Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

7.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59043

⸱

16 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

Bu makalede

Özet

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Özet

Son derece aktif bağışıklık hücreleri doku birikimi ezici çeşitli kronik inflamatuar hastalıklar damgasını temsil eder ve çekici bir terapötik hedef etkilenen hastaların klinik yönetim olarak ortaya çıktı. Daha fazla patolojik olarak dengesiz doku infiltrasyonu pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri tedavi düzenlenmesi nişan stratejileri iyileştirmek amacıyla bu gelişmiş anlayışlar içine hastalık ve organ özel ulaşmak için özellikle önem olacak Periferik lenfositler izleme özellikleri. Burada açıklanan deneysel protokol fluorescently etiketli ve adoptively transfer edilen insan lenfosit bağlamında papain kaynaklı akciğer iltihabı, akciğer birikimi izlemek için izin verir. Bağışıklık hücre göç ve kemotaksisi analizi için sık kullanılan standart tüp bebek deneyleri aksine şimdi tanıtılan içinde vivo hesap akciğer özgü yönlerini doku organizasyon ve karmaşık inflamatuar etkisi çıkar canlı fare organizma meydana senaryo. Ayrıca, üç boyutlu kesit ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme sadece Nicel veri bağışıklık hücrelerinin infiltre sağlamaz ama aynı zamanda bağışıklık hücre yerelleştirme iltihaplanmış akciğer içinde desen gösteriyor. Genel olarak, biz yüksek değeri sağlanan adım adım iletişim kuralı takip ederek kolayca uygulanabilir kronik inflamatuar akciğer hastalıkları alanında immünolojik araştırma için yeni bir teknik tanıtmak edebiliyoruz.

Giriş

Klasik enflamatuar bozuklukları gibi Alerjik astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akciğerin Akciğer doku1,2aktive lenfositler artan bir işe tarafından yönlendirilmesi için bilinen. Lenfosit yayımlanan sitokinler (örneğin, Il-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN γ ve TNF-α) daha fazla kemotaksisi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücrelerinin desteklemek, fibrotik hava yolu remodeling teşvik veya doğrudan zarar akciğer parankimi2. Şimdiye kadar akciğer dokusu içinde lenfositler patolojik birikimi sorumlu temel mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılır değil. Gut ve cilt giriş için açıklanan doku-seçici T hücre sürecinden için cümle içinde pulmoner dendritik hücreler (DC) üzerinde Periferik T hücre için tercihli akciğer infiltrasyonu, en azından kısmen CCR4 ifade indüksiyon yoluyla Başbakan belli ki edebiliyoruz yüzey lenfositler3. CCR4 yanı sıra, hava yolu infiltre T hücreleri da Kemokin reseptörlerinin CCR5 ve CXCR3 T hücrelerinin periferik kan1,4,5içinde karşılaştırıldığında özellikle artan bir ifade ile karakterizedir. Genel olarak, varolan veri akciğer posta fizyolojik veya inflamatuar koşullar altında T lenfositlerin farklı Kemokin reseptörleri ve onların anılan sıraya göre ligandlar, içerir ve bu nedenle en önemlisi üzerinde bağlıdır konsepti ile tutarlı bir yakından Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri1arasında işbirliği kontrol. Özellikle, patojen veya alerjen pozlama başlangıç aşamasında TLR stimülasyon veya derhal serbest bırakılmasını LTB4, CCL1, CCL17 gibi farklı chemoattractants tarafından IgE aracılıklı cross-linking doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin yanıt, CCL22, CCL20, CXCL10 ve PGD21,6,7. Bir ilk örnek olarak PGD2 chemoattractant reseptör etkileşimini CRTh2 kemotaksisi Th2 hücrelerinin için özel öneme sahip olduğu bilinmektedir ve böylece astım klinik yönetim olarak umut verici terapötik hedef ortaya çıktı. Gerçekten de, orta astımı olan hastaların bir iyileşme belirtileri ve tedavi sonrası bir saniye (FEV1) zorunlu Ekspiratuar hacminin önemli bir artış ile plasebo grubu8 ' e göre bir seçici CRTh2 antagonisti gösterdi ,9. Bir daha ilerledi inflamatuar yanıt, zaten işe T hücreleri daha da pulmoner lenfosit birikimi yolu ile belgili tanımlık serbest bırakmak Il-4 ve IL-13 olarak güçlü bir çekim gücü pulmoner DCs için yükseltmek mümkün durumdadır. Daha sonra bu elde edilen Miyeloid doğuştan gelen hücreler yukarı-CCL17 ve CCL22 ifade STAT6 bağlı bir şekilde1,10,11düzenler.  Açıklanan senaryo karmaşıklığı hala T hücre akciğer homing tam bir anlayış engel rağmen enflamatuar veya Alerjik göğüs hastalıkları potansiyel olarak en iyi duruma getirilmiş bir tedavi kontrolü için moleküler hedeflerin bir bolluk sunmaktadır. Bu nedenle, daha da derinleştirmek ve bilgimizi T hücre kemotaksisi ve akciğer posta alanında tamamlayıcı edebiliyoruz yenilikçi deneysel teknikleri acil ihtiyaç yoktur.

