Yöntem makalesi

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

10.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59025

⸱

26 Ocak 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Özet

Solunum sinsisyal virüs özgü nötralize antikorlar (RSV yakalar) RSV karşı koruma önemli bir işaret vardır. Bu nedenle farklı tahlil biçimleri bir dizi şu anda dünya çapında bir ihtiyaç RSV yakalar ölçmek için doğru ve yüksek işlem hacmi bir yöntem için kullanılmaktadır. Biz burada RSV alt grubu A test edilmiş ve aynı zamanda RSV alt grubu B ve farklı örnek türleri için adapte edilebilir bir görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil açıklayın. Bu yöntem son derece az % 10 varlık başvuru anti-serum arası tahlil varyasyon ile tekrarlanabilir. Bizce bu tahlil nispeten düşük maliyetle dünya çapında birçok laboratuarlarında kolayca kurulabilir. Gelişme RSV yakalar ölçer bir geliştirilmiş, yüksek üretilen iş testin yanı sıra roman RSV aşısı adayların değerlendirilmesi için gelecekte kritik bu yöntem Uluslararası Standardizasyon için önemli bir adım gösterir.

Giriş

Respiratuvar sinsisyal virüs (RSV) alt solunum yolu enfeksiyonları Pediatrik popülasyon dünya çapında1önde gelen nedenidir. Onun yüksek yük rağmen hala hiçbir aşı veya tedavi kullanılabilen bulunmamaktadır. 2013 yılından bu yana, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) RSV aşısı geliştirme yıllık WHO istişare toplantıları2,3ile bir büyük araştırma öncelik olarak ilan etti. WHO Bu koruma4büyük serolojik marker olarak tanınan olarak aşı immünojenisite, izlemek için antikor (NAb) ölçüm nötralize RSV kullanarak kabul etti. NAbs ağır RSV enfeksiyonu yanı sıra anti-RSV monoklonal antikor palivizumab, şu anda sadece profilaktik strateji kullanılabilir4klinik çalışmalar bir dizi karşı korumak için göstermiştir.

Birden çok NAb tahlil laboratuvarları tarafından Dünya çapında,5,6,7,8zorlu standartlaştırma çabaları yapmış hücre ve moleküler tabanlı deneyleri de dahil olmak üzere kullanılan biçimi vardır. Ancak, bir RSV özgü antikor varlığı ile sınırlı plak oluşturan birimler (PFU) sayısını ölçer geleneksel plak-azaltma nötralizasyon (PRN) tahlil hala altın standart9kalır. Burada, çok sayıda hücre satırlarında ile artan tahlil geçerek ve farklı RSV suşları için kullanılabilir bir geliştirilmiş, Basitleştirilmiş ve yüksek işlem hacmi PRN Protokolü raporu. Bu iletişim kuralı klinik numuneleri farklı ayarlar yanı sıra hayvan modeli deneyler örnekleri Tarih kullanılarak test edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Tüm adımları BSL2 mahallede başka türlü belirtilmediği sürece yapılması gerekiyor. Viral titrasyon öncesinde bir PRN tahlil PRN assay olarak kullanılan en uygun RSV konsantrasyonu belirlemek için gereklidir. Bu virüs stokları bir kez çözdürülen ve her NAb tahlil için kullanılan küçük bir hacim içinde aliquot için tavsiye edilir. Bir çalışmada tüm örnekleri için gerçekleştirilen tüm NAb deneyleri için aynı viral stok kullanılması da önerilir. Kültür Medya ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ısındı 37 ° C'de hücre plakaları için eklemeden önce emin olun.

1. RSV Viral titrasyon

Not: Virüs hisse senedi sayısı ve yineleme sayısı bağlı olarak tahlil plaka Şekil 1göre ayarlanabilir. Her virüs hissenin nüsha en viral yoğun (yani, 1:10) başlayan tahlil plaka aşağı titre. Seri titrations-ebilmek var olmak genellikle 1:10. A549 hücre kültürü ve bakım gibi RSV kültür yordamı yapılır standart prosedürler kullanarak ve bu protokol için dahil değildir.

