmez bir sandviç yapmak için jel üst kapak için plastik wrap katlayın. Jel sandviç kalsiyum tungstate fosfor ekrana koyun ve görüntüleme bir aletle bulaşmasına neden. Jel ile jel kenarlarını nerede olduğunu bilmek tekrar normal ışık görüntü.
    5. İki görüntü bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Yazdırılan görüntünün üzerine jel hizalayın. İstenen grup jel dışarı kesmek için taze bir jilet kullanın. 1-2 jel dilimleri bir 1.7 mL tüp içinde yerleştirin.
      Not: Yazdırılan görüntünün gerçek jel aynı boyutta olduğundan emin olun. Çift hizalamayı jel dilim kesmek sonra tekrar artık jel görüntüleme tarafından kontrol edin.
    6. 32P olarak etiketlenmiş astar aşağıdaki adımlarla 1.1.13 1.1.16 kurtarmak. Çözüm 1.0 μL 0.4 mL tüp içine alın ve 1 x TE arabellek 1.0 μL ~ 100.000 BGBM, radyoaktivite almak için astar sulandırmak. Arıtılmış 32P olarak etiketlenmiş astar-80 ° C'de RNA 2'-OH değişiklik tepki kadar ama en fazla 4 hafta için saklayın.
  3. Küçük molekül bağlama ve RNA 2'-OH değişiklik
    1. Dört örnekleri hazırlamak için 8 pmol RNA 0.5 x TE arabellek 32 μL içinde 1.7 mL Tüp, 2 dk ve ek-cool buz için en az 1 dk 80 ° C'de ısı ekleyin.
      Not: RNA'ın yaklaşık molekül ağırlığı hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: MW = (# üslerinin) x 340 Da.
    2. 5 x 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl2ve 500 mM NaCl içeren mix katlama 8 μL ekleyin. Aliquot 9 μL RNA karışımın içine her biri dört PCR tüpleri ve onları #1-#4 etiket. #1 Tüp, konsantre küçük molekül çözüm (% 10 DMSO) #2, içine 1 μL içine % 10 DMSO 1 μL ekleyin 1 μL seyreltilmiş küçük molekül çözüm (% 10 DMSO) içine #3 ve #4 içine su 1 μL.
    3. PCR tüpleri termal cycler 30 dk içinde 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. 2'-OH değişiklik tepki hemen önce NAI hisse senedi çözüm (2 M) 1 μL 0,5 M çalışan bir çözüm vermeye DEPC tedavi su 3 μL ile oranında seyreltin. Gecikme olmadan çözüm #1, #2 ve #3 tüpler içine çalışma Nai 1 μL ve % 25 DMSO #4 içine 1 μL ekleyin. Termal cycler 15 dakika içinde 37 ° C'de kuluçkaya.
    5. 100 μL elüsyon/bulutlu (bkz. Adım 1.1.13 tarifi için), glikojen (15 mg/mL) 2 μL mix ve sıvı her PCR tüp içinde 1.7 mL tüp içine aktarmak ekleyin. Buz gibi 200-proof alkol 0,34 mL ekleyin (3 x birim) her tüpün içine. Karıştırmak yanında vortexing 5 s ve yer için en az 1 h için-80 ° C dondurucu tüplerde.
      Not: Bu dönemde 1.5.1 adımda kullanılacak sıralama jel ayarlamaya başlayın.
    6. 14.000 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj Süpernatant RNA Pelet bozmadan kaldırın. % 80'i ekleyerek RNA Pelet yıkama alkol (tüp başına 0.5 mL), 15 s ve 20.000 x g ve 4 ° c 15 dakika santrifüj için girdap Süpernatant tekrar kaldırın.
      Not: İsteğe bağlı olarak, bir Gayger sayacı tüp istinat radyoaktif Pelet emin olmak için kullanın.
    7. 5 dk. 9 eklemek μL RNase free su için RNA Pelet kurumasına ve aşağı yukarı 10 kez pipetting karıştırın.
      Not: RNA Pelet aşırı kuru değil. Bütün yağış bu adımın sonunda çözülmüş bekleniyor.
  4. Marker hazırlık ve astar uzantısı
    1. Değiştirilmiş RNA 4 yeni PCR tüpler içine aktarmak ve onları #1-#4 olarak daha önce etiket. 2 pmol kontrol RNA DEPC tedavi su 7 μL içinde 4 ek PCR tüpleri için eklemek ve onları #5-#8 etiket. Radiolabeled astar (adım 1.2.6) 2 μL tüm sekiz tüplerde ekleyin. 65 ° c 5 min için TAV, sonra hemen aşağı 4 ° C termal cycler içinde serin için ısı.
