Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

13.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59022

⸱

18 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Bu makalede

Özet

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Özet

Bu protokol için ultrasantrifüj ya da gelişigüzel kullanımı olmadan U937 hücrelerinin hücre altı fraksiyonları elde etmek için bir yöntem ayrıntı. Bu yöntem hipotonik arabellekleri, digitonin, mekanik lizis ve sitoplazma, mitokondri ve plazma zarı izole etmek için fark Santrifüjü kullanır. Bu işlem araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için ölçeklendirilebilir, ucuz ve basit. Bu yöntem araştırmacılar protein yerelleştirme hücrelerdeki özel santrifüjler ve ticari kitleri, bunların her ikisi de çok pahalı olabilir kullanımı olmadan belirlemek için izin verir. Biz başarıyla bu yöntemi sitozolik ayırmak için plazma zarı ve mitokondrial proteinler insan monosit hücre kültürünü U937 kullandık.

Giriş

Protein yerelleştirme güvenilir kimlik kez ökaryotik hücrelerde moleküler yolları incelerken gerekli değildir. Hücre altı fraksiyonları edinme yöntemleri ilgi hücresel bileşenleri daha yakından incelemek için araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır.

Varolan hücre ayırma yöntemleri çoğunluğu genellikle iki geniş kategoriye, deterjan tabanlı1,2 ve hangi-ebilmek var olmak ultrasantrifüj tabanlı3,4,5, ayrılır hızlı, hassas ve maliyet tarafından ayrıştırılan. Deterjan tabanlı protokolleri ile hücrenin farklı bileşenleri solubilize için deterjan gücü artan arabellek kullanımını güveniyor. Bu işleme örnekleri için hızlı ve uygun bir yöntem ve maliyet örnekleri boyutunu ve sayısını küçük iseniz etkili olabilir. Deterjan tabanlı kitleri sitoplazmik, membran/organel (karışık fraksiyonu) ve nükleer kesirler hücreleri izole etmek için satın alınabilir. Ancak, bu kitleri ile ilişkili çeşitli sakıncaları kullanışlılığı araştırmacılar için sınırı. Onlar kolayca bir veya iki bileşen hücrenin yalıtmak için tasarlanmıştır, ama aynı anda bir örnek üzerinden tüm kesirler yalıtma aciz. Plazma zarı ve organelleri membran içine eşit çözündürüldükten ki deterjan kullanımı anlamına gelir ve bu nedenle, birbirinden ayrılması için. Araştırmacılar koşulları belirli uygulamalar için değiştirmesini engelleyen bu kitleri özel bileşenler ek bir komplikasyon kaynaklanmaktadır. Son olarak, kullanım sayısı sınırlı ve daha büyük ölçekli deneyler için çok pahalı olabilir. Mitokondri yalıtım için sigara-deterjan tabanlı kitleri var, ancak, bunlar plazma zarı yalıtmak için tasarlanmamıştır ve örnek verim önemli ölçüde yoğunluğu Santrifüjü bundan daha az yalıtım protokolleri6,7 dayalı .

Ultrasantrifüj kesirler edinmek yararlanın yöntemleri vardır daha fazla zaman tüketmek, ama sık sık deterjan tabanlı kitleri daha saf kesirler sonuçlanabilir. Plazma membran hücrelerden olmadan ilk onları (kirlenme membran organelleri ile sonuçlanan) çözücü yalıtmak için ayrılması hücresel bileşenleri ile fark tarafından takip bir deterjan yöntemi tarafından lysed etmelerini gerektirir Santrifüjü — gerçekleştirmek için 100.000 × g hızına gerektiren plazma membran izolasyon ile. Birçok durumda, farklı aralıklarla isopycnic yoğunluğu degrade Santrifüjü hücresel kesirleri veya kirleticiler kaldırılması tarafından daha fazla ayrılması için izlenmesi gerekir. Bu yöntemlerin tam ve dikkatli ve değiştirilebilir olmakla birlikte, sakıncaları maliyet, zaman tüketimi ve kesirler ve daha fazla arıtma ile yoğunluk gradient Santrifüjü ayrılması için bir ultracentrifuge ihtiyacını içerir. En yüksek hızlı santrifüjler bireysel müfettişler ve are sık sık paylaşılan, akademik kurumlar ekipman çekirdek için engelleyici bir maliyeti vardır. Böylece, ultracentrifuge durumu bu durumda engelleyici olur.