  1. Tabak (gün 1) tohum
    1. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) + % 10 fetal buzağı serum (FCS) + 1000 IU penisilin/streptomisin (kalem/strep), 4 x 105/mL A549 hücrelerde resuspend. Tohum 96-şey düz-alt 100 μL/iyi 4 x 104 A459 hücreleri içeren steril pilakalar.
    2. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2 tabak kuluçkaya (hücreleri log fazı büyüme olacak).
      Not: Yeni A549 hücre şişe sonra 23 geçişleri kullanın. Yeni bir hücre şişe hala ilk üç pasajlar olduğunda bu deneyler değil başlatmak için tavsiye edilir.
  2. Virüs enfeksiyonu (2 gün)
    1. Virüs seri seyreltme hazırlanması
      1. Hızla RSV tek bir donmuş şişe kadar neredeyse tamamen çözdürülen ve hemen buza koyun bir 37 ° C su banyosu içinde çözülme. 3 çoğaltır her RSV için virüs hisse senedi denetlesinler, bir ilk virüs hisse senedi seyreltme 1:10 seyreltilmiş virüs/iyi 100 μL ile kullanmak ve negatif kontrol için en az bir sütun ayırmak için hazır olun.
        Not: Şekil 1 negatif kontrol triplicates içinde gösterir.
      2. 1:10 satır bir 96-şey U-Alt A nüsha olarak seyreltilmiş her virüs 100 μL eklemek steril plaka. 90 μL/iyi DMEM + 1000 IU kalem/strep FCS olmadan H. B satırlarına ekleyin
      3. Seri 1:10 gerçekleştirmek dilutions aşağı satır B. Mix çözüm yukarı ve aşağı 5 kez pipetting içeriğe göre satır ve her son hacim de 90 μL böylece satır H. atma son 10 μL kadar panolarında dilutions devam etmek için A'den 10 μL aktarma tarafından plaka.
        Not: Her seyreltme için yeni ipuçları kullanmak önemlidir.
    2. Virüs aşısı A549 hücrelere
      1. A549 cell plate(s) önceki güne hazır almak. A549 hücre monolayers 96-şey tabak içinde ~ %80 birleşmesi olduğundan emin olun. Yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havluda Blot tarafından medya atmak.
      2. Bütün wells PBS 100 μL ile iki kez yıkayın, yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havlu üzerinde sonra her yıkama kurutma tarafından aşırı PBS atın. Tabak kuru izin vermez.
      3. Virüs dilutions viral titrasyon plaka (Şekil 1) karşılık gelen wells için A549 hücre tabağa aktarın. 1 h 37 ° c, % 5 CO2plaka kuluçkaya. 1 h kuluçka sonra dikkatle boşaltmak bir pipet (çapraz bulaşma için) kullanarak supernatants. 90 μL/iyi al.
      4. 1 x orta 199 100 μL ekleyin (M199, tablo malzemeleri görmek) + % 1.5 Ġnsan sodyum tuzu (CMC) düşük viskozite + % 2 FCS kalem/strep her de içeren.
        Not: 2 x M199 + % 4 FCS + % 2 kalem/strep ve % 3 CMC çözümleri önceden hazırlanmış ve ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolanan gerekir. Çözüm 37 ° C'de plakaları için eklemeden önce ısındı emin olun.
        1. 2 x M199 çözüm hazırlamak: 1 poşet/500 mL distile su + 20 mL FCS + 10 mL kalem/strep (2 yukarı yapmak için x MI99). 0,22 mikron filtre birimini kullanarak çözüm filtre.
        2. 3 hazırlanması için % CMC, CMC 15 bin 500 mL distile su içine yavaş yavaş ekleyin. CMC suda 50 ° C, 1 h hazırlık alır metalik karıştırıcı ısıtıcı kullanarak geçiyoruz. Mix 3 yapmak için % CMC ve otoklav çözüm.
          Not: CMC katı su çözünmüş eklenmelidir; Kuru katı su ekleyerek çözülmeye zordur katı bir "yığın" üretir.
        3. 1 x M199 + % 1.5 CMC düşük viskozite hazırlamak + % 2 FCS kalem/karıştırma tarafından strep 1:1 içeren 2 x M199 ve % 3 CMC adım 1.2.2.4.2 hazır.
      5. Plaka 37 ° c, % 5 CO23 gün kuluçkaya.