Akciğer posta lenfositler insan vücudu içinde birden çok hücresel, humoral ve fiziksel parametrelerini1tarafından etkilenir nedeniyle gerçeğini, varolan deneysel yöntemlerin çoğu immünolojik bu işlem tüm karmaşıklığına modellemek mümkün değildir. Bunun yerine, seçmeli olarak homing akciğer analizi için birçok standart protokolleri belirli bir yönü lenfosit cazibe, adezyon, geçiş ve kalıcılık çağlayan dahil odaklanmak. Yanı sıra tamamen tasvir tayini periferik veya akciğer infiltre lenfositler üzerinde integrinler ve Kemokin reseptörlerinin mRNA veya protein ifade deseni ve kan, ilgili Kemokin düzeyleri tamamlayıcı ölçümü bronchoalveolar lavaj (BAL) ya da akciğer doku12,13,14,15, köklü in vitro hücre kültürü deneyleri lenfosit yapışma veya kemotaksisi işlevsel bir karakterizasyonu izin ver üzerine deneysel koşullar16,17,18tanımlı. Prensip olarak, statik içinde vitro yapışma deneyleri bir endotel monolayer veya rekombinant endotel adezyon molekülleri (örneğin, MAdCAM-1, VCAM-1), kaplamalı cam slaytlara kültürlü lenfositlerin Bağlama kapasitesi standart tüp bebek izlemek kemotaksis deneyleri genellikle bir transwell sistemi19Kemokin Gradyanda birlikte geçirmek için yeteneği lenfositlerin ölçmek için uygulanır. Tüp Bebek her iki ayar kontrollü ayarlama ve modülasyon deneysel koşullar etkinleştirir ancak öte yandan önemli değişkenler eleştirel içinde vivo kemotaksisi ve lenfositlerin adezyon etkisi bilinen eksikliği. Ağırlıklı olarak, statik hücre kültürü deneyleri kalıcı kan akışı19 tarafından neden kesme Kuvvetleri etkisi göz ardı ve potansiyel olarak çevredeki immünolojik çevre ve etkileşen lenfosit bağışıklık hücreleri katılımı ihmal, ikisi de canlı bir organizma. Bu sınırlamalarının üstesinden gelir için statik tüp bebek kemotaksisi veya bağlılık deneyleri içinde alınan sonuçları yorumlanması gerekir daha fazla doğrulama dinamik yapışma deneylerde akışı koşulları20,21 altında ve inç içinde vivo modelleri inflamatuar organ patoloji19. Gerçekten de, önemli sonuçlara T hücre akciğer iltihabi veya Alerjik koşullarda homing düzenlenmesinde hayvan çalışmaları çekilmiş olabilir genetik analiz tanımlanmış modeller farklı göğüs hastalıkları3, farelerde değiştirilme tarihi 22 , 23. köklü ve genel olarak kullanılan bir araç belirli hücresel etkisini tanımlamak için belirli bir gen ilgi temsil ettiği için wildtype fareler ve fareler bir eksikliği olan arasında lenfositler infiltre akciğer nicel karşılaştırılması yollar veya hastalık odaklı model T hücre dağıtım üzerinde reseptörleri. Ancak, aksine in vitro hücre kültürü deneyleri, tartışılan önce klasik hayvan modelleri alan bir çalışma tasarım analiz ve birincil insan T hücreleri doğrudan kan veya hastaların bir inflamatuar akciğer acı BAL elde izlemek için yeteneği yoksun hastalık. Böylece, işlevsel olarak bir tanıyla belirtilen akciğer hastalığı için tercihli akciğer tropism ve ne kadar klinik parametreler bu senaryo üzerinde etkisi olabilir insan lenfosit Künye mümkün olup olmadığını doğrulamak için zorlu kalıyor. Son zamanlarda, çok zarif bir içinde vivo yaklaşım bağlamında bu sınırlamaların çoğunu aşmak başardı ve bağırsak lenfosit24 homing üzerinde gelişmiş translasyonel çalışmalar için yeni yollar açtı, iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD), tanıtıldı . Solvent bazlı doku takas kesitsel ışık sayfalık Floresans mikroskobu güçlü görüntüleme aracı olarak ardından protokollerde yararlanarak, infiltrasyon ve dağıtım adoptively transfer edilen insan T hücrelerinin görselleştirmek mümkün colitic immünyetmezligi fareler24bağırsaklarda. Özellikle, uygulanan bu deneysel ayarı iki ana yenilikler: (1) birincil insan bağışıklık hücreleri analiz deneysel olarak tanımlanmış içinde vivo koşullarda; (2) bir büyükçe alanı hastalıklı organ (yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm) 3D-imar tarafından takip yüksek çözünürlük kalitesinde görüntüsü. Ayrıca, birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda başarılı solvent bazlı doku takas ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu kullanımı gelişmiş akciğer25,26görüntüleme için önemli araçlar olarak kurdu. Bu teknolojik ilerlemeden pulmoner İmmünoloji alanında faydalanmak için şimdi akciğer posta analiz için sistem evlat edindik.