Bu ayırma protokol için hücre altı fraksiyonları deterjanlar çözücü kullanımı ve yüksek hızlı Santrifüjü olmadan yalıtım göstermektedir. Bu yöntem araştırmacılar plazma zarı, mitokondri ve kesirler arasında en az kirlenme bir ökaryotik hücrenin sitoplazmik bileşenleri izole etmek için izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlayın arabellekleri ve Kimyasalları

Not: Bkz. Tablo 1.

  1. Arabellek A, lizis arabellek B, örnek arabellek ve digitonin çözümleri hazırlayın.
    1. Arabellek A NaCl 8,77 g ve 900 mL deiyonize su, HEPES (1 M, pH 7,4) 50 mL deiyonize su ile 1 m'ye son hacim ayarlamak ekleyerek hazırlayın.
      Not: 150 mM NaCl ve 50 mM HEPES son konsantrasyonları vardır.
    2. Etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, n 2 mL KCl, MgCl2, Ethylenediaminetetraacetic asit (0,5 M EDTA), 2 mL 0,19 g, 0.75 g (1 M, pH 7,4), HEPES 20 mL ekleyerek lizis arabellek B hazırlamak ', N'-tetraacetic asit (0, 5 M EGTA) , 38.26 g doz mannitol ve 23.96 g sükroz 900 mL deiyonize su için ayarlamak için 1 L son hacim deiyonize su ile.
      Not: 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol ve 70 mM sükroz son konsantrasyonları vardır.
    3. Örnek arabellek 0,01 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ekleyerek tris tamponlu tuz (TBS) 10 mL % 0,1 SDS son bir konsantrasyon için hazırlayın.
    4. Digitonin 25 mg 100 mL deiyonize su (son 250 µg/mL bölgedir) için ekleyerek digitonin stok çözeltisi hazırlamak.
    5. 4 ° C'de tüm tampon çözeltiler ve digitonin-20 ° C'de deney başlayana saklayın.
  2. Tampon çözeltiler hücreleri için ek Önce eklenecek fosfataz ve proteaz inhibitörleri taze çözümleri hazırlayın.
    1. % 100 etanol için 1 mL 17.4 mg PMSF ekleyerek phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) stok çözeltisi hazırlamak (son konsantrasyonu ise 100 mM).
      Uyarı: uygun koruyucu ekipman ve egzersiz dikkat PMSF işlerken giymek. PMSF yutulur Eğer tehlikeli ve Ciltle temas (tahriş edici), göz teması (tahriş edici) veya inhalasyon durumunda biraz tehlikeli olduğunu; gözleri ve cildi aşındırıcı.
    2. Üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan proteaz inhibitörü kokteyl (100 ×) hazırlamak ( Tablo reçetesigörmek).
    3. Sodyum orthovanadate (SOV) hisse senedi bir çözüm için 1 mL deiyonize su (son 500 mM bölgedir) SOV 92 mg ekleyerek hazırlayın.
      Uyarı: uygun koruyucu donanımları ve ele alırken dikkatli olun. SOV göz teması (tahriş edici), yenmesi veya inhalasyon durumunda zararlıdır. Şiddetli aşırı pozlama ölüme neden olabilir.