  3. Gelişmekte olan tahlil plaka ve analiz (5 gün)
    1. Fiksasyon ve gelişmekte olan tahlil plaka
      1. M199 + CMC + % 2 FCS içeren kalem/strep yavaşça plaka ters çevirme tarafından atmak. Yavaş yavaş ekleyin (önlemek için hücre katmanı rahatsız) 200 μL fiksasyon arabelleği (% 80 aseton, % 20 PBS,-20 ° C'de depolanan) hücreleri düzeltmek için. -20 ° c 20 dk için kuluçkaya.
      2. Fiksasyon arabellek atmak ve yavaşça emici kağıt havlu üzerinde leke. Plaka yüz bırakın 10 dakika kuru aşağı.
        Not: Bu adıma itibaren tahlil dışında BSL2 hood gerçekleştirilebilir.
      3. Polysorbate %20 5 süt % 0.05 içeren filtre uygulanmış PBS Dilüent engelleme çözüm hazırlamak (PBS-polysorbate, Tablo malzemelerigörmek). Bir tabak için engelleme 200/iyi ve 110 wells tabanlı için gerekli hacim hesaplamak: 200/iyi x 110 kuyu 22 mL = (1.1 mL konsantre süt 20.9 mL Dilüent filtre PBS-polysorbate). Bu aşamada, aynı zamanda birincil ve ikincil antikorları için yeterli engelleme çözüm oluşturur. Bir tabak için 50/iyi ve 110 wells dayalı her antikor çözüm için gerekli hacim hesaplamak: 50/iyi x 110 wells 5.5 mL =. Bu nedenle, bir tek plaka tayini için gerekli çözüm engelleme süt seyreltici hacmi 33 ml'dir.
      4. 200 /well engelleme çözüm ekleyin. Plaka (RT) Oda sıcaklığında 30 dk. atma için çözüm yavaşça plaka ters çevirme tarafından kuluçkaya ve emici kağıt havlu üzerinde leke.
      5. 1:500 keçi X RSV antikor (mAb-birincil antikor) çözüm engelleme seyreltilmiş hazırlayın. 50 /well mAb çözüm ekleyin ve 1 h. 3 kez ile filtre uygulanmış PBS-polysorbate yıkama plaka için 37 ° C'de kuluçkaya.
      6. 1:5,000 Alexa Fluor eşek Anti-keçi IgG (ikincil antikor) çözüm engelleme seyreltilmiş hazırlayın. 50 /well ikincil antikor çözüm ekleyin ve 1 h. 5 kere ile filtre uygulanmış PBS-polysorbate yıkama plaka için 37 ° C'de kuluçkaya.
      7. Plaka üzerinde floresein isothiocyanate (FITC) kanal kullanarak bir otomatik noktalar okuyucu okumak ve Şekil 2' de gösterildiği gibi ayarları say. Plaka folyo sarın ve 4 ° C'de depolayın Bir kullanılmayan 96-şey kültür plaka kullanarak ve tahlil önce sayısı ayarları giren cihazda kalibre.
        Not: Bir kaç gün içinde yeniden tarama gerekirse mümkündür. Kalibrasyon ve sayısı ayar kaydedilir ve plaka kalibrasyon için kullanılan aynı tür tahlil kullanıyorsa, gelecekteki taranmasında kullanılır.
      8. Kuyular için yapay doku plaklar veya kesintiye hücre monolayers (Şekil 3) görüntülerini kontrol edin. Wells ile kesintiye hücre monolayers hariç.
        Not: Yapay doku plaklar büyüklüğüne, el ile sayıları bu kuyular için yapılması gerekebilir ya bu wells veri analizi atılmak üzere gerekebilir. Geçerli bir sonuç için ölçüt içinde birden fazla çoğaltma de tespit kesintiye hücre monolayer veya yapay doku plak yok ve hiçbir PFU negatif Wells (kuyu eklenen virüs olmadan) tespit içerir.
    2. Viral konsantrasyonu belirlemek
      1. Nerede noktalar açıkça sayılabilir son iki dilutions seçin. Noktalar aynı seyreltme, Çoğalt kuyulardan ortalama sayısını hesaplayın. Aşağıdaki formül kullanarak hisse senedi örnek viral titresi (PFU mL başına) Hesapla:
        PFU/mL = plaklar ortalama sayısı / (seyreltme faktörü × seyreltilmiş virüs hacmi kuyuya ekledi)
        Not: her RSV hisse senedi için belirlenen virüs konsantrasyon şimdi PRN tahlil (adım 2) kullanılabilir.