Burada sunulan Protokolü nasıl arındırmak ve fluorescently birincil insan T transfer içine indüklenen akciğer iltihabı ile fareler için hücreleri ve ayrıca, ışık sayfalık sonraki süreci ayrıntılı olarak açıklayan etiket adım adım bir giriş niteliğindedir. Floresans mikroskobik görüntüleme, organ hazırlık ve görüntü işleme de dahil olmak üzere. Genel olarak, karmaşık, ama yine de mümkün, deneysel model insan lenfosit akciğer posta içinde vivo koşulları üzerine izleme tanıtarak enflamatuar veya Alerjik akciğer hastalıkları alanında gelecek translasyonel çalışmaları desteklemek umuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deney hayvanları içeren Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya) ilgili yerel yetkilileri tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Fareler patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza. İnsan kanı topluluğu yerel etik kurul ve üniversite Erlangen-Nürnberg, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi. Her hastanın yazılı onay verdi.

1. neden Alerjik akciğer iltihabı farelerde

Not: Daha önceki çalışmalar27' de açıklandığı gibi deneysel yordamını Alerjik hava yolu iltihabı farelerde inducing sağlar ve buna göre BAL doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri birikimi tetikler. Açıklanan protokol C57BL/6J farelerde kuruldu ancak diğer standart doğuştan suşları için evlat edinmek mümkün olmalıdır.

Şekil 1A içinde vivo deneysel işlemin Özeti için bkz.

  1. Fareler ketamin/xylazine mayi enjeksiyonu ile anestezi.
    Not:     sadece C57BL/6J fareler büyük 6 hafta daha ve en az 16 g vücut ağırlığı ile kullanın.
    1. PBS (12 mg/mL ketamin; 1.6 mg/mL xylazine) ketamin/xylazine çözümde hazırlamak ve fareler tam vücut ağırlığını belirlemek.
    2. Birinci fare ketamin/xylazine çözüm vücut 8 uzun µL/g ağırlığı ile intraperitoneally enjekte ve pençe çimdik refleks yokluğu ile derin anestezi 1.3 adıma geçmeden önce onaylayın.
  2. 5 mg/mL papain PBS yılında taze hazırlayın. Yavaş yavaş 10 µL (50 µg) papain çözümü burun pipet. Dikkatle fare uyanış kadar izleyin.
  3. 1.1 ve 1.2 denemeye dahil tüm fareler için yineleyin. 1.1-1.3 üç gün üst üste adımları.

2. arındırmak ve Fluorescently insan periferik kan CD4 etiket+ T hücreleri

Not: İşlem hücreleri steril koşullarda.