    2. RT arabellek x 5 4 μL ekleyin (bkz. Tablo malzemeler), dithiothreitol (DTT, 0,1 M) 1 μL ve 1 μL dNTP Mix (10 mM her) her sekiz PCR tüpleri.
    3. DEPC tedavi H2O 2 μL Tüpler #1-#4 ekleyin. 4 μL ddATP (5 mM), ddTTP (5 mM) 4 μL ve ddCTP (5 mM) 4 μL tüpler içine #5-#7, sırasıyla ekleyin. DdGTP (5 mM) 1 μL ve DEPC tedavi su 3 μL tüp #8 ekleyin. Dört kez pipet karıştırmak için.
    4. Termal cycler 1 dk 52 ° C'de ısı. Ters transkriptaz 1 μL ekleyin (bkz. Tablo malzemeler), sonra yukarı ve aşağı dört kez pipetting karıştırın. 20 dk 52 ° C'de tepki kuluçkaya.
    5. 5 M NaOH 1 μL her RNA hidrolize tüpler içine ekleyin. 95 ° c 5 min için tüpler ısı.
    6. 1 M HCL 5 μL ekleyin ve etanol yağış (adım 1.3.5 ve 1.3.6), tekrar glikojen ve sıvı aktarma ihmal dışında.
      Not: Adım 1.4.6 sonuçları "tuz açık" bilinen jel ortasında yitirmesi bölgesinde atlama.
    7. 5 dk. eklemek 10 μL H2O DNA Pelet kurumasına ve 2 x 10 μL TBE-üre örnek yükleme tampon ve pipet yukarı ve aşağı redissolve için 10 kez. 5 dk. 70 ° C ısıda jel üzerine yüklemeden önce buzda tüpler yerleştirin.
  5. SAYFA Analizi
    1. Bir % 8 polyacrylamide sıralama jel hazırlamak için aşağıdaki değişiklikler ile 1.1.6-1.1.10 adımları izleyin: % 8 akrilamid çözümünü hazırlamak için 100 mL % 40 akrilamid/bisacrylamide çözeltisi (29:1) kullanın ve sıralama jel cam plakanın (Örneğin, 46 57 cm) x 0.4 mm rondela ile.
    2. 10 μL örnek--dan adım 1.4.7 yükleyin. Jel 65 2 h için veya alt boya 3/4 jel ulaşıncaya kadar W çalıştırın.
      Not: Gerekli yinelenen için-80 ° C'de örnekleri geri kalanı saklayabilirsiniz.
    3. En iyi silikonlu cam levha spacer kaldırma ve yavaşça bir spatula ekleme kaldırın. Bir parça kağıda büyük filtre jel kapsayacak şekilde yerleştirin ve nazikçe jel filtre kağıdı bağlı kalmak izin vermek için tuşuna basın. Alt ucundan başlayarak, filtre kağıdı kaldırın ve jel cam tabaktan birlikte çıkarın.
    4. Jel filtre kağıdı ile birlikte bütün jel (filtre yukarı bakacak şekilde kağıdı) karşılamak için yeterli büyüklükte plastik wrap bir parça yerleştirin. Filtre kağıdı/jel/plastik wrap sandviç bir jel Kuru filtre kağıdı yüzü aşağı bakacak şekilde aktarın.
      Uyarı: Radyoaktif malzeme kirlenmesini önlemek için 3-4 daha fazla jel sandviç arasında büyük filtre kağıt parçaları kullanın ve kurutucu jel.
    5. 70 ° c için 1 h bir vakum ile jel kuru. Jel sandviç fotoğraf ağartılmış fosfor depolama ekran kaset üzerine aktarın. 4-16 h için ekran jöleye radyoaktivite maruz.
    6. Fosfor depolama ekran bir görüntüleme aygıtı ve orta çözünürlükte (~ 30 min) ile tarama üzerine koyun.
      Not: Jel resmin üzerine bir gülümseme benzeri yapı varsa, düzeltme yazılımı (Örneğin, SAFA) yayınlanabilir kaliteli bir görüntüye işlemek için kullanın. Standart marker lane 1 nükleotit 2'-OH değişiklik şerit uzun olduğunu göz önünde bulundurun.