2. RSV nötralizasyon tahlil

  1. Tabak (gün 1) tohum
    1. A549 hücre DMEM + % 10 FCS + 1000 IU kalem/strep 4 x 105/mL de resuspend. Tohum 96-şey düz-alt steril pilakalar ve 100 μL/iyi 4 x 104 A459 içeren hücreleri ve gecede, 37 ° C, % 5 CO2 tabak kuluçkaya (hücreleri log fazı büyüme olacak).
      Not: Yeni A549 hücre şişe sonra 23 geçişleri kullanın. Bu geçiş sayısı 3 önce A549 hücreleri kullanmak için tavsiye edilmez.
  2. Virüs ve serum hazırlık (2 gün)
    Not: Örnek türüne bağlı olarak, NAb tahlil önce ön işleme örnekleri için gereken adımlar vardır. Şimdi biyolojik standartları ve denetimleri (NIBSC) için Ulusal Enstitüsü'nden talep üzerine mevcuttur RSV uluslararası standart sera kullanılması önerilir.
    1. Serum seyreltme hazırlanması
      1. İnsan RSV başvuru anti-serum (başvuru serum, REF) çözülme ve serum örnekleri serum numuneleri RT. ısı devre dışı bırakabilirsiniz, test ve anti-serum kullanmadan 30 dk önce için 56 ° C'de bir su banyosunda başvuru. Dilutions plaka şablonu (Şekil 4) göre hazırlayın.
      2. 1: 100 seyreltme REF. hazırla, seyreltilmiş DMEM + kalem/strep tahlil plaka başına FCS olmadan REF 110 μL en az hazırlamak (örneğin, REF 1,5 μL toplam hacmine 150 μL). 1: 100 110 μL seyreltilmiş bir 96-şey U-Bottom iyi A12 REF eklemek steril plaka.
      3. DMEM + kalem/strep FCS olmadan 55 μL wells B12 H12 için sütun 12 ekleyin. Seri 1:2 dilutions plaka aşağı 55 μL A satırdan satıra B aktarma, yukarı ve aşağı 5 kez pipetting içeriğe göre çözüm karıştırma ve her son hacim de 55 μL böylece satır H. atma kadar medya son 55 μL devam etmeden gerçekleştirin. Yeni ipuçları her seyreltme için kullanın.
      4. 1: 100 seyreltme serum test örnekleri hazırlayın. Tüm serum numuneleri nüsha denetlesinler gibi 3 = 330 x 110 μL/iyi bir en küçük birim hazırlamak μL serum testi örnek başına.
      5. Her seyreltik serum test örneği (1: 100; 110 μL Ekle S1 = serum 1, S2 = serum 2, vs.) karşılık gelen wells için A1 ile A9 ve E1 E9 Şekil 4göre 96-şey steril plaka için.
      6. DMEM 55 μL Ekle + kalem/strep bütün wells için FCS olmadan X. Perform seri başı olarak adım 2.2.1.3 1:2 dilutions kadar satır D (örnek 1, 2 ve 3 için) etiketli. Böylece her şey son hacim 55 μL medya son 55 μL atmak. Benzer şekilde, belgili tanımlık seri halinde 1:2 dilutions örnekleri 4, 5 ve 6 satırları E H. için gerçekleştirmek
        Not: Her seyreltme için yeni ipuçları kullanmak önemlidir.
      7. DMEM + kalem/strep FCS olmadan 55 μL wells için yapılan 10 ve 11 sütun ekleyin.
    2. Virüs hazırlanması
      1. Hızla RSV tek bir donmuş şişe kadar neredeyse tamamen çözdürülen ve hemen buza koyun bir 37 ° C su banyosu içinde çözülme.
      2. 1.3.2. adımda belirlenen RSV aliquot konsantrasyonu dayalı FCS olmadan virüs DMEM + kalem/strep sulandırmak. Yaklaşık 200 PFU/iyi verir bir seyreltme uygulanır. Toplam hacmi 5.5 mL (100 kuyular için) hazırlayın.
    3. Virüs-serum karışımı hazırlanması
      1. Sütun 1-9 bütün wells ve wells, 10 ve 11 (pozitif kontrol) plaka şablonu (Şekil 4) göre sütunların satır E-H 55 seyreltilmiş şunun ekleyin.
      2. 55 DMEM + kalem/strep FCS olmadan tüm satırları sütunlar 10 ve 11 (negatif kontrol) A-D wells için ekleyin. 1 h 37 ° c, % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    4. Virüs aşısı A549 hücrelere