  1. Tam insan kanı 18 mL periferik ven toplamak. Ficoll-Hypaque degrade Santrifüjü periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kısmını seçmek için gerçekleştirin.
    Not: Toplama ve çözümleme birincil insan malzemenin yerel etik yetkilileri tarafından onaylanması gerekiyor. Sadece bir kişinin yeterli bir tıbbi yeterlilik ile kan periferik ven toplamak için izin verilir.
    1. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kan toplamak-koagülasyon önlemek için monovettes (1.6 mg EDTA/mL kan) içeren.
      İsteğe bağlı: Buffy ceket kan, kan bağışı lökosit, tam Venöz kan yerine zenginleştirilmiş bir yan ürün kullanın.
    2. Kan bir konik 50 mL tüp içine aktarmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 1:2 oranında seyreltin. Dikkatle Ficoll-orta 10 mL ekleyin (yoğunluk 1.077 g/mL) seyreltilmiş kan altında bir alt katman. Örnek (800 x g için oda sıcaklığında fren olmadan 15 dk) santrifüj kapasitesi.
    3. Dikkatle santrifüj tüpü çıkarması ve PBMC içeren Interphase yeni konik 50 mL tüp içine aktarın. Üst ve alt tabaka atmak. PBMC içeren tüp PBS ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika) ile doldurun. Süpernatant kaldırın.
      Not: İsteğe bağlı olarak, gerekirse, kalan eritrositler lizis gerçekleştirin. Dikkatle amonyum klorür potasyum (ACP) lizis arabellek (155 mM amonyum klorür; 19 mM potasyum hidrojen karbonat ve 0.68 mM EDTA; pH 7,27) 3 mL resuspended hücre Pelet ve girdap örnek ekleyin. Tüpler 3 dakika çalkalanır. ACP lizis arabellek kaldırmak için PBS ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dk) 40 mL ekleyin. Süpernatant atmak.
  2. CD4 arındırmak+ T hücreleri CD4 lastikteki.
    Not: Genel olarak, birçok insan CD4 arınma için manyetik lastikteki dağıtıcılar tarafından+ hücreleri, hücre saflık karşılaştırılabilir düzeyde yol açmalıdır. Ürün seçimi bireysel tercihlerine göre. Protokolü (2.2.2–2.2.7) aşağıdaki adımlardan tanımlanmış CD4 microbead ürün ve Malzemeler tablodaha da belirtildiği gibi ilgili ayırma sütunlar için ayarlanır. Bazı değişiklikler Protokolü'nün bir alternatif CD4 microbead ürün seçili durumda gerekli olabilir.
    1. En az % 0.5 fetal sığır serum (FBS) ve 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-tampon) başına 10 içeren 80 µL PBS PBMC Pelet resuspend7 PBMC. Kullanım başlangıç Vaha'da yaklaşık 30 x 106 PBMC sonuna kadar 6 x 106 yaklaşık6 3 x 10 için saf insan CD4+ T hücreleri.
    2. CD4 lastikteki 10 başına 20 µL eklemek7 PBMC, karışımı yavaşça ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Tüp PBS/FBS/EDTA-tampon (4 ° C aşağı soğutmalı) ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika) ile doldurun. Süpernatant kaldırın.
    3. Bir ayrılık sütun bir manyetik alana yerleştirin. Sütun 3 mL PBS/FBS/EDTA-tamponu ile yıkayın. PBS/FBS/EDTA-arabelleği (4 ° C aşağı soğutmalı) 500 µL hücre Pelet resuspend ve hücre süspansiyon bir manyetik alan içinde yerleştirilmiş durulanır ayrılık sütun üzerine aktarın.
    4. Üç kez ile 3 mL (4 ° C aşağı soğutmalı) PBS/FBS/EDTA-arabellek ayırma sütun durulayın ve atık atın.
    5. Manyetik Ayırma sütun kaldırırsanız ve 15 mL tüp içine yerleştirin. CD4 elute+ hücre kesir PBS/FBS/EDTA-tampon pistonu kullanarak 5 ml.
    6. Tüp PBS ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika) ile doldurun. Süpernatant kaldırın. İki kez bu çamaşır tekrarlayın.
    7. Seçim (örneğin, Neubauer odası) standart bir yöntem tarafından vermiştir hücre sayısı belirler.
  3. Etiket CD4+ T hücreleri floresan Hücre proliferasyonu boya ile.
    1. CD4 resuspend+ T hücreleri içinde PBS (yukarı 107 hücre/mL; PBS az 500 µL kullanmayın).
    2. Bir kırmızı ışık telaşlı hücre çoğalması 6 µM çözeltisi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) (oda sıcaklığında önceden ısındı) PBS içinde boya. Bu çözüm 1:2 ile karıştırın daha önce hazırlanan hücre süspansiyon ve girdap iyice (3 µM son konsantrasyonu).
    3. (Işıktan korunan) 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya. Daha sonra RPMI orta % 10 içeren beş ciltlik eklemek FBS ve buz (ışıktan korunan) 5 min için kuluçkaya.
    4. Yıkama etiketli hücreleri üç kez RPMI orta içeren %10 FBS (4 ° C'de 10 dakika santrifüj vasıl 300 x g ). PBS etiketli hücreleri resuspend, buz üzerinde depolamak ve ışıktan kadar kullanmak korumak.
      Not: Uzun süreli depolama hücre (> 60 dk) hücre sağkalım üzerinde olumsuz etkisi olabilir.
      İsteğe bağlı: CD4 saflığı belirlemek+ hücre kesir ve etiketleme yordam etkinliğini Akış Sitometresi tarafından. 0.5 x 10 resuspend6 ' 1 x 106 CD4+ 100 µL arabelleği (%1 FBS, 2 mM EDTA PBS) içinde hücreleri ve seçim floresan bir boya ile birleştiğinde bir anti-insan CD4 antikor ekleyin. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 1 mL tampon ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika için) ekleyin. Süpernatant atmak. Örnek akış sitometrik ölçüm ile devam (temsilcisi sonucu tasvir şekil 1B, C).