2. PBS yıkama

  1. Konsantre ve hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) ayırma önce yıkayın.
    1. Santrifüj hücre süspansiyon bir Pelet oluşturmak için uygun bir hızda. Örneğin, bir süspansiyon U937 hücre vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi.
    2. Süpernatant kaldırmak için hücre Pelet oda sıcaklığında PBS, 4 × 106 hücre/mL ve pipet yavaşça kümeleri kadar kırmak için son bir konsantrasyon içinde resuspend.
    3. Hücre süspansiyon hücre cips için 10 dakika için 400 × g , santrifüj kapasitesi.
    4. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet buz gibi bir arabellek olarak 2 × 107 hücre/mL A son bir konsantrasyon, resuspend.
      Not: Tüm sonraki adımları 4 ° C de gerçekleştirilmesi gerektiğini veya buz ve tüm arabellekleri önceden soğutulmuşolmalıdır.

3. sitozolik Protein yalıtım

  1. Kuluçka deterjan digitonin ile tarafından sitozolik protein ayıklayın.
    1. Hemen hücreleri (adım 3.1.3) resuspension önce PMSF (100 mM), proteaz inhibitörü 10 µL stokunun 10 µL ekleyin (100 ×), 2 µL stokunun SOV (500 mM) ve hisse senedi digitonin (250 µg/mL) arabelleği A 878 µL için 100 µL (son konsantrasyonları vardır 1 mM PMSF , 1 × proteaz inhibitörü, 1 mM SOV ve 25 µg/mL digitonin; Son kullanılan hücre sayısı göre ses seviyesini). Çözüm buz üzerinde ek hücre Pelet kadar tutun.
    2. Hücre süspansiyon vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
    3. Hücre Pelet inhibitörleri ve (3.1.1. adımda hazırlanan) digitonin, 2 × 107 hücre/mL, pipet yavaşça kümeleri kadar kırmak için son bir konsantrasyon içeren arabellek A çözüm resuspend.
    4. Hücre süspansiyon için 20 dk 4 ° C'de bir bitti sıra rotator üzerinde kuluçkaya.
    5. 400 × g 10 dk. toplamak için de hücre süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve bir temiz santrifüj tüpü yerleştirin.
    6. Toplanan süpernatant 18.000 × g hücresel enkaz cips için 20 dakika için de santrifüj kapasitesi.
    7. Süpernatant temiz santrifüj tüpü aktarın.
    8. Hiçbir Pelet Santrifüjü elde edilen 3.1.5 ve 3.1.6 tamamlayana dek.
    9. Sitozolik protein içeren süpernatant toplamak ve 4 ° c (kısa vadeli) veya -20 ° C (uzun vadeli) saklayın.
  2. Aşırı digitonin ve sitozolik protein Santrifüjü tarafından kaldırın.
    1. Hücre digitonin permeabilized Pelet (Kimden adım 3.1.5) arabelleği A 4 × 106 hücre/mL ve pipet yavaşça kümeleri kadar kırmak için son bir konsantrasyon, resuspend.
    2. Digitonin permeabilized hücre süspansiyon vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
      Not: Aşırı sitozolik kirletici kaldırmak için tekrar tekrar yıkar arabelleği A gerçekleştirilebilir.