      1. Kuluçka süresi tamamlanmadan önce 2.1.1. adımda hazırlanan A549 cell plate(s) almak. A549 hücre monolayers 96-şey tabak içinde ~ %80 birleşmesi olduğundan emin olun.
      2. Yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havluda Blot tarafından medya atmak. Bütün wells PBS 100 μL ile iki kez yıkayın, yavaşça plaka ters çevirme ve hafifçe steril emici kağıt havlu üzerinde sonra her yıkama kurutma tarafından aşırı PBS atın. Tabak kuru izin vermez.
      3. Virüs-serum karışımı 100 /well A549 hücre Incubate 1 h 37 ° c, % 5 CO2plaka plaka şablonu takip plaka üzerinde karşılık gelen wells aktarın.
      4. Bir pipet kullanarak 1 h 90/iyi çıkar ve ekledikten sonra 100, 1 x M199 + %1,5 CMC + % 2 FCS + kalem/strep prewarmed. Plaka 37 ° c, % 5 CO23 gün kuluçkaya.
        Not: Çözüm 37 ° C'de plakaları için eklemeden önce ısındı emin olun.
  3. Gelişmekte olan tahlil plaka ve analiz (5 gün)
    1. Fiksasyon ve tahlil plaka aşağıdaki adımları 1.3.1.1-1.3.1.8 geliştirmek.
    2. % 50 nötralizasyon titresi belirlemek
      1. Hesaplayarak % 50 nötralizasyon titresi orantılı uzaklığı arasında karşılıklı serum dilutions yukarıdaki ve 'serum' denetiminin % 50'in altında Kuyu yapımı (pozitif virüs denetimi - sütun 10, satır E-H) belirlemek.
      2. PFU (yani, plaklar) saymak serum wells ve hiçbir serum denetim wells bireysel viral enfeksiyonlar kaynaklanan. PFU yok serum denetim Wells ortalama sayısını hesaplamak ve % 50 değerini belirlemek.
      3. Serum dilutions hemen üstündeki ve altındaki hiçbir serum denetim wells % 50 değerini olan sayıları ile tanımlayın. Bir yarı oturum grafik veya elektronik tablo şablonu kullanarak, PFU sayısına (doğrusal ölçek) x ekseni ve y ekseni (günlük10 ölçek) üzerinde karşılıklı serum seyreltme arsa. İki nokta arasında bir çizgi çizmenizi ve % 50 nötralizasyon titreleri test serum numuneleri bu satırından okuyun.
        Not: RSV PRN tahlil çalışma sayfası (Ek çalışma) % 50 nötralizasyon titresi belirlemek için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir virüs hisse senedi titrasyon 1:10 1:10 gerçekleştirilen8 seyreltme PRN tahlil ( Şekil 5' te gösterilen temsilcisi sonuçları) önce virüs hisse senedi konsantrasyonu belirlemek için. Şekil 5, PFU güvenilir 1:10 dilutions sayabiliriz4 ve 1:105. PFU aynı seyreltme, ineklemek kuyulardan ortalama sayısı hesaplanır. Noktalar 1:105 seyreltme 14 oldu ortalama sayısı beri bu viral stok viral ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz geliştirdik ve çoğu laboratuvarlarında kolayca uyarlanabilir bir basit ve etkili RSV mikro-nötralizasyon tahlil en iyi duruma getirilmiş. Bu tahlil viral enfeksiyon yeteneği hem de viral enfeksiyon NAb bilgisayarlı görüntü tarama kullanarak hücresel düzeyde tarafından inhibisyonu ölçme ölçmek yapabiliyor. Bir görüntüleme tabanlı platform ve belirli antikor tabanlı sistemler özgüllük ve geleneksel plak algılama yöntemleri6,7' ye göre nokta algılama hassasiyeti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar dahil tüm katılımcılara teşekkür ederim. Victoria Hükümeti'nın operasyonel altyapı destek programı anıyoruz. PVL NHMRC kariyer geliştirme bursu alıcı olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Hücre hattı