3. adoptively insan CD4 Transfer+ T hücreleri alıcı Mmice Papain maruz

Not: Bkz: şekil 1A içinde vivo Özeti için deneysel bir işlem yapılır. Hücre aktarımı bir gün sonra papain son burunici yönetimini gerçekleştirmek.

  1. Fluorescently etiketli insan CD4 süspansiyon ayarlamak+ T hücreleri (Adım 2.3.4) 1 x 107 hücre/mL PBS bir konsantrasyon için. Hücre süspansiyon 100 µL bir 1 mL/30 G içine doldurun-şırınga.
  2. Dikkatle ilk papain maruz C57BL/6J fare (Adım 1.1-1.3) kuyruk ven enjeksiyon için bir kısıtlama aygıt içine koyun. Hazır şırınga (Adım 3.1) kuyruk ven ponksiyon ve yavaş yavaş 1 x 106 insan CD4 etiketli içeren hücre süspansiyon 100 µL enjekte kullanmak+ hücreleri. Hemen iğneyi enjeksiyon sonra çekmeyin ama hücre süspansiyon deşarj önlemek için ek 5 saniye bekleyin.
  3. Kısıtlama aygıttan fare düğmesini bırakın ve sonraki hayvan ile devam edin. En az bir papain maruz hayvan ışık sayfalık floresan mikroskopi için negatif kontrol olarak hizmet için transfer fluorescently etiketli hücreleri ile geçmesi değil tutmak.

4. Akciğer doku ışık sayfalık floresan mikroskopi için hazırlayın

Not: Transferini fluorescently insan hücreleri (Adım 3.2) etiketli sonra aşağıdaki adımları 3 h gerçekleştirilir. Akciğer dokusunun hasat dahil açıklanan deneysel prosedürler fiksasyon ve solvent bazlı doku takas şu anda açıklanan protokoller24,28adapte edildi.

  1. Fare karbon dioksit (C02) inhalasyon tarafından kurban.
  2. Akciğer yerinde 5 mM EDTA içeren PBS ile sıvı.
    1. Göğüs kalp ortaya çıkarmak için göğüs kemiği boyunca kesme ile açın. Punctate 21 G kanül ile sağ ventrikül bir kateter bağlı.
    2. Sol ventrikül keserek açmak ve böylece çıkmak kan ve perfüzyon sıvı izin vermek. Yavaş yavaş akciğer ile buz gibi PBS kateter yolu ile 5 mM EDTA içeren 20 mL sıvı.
  3. Akciğer yerinde fiksasyonu gerçekleştirmek için kateter sağ ventrikül kaldırmayın. Yavaş yavaş akciğer ile PBS içinde çözülmüş buz gibi %4 paraformaldehyde (PFA) 2 mL sıvı. Kateter ve kanül kaldırın.
    Not: İngiltere'de yılın tabanlı Akciğer doku yerinde fiksasyonu iyi kurulmuş bir teknik fare akciğer dokusu daha sonraki mikroskopik analiz29,30için hazırlamak için temsil eder.
    Uyarı: İngiltere'de yılın toksik ve itina ile bir başlık altında ele alınması gerekiyor.
  4. Akciğer % 0.75 özel yerinde ile doldurun.
    1. % 0.75 özel PBS içinde hazırlamak ve 50 ° c ısı shaker kullanımı kadar sağlam tutun. Tükürük bezleri fare kaldırmak, sternohyoid kas kesmek ve trakea altında bir forseps kaydırarak ortaya çıkarmak.
    2. Maruz Trakea 30 G iğne ile noktalamak ve özel istenmeyen sızıntı kaynaklanan Trakea daha fazla zarar önlemek için bir künt 30 G kateter ile değiştirin. Eklenen kateter ve bir iğne bağı kullanarak nefes borusu arasındaki kavşak kapatın.
      İsteğe bağlı: Burada açıklanan yordamı insan hücrelerinde infiltre: BAL gibi son ayrıntı31 ' de açıklanan analiz etmek için BAL koleksiyonu ile birleştirin (bkz: Şekil 2E temsilcisi sonuçları için).
    3. Dikkatle solunum yolları ile % 0.75 özel (vücut sıcaklığında soğuduktan) kateter yolu ile tam akciğer unfolding kadar doldurun; özel tam katılaşma kadar bekleyin. Kateter kaldırmak ve dikkatle %4 ile dolu bir karanlık 2 mL tüp akciğerde hasat PFA.
  5. Ek fiksasyon kuluçkaya için İngiltere'de yılın sürekli rotasyon (31 devir/dakika) altında 4 ° C'de 2 h için PBS içinde çözüldü % 4 örnekte.
  6. Doku daha sonra örnek sürekli rotasyon (31 devir/dakika) altında kuluçka tarafından % 50 etanol (pH 9), % 70 etanol (pH 9) 4 ° C'de kurutmak ve % 100 etanol; her adım için en az 4 h. Sonunda, ikinci bir kuluçka taze % 100 etanol 4 h için gerçekleştirin.
  7. Solvent bazlı takas etil cinnamate (ECI) kullanarak doku gerçekleştirin. Bu nedenle, örnek ECI aktarın. Kuluçkaya gecede, oda sıcaklığında (altında sürekli rotasyon) doku yarı saydam (bakınız şekil 1D temsilcisi görüntüler için) görünene kadar.
    Not: (Işıktan korunan) oda sıcaklığında ECI içinde depolanan örnekleri ay birkaç hafta boyunca stabildir.