2. hücre içi şekil

  1. Astar tasarım
    Not: Tüp bebek şekli farklı olarak, hücre içi şekli bir ifade kaset tasarım gerekmez. Ancak, bir en uygun astar kümesi kullanılması gerektiğini ve şekil önce değerlendirilecek gerekir deneme.
    1. En az üç benzersiz astar çift bir patlama astarın tasarım aracı tarafından (Örneğin, astar-BLAST) oluşturur. Pre-mRNA insan hücrelerinde çalışmaya, astar çifti özgüllük kontrol parametreleri başvuru veritabanı olarak insan genomu (değil transcriptome) seçin. Amplicon boyutu 200-1000 base-pair (bp) aralığında seç.
    2. ~ 106 hücrelerle tedavi RNase A ve proteaz K sütun tabanlı bir spin yöntemi ile ilgi genomik DNA ayıklamak ( Tablo malzemeleri görmek ve üreticinin iletişim kuralı kullanın). Arıtılmış genomik DNA 0,1 μg/μL TE arabelleği normalleştirmek.
    3. Test PCR protokolü ile gerçekleştirilen adımlar 1.1.1 ve 1.1.2.
      Not: İstenen astar küme tek bir bant üzerinde % 1,8 özel jel verim.
  2. Hücre hazırlık ve 2'-OH değişiklik
    Not: Pre-mRNA ilgi zenginliği artırmak için bir minigene altında sitomegalovirüs (CMV) Organizatörü kurucu ifade için doğru sırada ile konak hücreleri transfected.
    1. Kültür orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x antibiyotik karışımı içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) 37 ° C'de içeren önceden ısıtmak Tohum 293T hücreleri % 50 confluency kültür orta transfection önce 24 saat. %2 orta değiştirmek FBS olmadan antibiyotik ~ 1 h transfection önce DMEM.
    2. Minigene plazmid 10 μg 100 μL ( Tablo malzemelerigörmek) indirimli serum medya 1 de bir 96-şey tabak içine ekleyin. Yukarı ve aşağı karıştırmak için dört kez çözüm pipette.
    3. Transfection reaktif 40 μL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) indirimli serum medya plaka başka bir iyi 100 μL içine. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    4. Tüm plazmid çözüm transfection reaktif süspansiyon için ekleyin. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    5. Tüm DNA eklemek / transfection reaktif karışımı orta çanağı boyunca yüzeyinde dropwise. 6-12 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    6. Orta Aspire edin ve yavaşça bir kez fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4, CaCl2 ve MgCl2, olmadan görmek Tablo reçetesi) 5 mL ile yıkayın. 3 mL tripsin çözeltisi içeren hücreleri trypsinize. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Yavaşça yemeğin altındaki hücrelerden ayırmak için çanak kesin. Tripsin kültür ortamının 6 mL ile etkisiz hale getirin. Vasıl 300 x g 4 dk santrifüj kapasitesi ve orta kaldırın.
    8. ~ 106 hücreler tepki orta 199 μL her örnek için resuspend (% 1 DMEM içinde FBS) ve hücre süspansiyon bir 96-şey tabak aktarın. Bileşik çalışma çözüm 1 μL veya DMSO 1 μL 37 ° C'de 30 dk için tüm üç denetimlerde hücrelerle kuluçkaya
      Not: Üç kontrol örnekleri-meli var olmak dahil: NAI, denatüre RNA ve NAI NAI DMSO denetimle negatif kontrol.
    9. Denaturing (DC) RNA ve NAI negatif denetimi dışında her örnek için 2 m NAI 10 μL ekleyin. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 15 dk. yavaşça sarsmak için her 5 dk hücreleri yeniden askıya plakalara 37 ° C'de kuluçkaya.
    10. Hücreleri 1.7 mL tüpler ve gecikme olmadan 2 min için 400 x g , santrifüj içine aktarın. Süpernatant hücre Pelet bozmadan kaldırın.
    11. Guanidinium thiocyanate 0.4 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). 15 için girdap homojenize s. Örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
      Not: Örnekleri-20 ° C'de sonraki adıma geçmeden kadar saklanır.
  3. RNA çıkarma
    1. Kloroform 0.2 mL her guanidinium homojenize thiocyanate örnekleri için ekleyin. 2 min için oda sıcaklığında 15 s. Incubate için girdap.
    2. 12.000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj Üst renksiz sulu tabaka RNA içerir. ~ 380 μL sulu çözüm yeni bir 1,7 mL tüp içine aktarın.
      Uyarı: Interphase kirlenmesini önlemek için rahatsız etmeyin.