4. hücre homojenizasyon

  1. Hücre lizis tampon B buz üzerinde kuluçkaya ve onları mekanik yollarla parçalayıcı.
    1. Hemen hücreleri (adım 4.1.2) resuspension önce PMSF (100 mM) stokunun 10 µL ve stok SOV (500 mM) 2 µL lizis arabellek B 988 µL için ekleyin (son konsantrasyonları 1 mM PMSF ve 1 mM SOV; lysed hücre sayısını karşılamak için son ses seviyesini) ve solu tutmak Tion buz kadar hücre Pelet için ek.
    2. Buz gibi soğuk lizis arabellek B çözüm PMSF ve SOV (4.1.1 adımda hazırlanan) 4 × 106 hücre/mL son bir konsantrasyon içeren hücre Pelet (Kimden adım 3.2.2) resuspend.
    3. Hücre süspansiyon 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    4. Yavaş, hatta konturları kullanarak homogenizer havaneli ile 40 geçer gerçekleştirmek ve buz üzerinde önceden soğutulmuş bir Dounce homogenizer (dar B havaneli ile) hücre süspansiyon transfer.
      Not: Alternatif olarak tartışma bölümünde ayrıntılı olarak mekanik hücre lizis diğer araçlar kullanmaktadır.
    5. Homogenate toplamak ve temiz santrifüj tüpü aktar.
    6. Homogenizer havaneli ve tüp lizis arabelleği B küçük hacimli (1-2 mL) ile yıkayın ve homogenate için ekleyin.
    7. Homogenate 400 × g (ya da kesilen hücreleri cips için gereken en düşük hız) santrifüj kapasitesi 10 dakikadır.
    8. Süpernatant temiz santrifüj tüpü aktarın.
      Not: önemli bir Pelet 4.1.4 4.1.6 kesir olarak verim artışı ile arasındaki adımları yineleyin kalırsa tartışma bölümünde ayrıntılı. Protokol burada duraklatıldı ve homogenate 4 ° C'de depolanan kısa vadeli (24 saat).

5. farklı aralıklarla

  1. Hücresel artıkları, ayrı tutulan mitokondri ve membran kesirler kaldırmak için hızlarını artırarak, homogenate santrifüj kapasitesi.
    1. Süpernatant (Kimden adım 4.1.8) vasıl 500 × g için 10 dk. Transfer süpernatant temiz santrifüj tüpü için santrifüj kapasitesi ve herhangi bir Pelet atın.
    2. 1000 × g 10 dk. Transfer için de (Kimden adım 5.1.1) süpernatant süpernatant temiz santrifüj tüpü için santrifüj kapasitesi ve herhangi bir Pelet atın.
    3. Süpernatant (Kimden adım 5.1.2) vasıl 2000 × g 10 dk. Transfer süpernatant temiz santrifüj tüpü için santrifüj kapasitesi ve herhangi bir Pelet atın.
    4. Süpernatant (Kimden adım 5.1.3) 4.000 × g 15 dk. Transfer süpernatant için de bir temiz santrifüj tüpü, mitokondri içeren pelet tutmak için santrifüj kapasitesi.
    5. Mitokondri Pelet lizis arabellek B. bir küçük hacminde (0.5\u20121 mL) resuspend
    6. 4.000 × g 15 dk. Kaldır, askıya alınan Pelet süpernatant ve resuspend santrifüj kapasitesi mitokondrial Pelet örnek arabellek (Örneğin, Pelet boyutuna bağlı olarak ve istenen 250-500 µL, istenen son hacmine konsantrasyon).
    7. 15 dakika süreyle santrifüj (Kimden adım 5.1.4) 4.000 × g de süpernatant temiz santrifüj tüpü süpernatant aktarın. Hiçbir Pelet Santrifüjü elde edilir kadar bu adımı yineleyin.
    8. Süpernatant 18.000 × g 3 h için de spin.
    9. Süpernatant kaldırın ve zar proteinleri içeren pelet tutun. Membran Pelet küçük bir birim resuspend (0.5-1 mL) B. lizis tampon
    10. 18.000 × g 1 h için de askıya alınmış Pelet santrifüj kapasitesi.
    11. Süpernatant kaldırmak ve istenen son hacim örnek arabelleği (250-500 µL, pelet ve istenen konsantrasyon boyutuna bağlı olarak) membran Pelet resuspend.
  2. Örnek granül 3 için solüsyon içeren temizleyicide s 5 güç ayarı, bir buz banyosu içinde (125 W maksimum güç 20 kHz, % 50'si bkz: Malzemeler tablo).
  3. Örnekleri 4 ° c (kısa vadeli) veya -20 ° C (uzun vadeli) depolar.
  4. Ayırma saflığı için hücre sitoplazma, mitokondri ve membran bölmeleri bulundu protein işaretleri karşı antikor kullanan bir Batı leke gerçekleştirerek incelemek (temsilcisi sonuçları bölümüne bakın).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farklılaşmamış U9378 hücre süspansiyon yetiştirilen başarılı ayırma yukarıda ayrıntılı ve Şekil 1' de gösterilmiştir iletişim kuralını kullanarak başarılı oldu. Bu yöntem ile elde edilen örnekler polivinilidin florid (PVDF) membran için ıslak aktarma yöntemini kullanan western Blot9 tabi tutuldu. Membran daha sonra karşı antikor ile probed sitoplazmik, mitokondri ve membran lokalize protein işaretleri (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim kuralı gelişimi mitokondrial ayırmak için bir yetersizlik ve protein yerelleştirme necroptosis14sırasında çözümlenmesi için piyasada kitleri kullanarak membran örnekleri ortaya çıktı. Birincil hazır kitleri bireysel araştırmacılar, ihtiyaçlarına adapte için kendi yetersizlik onların başına maliyet örnek ve sınırlı sayıda örnekleri işlenmesi mümkün sınırlamalardır. Burada sunulan Yöntem pahalı reaktifler kullanılmadan ve pahalı ekipman için zorunluluk olmadan gerçekleştirilebilir. Bu yö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan

Teşekkürler

İş NIH-1R15HL135675-01 Timothy J. LaRocca tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sitoplazma Ekstraksiyonu içinDigitoninTCI KimyasallarıD0540
Lizis tamponu içinD-MannitolSigma-AldrichM4125
B Dounce homojenizatörVWR22877-282Homojenizasyon için uçtan
uca döndürücüBarnsteadN/ASitoplazma Ekstraksiyonu için
etilen glikol-bis (β -aminoetil eter) -N, N, N' ,N'-tetraasetik asit (EGTA)Alfa AesarJ61721Lizis tamponu B için
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-AldrichE7889Lizis tamponu B için
GAPDH (14C10)Hücre Sinyalleme Teknolojileri2118Western blot üzerindeki sitoplazmik fraksiyonların tespiti için, seyreltme: 1:10000
HEPESVWRJ848Lysis tamponları A ve B için
Lizis tamponu B içinKClSigma-AldrichP9541
MgCl2Alfa Aesar12315Lizis tamponu B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri23565Western blot üzerindeki plazma membran fraksiyonlarının tespiti için, seyreltme: 1:1000
NaClLysis tamponu A için Sigma-Aldrich793566
fenilmetansülfonil florür (PMSF), VWRSitoplazma Ekstraksiyonu ve Homojenizasyon içinM145
prob sonikatörüQsonicaQ125-110Son Numuneler için
Proteaz İnhibitörü Kokteyli, Genel KullanımVWRM221-1MLSitoplazma Ekstraksiyonu
için soğutmalı santrifüjBeckman-CoulterN/A
Sodyum dodesil sülfat (SDS)Numune tamponu
sodyum ortovanadat (SOV)Lizis tamponları A ve B içinSigma-Aldrich450243
Lizis tamponu B içinSükrozSigma-AldrichS0389
Tris-tamponlu Salin (TBS)VWR788Örnek tamponu
VDAC için (D73D12)Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri4661Batı blünde mitokondriyal fraksiyonların tespiti için, seyreltme: 1:1000
için Tampon için VWR 227

Kaynaklar

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  2. Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
  4. Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
  5. Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
  6. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  7. Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
  8. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  9. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  10. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  11. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  12. Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
  13. Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
  14. McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55(2018).
  15. Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hipotonik TamponDigitonin LizisDiferansiyel Santrif jasyonSitoplazma zolasyonuMitokondri zolasyonuPlazma Membran zolasyonuProtein LokalizasyonuSubsel ler Fraksiyonlar
Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.