5. ışık-yapraklık Floresans mikroskobu Wwhole antikorundan akciğer LOB gerçekleştirmek

Not: Lütfen ayrıntılar için Malzemeler tablo bkz: ışık sayfalık Floresans mikroskobu ve üzerinde aşağıdaki adımları temel alan karşılık gelen yazılım. Diğer üreticiler tarafından benzer sistemleri ancak, aşağıdaki Protokolü geliştirici özel değişiklikleri ile de kullanılabilir. Başlamadan önce mikroskop özel işletim Kılavuzu ile tanımak ve sitesindeki sorumlu kişi tarafından teknik yönergeleri izleyin.

  1. Işık sayfalık mikroskobu hazırlayın.
    1. Işık sayfalık mikroskobunun açmak ve görüntüleme yazılımı bilgisayarda karşılık gelen açın. Örnek odası süzülmüş ECI (100 µm filtre) ile doldurun ve konumunu lazer ışınları arasında yere koyun.
    2. Akciğer örnek sahibi için sopa için organik çözücü-kararlı tutkal küçük bir damla kullanın. Işık-yaprak gerekli penetrasyon derinliği olabildiğince küçük tutmak için Akciğer lobu dik ayarlayın. Daha sonra örnek sahibi onun odasına koyun.
    3. Kırılma indisi amacın ECI reaktif takas olarak kullanırken 3.5 için ayarlayın.
  2. İnsan hücreleri tüm organ bağlamda algılamak için ışık sayfalık mikroskop, ayarları.
    1. Gerekli lazerler seçin (ölçüm için Filtre > gerekli lazerler onay kutularını etkinleştirmek) ve uygun yoğunluklarda kontrol yazılımı seçin (lazer iletim Denetimi > yoğunluk lazer ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın > Geçerli). Bir uyarma dalga boyu 488 kullanın autofluorescent Akciğer doku ve 640 algılamak için nm (525/50 filtre) insan hücreleri fluorophore kırmızı spektrumunda yayan ile etiketli heyecanlandırmak için nm (680/30 filtre).
    2. Örnek 488 heyecanlı odaklanmak nm ve odağı uyarma dalga boyu 640, 'renk düzeltme' aracı ile uyum nm (renk düzeltme ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın > uygulamak).
    3. Bir uygun büyütme faktörü seçin; düşük büyütme genel bakış kullanın (örneğin, 6.3 x) detaylı yerelleştirme için genel dağıtım akciğer dokusu ve büyütülmüş resimler (örneğin, 32 x) içindeki etiketli hücreleri belirlemek için.
    4. Aynı şekilde bütün organ veya faiz belirli bir kısmını elucidating bir levha genişliği seçin (optik > sayfa genişliğini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın; genellikle % 20-40 arasında). Daha yüksek NA daha net görüntü oluşturma sayfası sayısal diyafram (NA) tanımlamak (optik > sayfası NA ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın; NA % 0,025-ebilmek sık sık var olmak kullanılmış fizyolojik boyutuna genişletilmiş bir fare Akciğer lobu için).
    5. 'Altında Gelişmiş ölçüm ayarlarını' kullanılmak üzere ışık-yaprak sayısını seçin. Sol ve sağ ışık-levhalar homojen bir görüntü oluşturmak için çift yönlü aydınlatma durumunda birleştirme (Gelişmiş > birleştirme lightsheets > Seç karışım modu > her iki ışık sayfaları arasında örtüşme tanımlamak için kaydırıcıları kullanın).
      Not: Bu örnek üç ışık-sayfalarıyla birlikte her iki yönlü aydınlatma yararlanmak için tavsiye edilir.
      İsteğe bağlı: Daha fazla görüntü kalitesini artırmak için dinamik odaklama işlemini kullanıyorsunuz. Bu resim alma sırasında x-yönünde odağı taşımak sağlar.
    6. Z-yığının ölçülebilir ve 5 mikron için adım boyutunu belirlemek için başlangıç ve bitiş konumlarını tanımlamak (xyz-tablo Z > Tarama aralığı).
      Not: Başlangıç ve bitiş konumlarını z-yığın boyutu ve Akciğer lobu örnek odası içinde konumlandırma bağlıdır. Ancak, yaklaşık 300-800 z-yığınlar genellikle tek Akciğer lobu (5 µm adım boyu) elde edilir.
    7. 'Otomatik kaydetme ayarları' kullanarak dosyaları kaydetmek ve esir alma imge için ölçüm başlamak. Bitirme veri toplama sonra ECI kontamine örnek sahibi ve akan suyun altında odası temiz.
      Not: Daha sonra karşılaştırılmak üzere gereken birkaç akciğer lobları görüntü için aynı ayarları kullanın.