    3. Alkol hacmi 1.5 x ekleyin (~ 570 μL). 15 için girdap karışımı s.
    4. 600 μL RNA karışımı bir RNA izolasyon spin-sütuna aktarmak ( Tablo malzemelerigörmek). 12.000 x g 15 s. atmak için eluent santrifüj kapasitesi. Tüm sıvı ile aynı spin sütuna geçmek için bu adımı yineleyin.
    5. Sütun RW1 arabellek 0,35 mL ile yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) iplik 15 s. 80 eklemek μL RNase free DNaz, için ben RDD arabellekte tarafından (bkz. Tablo malzeme). 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Tüm DNA kirlenme kaldırmak için önemlidir.
    6. Daha sonra sütun 0,35 mL RW1 arabelleği ve 2 x RPE arabellek 0.6 mL ile yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) iplik 15 tarafından s her adımda. Sütun bir boş koleksiyon tüp 12.000 x g 1 dk. için de spin sütunla centrifuging tarafından kuru.
    7. 32 μL RNase free su sütunu Merkezi'ne ekleyin. 1 dk. santrifüj 12.000 x g 30, kuluçkaya s ~ 30 μL arıtılmış RNA çözüm elde etmek için. Örnekleri-20 ° C'de denatüre örnek işlenirken koymak.
  4. Denatüre RNA denetim hazırlık
    1. Yer 30 µL RNA örnek DC için 1.7 mL plastik tüp buz üzerinde. Formamide 50 μL ve 300 mM HEPES (pH 8.0) içeren DC arabelleği 15 μL ekleyin ve 25 mM EDTA Tüp içine.
    2. Isı RNA 95 ° c 1 dk. hızla denatüre NAI hisse senedi çözüm (2 M), daha sonra iki kez karıştırın ve tüp Isıtma blok üzerine geri koymak için flick 5 μL ekleyin. Ek bir 1 dk. için 95 ° C'de kuluçkaya sonra hemen tüp buza koy.
    3. Guanidinium thiocyanate 0.4 mL ekleyin. Adımları 2.3.1–2.3.4 tekrarlayın.
    4. Sütun 2 x RPE arabellek 0.6 mL ile yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) iplik 15 tarafından s her adımda. Sütun bir boş koleksiyon tüp 12.000 x g 1 dk. için de spin sütunla centrifuging tarafından kuru.
    5. 32 μL RNase free su sütunu Merkezi'ne ekleyin. 1 dk. santrifüj 12.000 x g 30, kuluçkaya s ~ 30 μL kurtarılmış DC RNA çözüm elde etmek için.
  5. Astar uzantısı
    1. 0.5 μg/μL RNase free su ile içine 2.3.7 ve 2.4.5 RNA çözümden normalleştirmek. Taze 30 mM MnCl2 eriyik--dan MnCl2∙4H2O toz hazırlamak.
    2. Her örnek için RNA çözüm 9 μL bir PCR şerit aktarın. 10 mM dNTP 1 μL ve 2 mikron gene özgü astar (GSP) 1 μL her tüpte ekleyin. Pipet yukarı ve karıştırmak için dört kez aşağı. 65 ° c termal cycler 5 min için kuluçkaya ve buz koymak > 1 dak.
      Not: Alternatif olarak, rastgele bir nonamer 1 μL GSP ikame içinde kullanılabilir.
    3. Her PCR tüpte 10 RT arabellek x 2 μL karışımı ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) 30 mM MnCl2ve 2 μL 100 mm DTT 4 μL. Yukarı ve aşağı 4 x-karıştırmak için pipet. 2 dakika 42 ° C'de kuluçkaya.
    4. Ters transkriptaz 1 μL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Yukarı ve aşağı 4 x-karıştırmak için pipet. 3 h için bir termal cycler 42 ° C'de kuluçkaya.
  6. Kütüphane hazırlık ve yeni nesil sıralama
    1. DNA polimeraz 1 μL, 10 DNA polimeraz arabellek x 5 μL ekleyerek bir PCR reaksiyonu ayarlayın (bkz. Tablo malzemeler), DMSO, 1,5 μL H2O 34 μL beher-in (10 mikron), astar ve cDNA adım 2.5.4 5 μL 2 μL.
    2. Termal cycler kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: Aşama 1) 95 ° C için 2 dk; Aşama 2) 95 ° C 30 s; sahne 3) 60 ° C 30 s; Aşama 4) 30 68 ° C s; 5. aşama) döngü geri sahne 2 30 döngüleri için; Sahne 6) 68 ° C 3 dakika; ve Etap 7) aşağıdaki adım kadar 4 ° C'de tutan sonsuz.