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Queensland Üniversitesi'nden Dr Keith Chappell tarafından sağlanan
Viral suşlar
RSV A2ATCCVR-1540lot numarası 60430286
Reaktifler
AsetonMerck1000142511
Alexa-Fluor eşek anti-keçi IgG (4 &°C'de saklanır; C)Life TechnologiesA11055
CMC sodyum tuzu tozuSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (serum yok, 3.7 g / L NaHC, P / S) (4 &°C'de saklanır; C)Bilimsel Hizmetler – Doku KültürüMCRI ev içi tedarik
Fetal buzağı Serumu (-20 ° C'de 50 mL alikotlarda saklanır; C)InterpathSFBS-F
Keçi X RSV antikoruMerckAB1128
insan poliklonal antiserumu solunum sinsityal virüsüne (RSV) (45 & mikro; L alikotları -20 & derece; C)BEI KaynaklarıNR-4022Kayıt sırasında BEI Kaynakları aracılığıyla ücretsiz sipariş. Bu serum, RSV (NR-32832) M199 tozuna karşı bir insan antiserumu ve immün globulin paneline aittir
Yaşam Teknolojileri31100035
Süt seyreltici bloke edici çözelti (4 ° C'de saklanır; C)Avustralya Biosearch50-82-01
Penisilin / Streptomisin (-20 ° C'de 6 mL alikotlarda saklanır; C)Life Technologies15140122
s.d.H2O, Milli-Q dağıtıcısındanMerck: Kurum içi dağıtım,
Kültür için steril 1x PBS (4 &°C'de saklanır; C)Bilimsel Hizmetler – Doku Kültürü MCRIev içi tedarik
Tween 20 polisorbatSigma-Aldrich9005-64-5
Genel Sarf Malzemeleri< / güçlü>
Konik Falcon tüpleri (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filtre ünitesi 0.22 &; m (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Steril Eppendorf tüpleri (1,5 mL)Avustralya PLAM12400
Steril düz tabanlı plakalar (96 oyuklu kapaklı)Interpath655180
Steril U-tabanlı plakalar (96 oyuklu kapaklı)Interpath650180
5 mL serolojik pipetSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serolojik pipetInterpath607180
25 mL serolojik pipetSigma-AldrichCLS4251-200EA
Uçlu Pipet 1-200 & mikro; L Şeffaf Maxymum Kurtarma Raflı Önceden Sterilize Edilmiş 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Uçlu Pipet 5-20 & L Şeffaf Maxymum Kurtarma Raflı Önceden Sterilize Edilmiş 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Uçlu Pipet 100-1.000 & LClear Maxymum Recovery Racked Önceden sterilize edilmiş 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher Biotec BiotecTF-1000-L-R-S
Uçlu Pipet 1-10 & L Clear Maxymum Recovery Racked Önceden sterilize edilmiş 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Ekipmanlar ve yazılımlar
ELISpot okuyucu sistemiAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Almanya
AID ELISpot yazılım sürümü 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Almanya
Microsoft Excel 2007
A549 ATCC CCL-185. (İngilizce)

Kaynaklar

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84(2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253(2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195(2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576(2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RSV N tralizasyon DeneyiG r nt leme Tabanl DeneyRSV Alt Grup ARSV Alt Grup BSerum Dil syonuVir s Stok Haz rlamaPlak Azalma DeneyiOtomatik Spot OkuyucuYar Logaritmik Grafik Analizi

İlgili makaleler