6. işleme ve insan hücre akciğer biriken miktar sonrası görüntü

Not: Malzemeler tablo , aşağıdaki adımları temel 3D analiz sonrası görüntüleme yazılımı hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız. Ancak, program sonrası Imaging alternatif de kullanılabilir.

  1. Bir z yığının ilk resim yüklemek (surpass düğmesini etkinleştirin, Dosya > Aç > select görüntü) açılış tüm diğer görüntülerin seçilen z yýðýn ve onların otomatik 3D yeniden başlatmak için.
  2. X doğru görüntülenmesini sağlamak için y ve z boyutları, voxel boyutları kontrol edin ve gerekirse onları ayarlayın (Düzenle > görüntü özellikleri > Voksel boyutu el ile girmek). Z Voksel boyutu için seçilen adım boyu iki resim arasında (burada 5 µm) girin.
  3. Her kanal farklı renkte görüntüleme (Düzenle > görüntü ayarı göstermek). Her kanal bir seçim bir renk tanımlamak için birbiri ardına'i ( Şekil 2A, B, C, D autofluorescence sinyal gri renkle görüntülenir ve insan CD4 etiketli+ kırmızı hücreleri).
  4. Yoğunluk, siyah seviyesi ve her kanal için kontrastı ayarlamak (Düzenle > görüntü ayarı göstermek) kanal barlarda üçgenler kullanarak veya tam sayı kanal ayarları girme. Yoğunluk ayarı için dik üçgen kullanın. Siyah seviyesi Ayarlamas∂, sol üçgen kullanın ve kontrast ayarı için orta üçgen kullanın.
    Not: Denetim fare kullanmadan belirli insan hücre kaynaklı sinyalleri ve belirsiz arka plan arasında ayırt etmek için hücre aktarımı (Adım 3.3) kullanım akciğer türetilmiş.
  5. Ölçmek için etiketli hücre Akciğer doku içinde 'yeni noktalar Ekle' araç çubuğunu kullanın ve select 'otomatik oluşturma atlamak, el ile düzenleme' için el ile Hücre sayımı.
    Not:     alternatif olarak, Sayma Aracı 'noktalar' altında otomatik hücresini kullanın. Ancak, el ile sayım daha doğrusu belirli ve belirsiz sinyaller arasında ayırt etmek için izin verir.
    1. Farklı örnekler üzerindeki insan hücresi birikimi karşılaştırmak için 3D kesici alet kullanarak belirli bir ses ile bir akciğer küp tanımlamak (Düzenle > 3D kırpma) (burada 813 mikron x 813 mikron x 1,000 mikron).
    2. Birikmiş hücreleri seçin 640 nm kanal ve 10 µm bir 'RADIUS ölçek' tanımlamak için. 'Düzenle' yi, "seçin" işaretçi menüsü kontrol ve shift tuşunu basılı tutarak farenin sol tuşu ile üzerinden bir nokta içeren her hücreyi işaretleyin. Sayılan hücreleri istatistiklere görüntülenen genel numarasını bulun.
      Not: Sayılan akciğer hacmi bilim adamı bağımlı seçim için çeşitli küpleri sonuçları güvenilirliğini sağlamak ve telafi etmek için Akciğer lobu (burada beş) başına saymak için önerilir (miktar strateji ve temsilcisi sonuçları tasvir içinde Rakam 2D).
  6. 'Anlık' aracını kullanarak bir yansıma yakalama ve/veya 'animasyon' aracını kullanarak bir video çekmek. Save dosyaları .ims dosyaları olarak ayarlanabilir (Dosya > Dışa Aktar).
    Not: Temsilcisi amacıyla gösterebilir veya çerçeve denetimi veya araç çubuğunda çerçeve işaretleri kaldırarak gizleyebilirsiniz. Ayrıca, ekran maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) olarak görüntüler (araç çubuğu > Ses > modu > MIP kontrol) veya 'yüzey modu' kullanın (araç çubuğu > yeni yüzeyler ekleme). 'Yüzey modu' doku mimarisi ve/veya hücre ( Şekil 2Ctemsilcisi görüntüler gösterildiği) organları vurgulamak her kanal için ayrı ayrı etkinleştirilmesi gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sunulan Protokolü izleme ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu ile akciğer adoptively transfer edilen insan T lenfositler birikimi miktarının sağlar bir deneysel fare modeli açıklar. Resim 1 A deneysel zamanlama içinde vivo adımlardan şematik bir genel bakış sağlar. Güvenilir sonuçlar sağlamak için o izole ve fluorescently iyi kalite sağlamak için önemli önemi insan CD4 etiketli+ T hücreleri, daha sonra fareler aktarılır. Şekil 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan deneysel ayarı içinde vitro yapışma ve kemotaksisi birincil insan bağışıklık hücreleri içinde vivo inflamatuar koşulları ve böylece relevantly tamamlar altında akciğer izleme kapasitesini klasik izlemek için fırsat gerçekleştirilen sağlar deneyleri. Akciğer hesap belirli anatomik organ özellikleri almak için bağışıklık hücre (dahil kemotaksisi ve hücre dağıtım hedef organ içinde) yanı sıra klinik önemi ve lisans alınan veri transferi homing önemli yönlerini aldık Üç teknik an...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