    3. Amplicon % 1,8 özel jel kullanarak arındırmak.
      Not: PCR grup jel üzerinde tek bir bant olarak görünmesi gerekir.
    4. Kütüphanede standart parçalanma ve edebiyat6,26yılında kurulan ligasyonu yöntemlerini kullanarak oluşturun.
    5. Sıra yaklaşık 10 milyon üretmek için 1 x 75 tek taraflı kenar okuma kullanarak bir nesil sıralama ekipman üzerine örnek okur.
    6. ShapeMapper ve SuperFold yazılım kullanarak sonuçları analiz hafta tarafından geliştirilen paketleri grup26.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz daha önce modülatör Uçbirleştirme bir RNA SMN-C2, exon 7 SMN2 gene pre-mRNA üzerinde AGGAAG motifi ile etkileşim kurar ve şekil RNA yapısal değişiklikler SMN-C26huzurunda değerlendirmek için kullanılan olduğunu gösterdi. SMN-C2 bağlama sitenin FDA onaylı antianlamlı oligonükleotid (ASO) SMA, nusinersen, hangi bağlar ve intron 727,28 (Şekil 1A) intronic dikişi susturucu (ISS...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüp bebek şeklinde yüksek kaliteli homojen RNA şablonu kullanmak için önemlidir. T7 transkripsiyon, ancak, farklı yapılardaki serilerini36kez verir. Özellikle, önemsiz olmayan verimleri36 ile 3'-terminus adlı ±1 nükleotit sıralarıyla polyacrylamide jel arıtma tarafından kaldırılacak genellikle zordur. Türdeş olmayan RNA şablonu birden fazla sıralama jel bazen sonucu yorumlamak zorlaştırır astar uzantısı çarpımı profil oluşturma içinde sinyal dizi sonuçlanabilir. Ribozyme, h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser (NS094721, K.A.J.) yanında NIH R01 vermek mümkün yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
>200 bp DNA sentezi içinDNA oligonükleotidIDT
Phusion Green Hot Start II Yüksek Kaliteli PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin jel ve PCR temizleme kitiTakara740609.50
MegaScript T7 transkripsiyon kitiThermo FisherAM1333, 10x reaksiyon tamponu, T7 enzimi, NTP ve Turbo DNaz içerir
DEPC ile arıtılmış suThermo Fisher750023
2x TBE-üre numune tamponuThermo FisherLC6876
%40 akrilamid/bisakrilamid çözeltisi (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE tamponuThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow & trade; Filtre Ünitesi Thermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe boyaThermo FisherS33102
%6 TBE-üre mini jelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Yoğunlaştırıcı EkranGE SağlıkRPN1669Kalsiyum tungstat fosfor ekran
fosfor depolama ekranıMoleküler DinamikBAS-IP MS 3543 E Amersham
TayfunuGE Sağlık
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Ters TranskriptazThermo Fisher180900105x RT tamponu, SuperScript IV
dNTP karışımı (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP seti (5 mM)SigmaGE27-2045-01
büyük filtre kağıdıWhatman1001-917
Jel kurutucuHoeferGD 2000
QIAamp DNA Kan Mini KitiQiagen51104Ayrıca RNase A ve proteaz K
SMN2 minigene34Addgeneiçerir 72287
Isı ile etkisiz hale getirilmiş FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
Ca/Mg içermeyen DPBSThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini sütunQiagen74104Ayrıca RW1, RPE tamponu içerir
RNaz İçermeyen DNaz SetiQiagen79254DNaz I ve RDD tamponu
Deiyonize formamidiçerirTermo BalıkçıAM9342
MnCl2• 4H2OSigma-AldrichM3634
rastgele olmayanSigma-AldrichR7647
SuperScript Birinci İplikli Sentez SistemiThermo Fisher11904-018, 10x RT tamponu, SuperScript II ters transkriptaz
AccuPrime pfx DNA polimerazThermo Fisher12344024
NextSeq500Illuminaiçerir
Tuzdan arındırma amaçlıNucAway sütunuThermo FisherAM10070
gBlock içerir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205(2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959(2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Vitro SHAPERNA Yap sal AnaliziK k Molek l Ba lanmasSMN2 Ekzon 7Primer UzatmaPoliakrilamid Jel ElektroforeziYeni Nesil DizilemeRNA KatlanmasNAI Modifikasyonu

İlgili makaleler