M.F. Neurath Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda ve Boehringer için bir danışman olarak hizmet vermiştir. Kalan yazarların herhangi bir çatışma açıklanmaz.

Teşekkürler

Yazarlar DFG işbirlikçi araştırma merkezleri SFB 1181 ve TRR 241 tarafından finansman minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. Optik görüntüleme Merkezi Erlangen (anlatım) ve belirli Ralf Palmisano, Philipp Tripal ve Tina Fraaß (proje Z2, DFG CRC 1181) ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme için uzman teknik destek için kabul vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya2267.4
AlexaFlour594 anti-insan CD45 antikoruBioLegend, San Diego, ABD304060
Amonyum klorürCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlmanyaK2981
Kanül 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, ABD301300
Hücre proliferasyon boyası eun670eBioscience Inc., San Diego, ABD65-0840-85
CD4 MicroBeads, insanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya130-045-101
EDTA (etilendiamintetraasetik asit)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya8043.1
Potasyum-EDTA kan alma tüpü, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya112372-100G
Etanol & %99,5 (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya5054.3
FBS (fetal sığır serumu) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, AlmanyaP40-47500
Filtre 100 ve mikro; m VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Almanya732-2758
Imaris Görüntü Analiz Yazılımı 9.0.2Bitplane AG, Zürih, İsviçren.a.ImspectorPro
yazılımıAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Almanyan.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Almanya3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Almanyan.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya130-042-303
Multifly kanül 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya851638035
30 G iğneB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Almanya9161502
Neubauer sayma odasıneoLab Migge GmbH, Heidelberg, AlmanyaC-1003
Pattex TutkalHenkel AG & Co, Dü sseldorf, AlmanyaPSK1C
LS sütunuMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya130-042-401
Lenfosit Ayırma Ortamı (Yoğunluk 1.077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (fosfat tamponlu tuzlu su)Biochrom GmbH, Berlin, AlmanyaL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-insan CD4BioLegend, San Diego, ABD317428
PerCP/Cy5.5 fare IgG2b, κ izotip CtrlBioLegend, San Diego, ABD400337
PFA (paraformaldehit)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Almanya0335.1
Potasyum hidrojen karbonatCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlmanyaP7481
Serolojik pipet 10 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya86.1254.001 
Şırınga 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Almanya9166017V
Şırınga 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, ABD260067
Şırınga 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, ABD260069
Tüp 1.5 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya72.706.400
Tüp 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya72.695.400 
Tüp 2 mL, kahverengiSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya72.695.001
Tüp 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya62.554.502 
Tüp 50 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Almanya62.547.254 
QuadroMACS SeparatörMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Almanya130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, AlmanyaKPOBD32

Kaynaklar

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604(2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382(2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450(2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38(2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398(2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707(2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513(2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T H crelerinin Akci ere Y nelimiAlerjik nflamasyon Modelinsan Lenfosit zlemePapain Kaynakl nflamasyonAk Sitometrisi AnaliziCD4 Pozitif T H creleriDoku effafla t rma Protokol3B Rekonstr ksiyon G r nt lemeAdoptif H cre Transferi
Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.