Yöntem makalesi

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

DOI:

10.3791/59087

⸱

28 Şubat 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir seri femtosecond zaman çözüldü kristalografisi deney başarısı verimli örnek Teslimde bağlıdır. Burada, bacteriorhodopsin microcrystals bir yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör üzerinden ekstrüzyon optimize etmek için iletişim kuralları açıklar. Metodoloji bir roman üç yönlü bağlaştırıcı ile örnek homojenizasyon ve görselleştirme ile yüksek hızlı bir fotoğraf makinesi yararlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektörleri büyük ölçüde X-ray serbest elektron lazerler (XFELs) seri femtosecond crystallographic deneyler (SFX) örnek tüketimi azaltılmıştır. Işık tahrik proton pompa bacteriorhodopsin kullanarak deneyler bir dizi daha fazla kurduk bu enjektörler kristalleri yapısal değişiklikleri gidermek zaman karar vermek seri halinde femtosecond kristalografisi (TR-SFX) için teslim etmek için tercih edilen bir seçenek olarak proteinler photoactivation sonra. Birden çok yapısal anlık görüntülerini yüksek kalite elde etmek için büyük miktarda veri toplamak ve kristalleri her pompa lazer nabız arasında boşluk sağlamak için önemlidir. Burada, biz nasıl biz bacteriorhodopsin microcrystals ekstrüzyon son TR SFX deneylerimiz Linac tutarlı ışık kaynağı (LCLS), en iyi şekilde ayrıntılı olarak tarif. Yönteminin amacı artış oranı kristallerinin yüksek yoğunluklu koruyarak ekstrüzyon istikrarlı ve sürekli bir akış için en iyi duruma getirmektir deneme veri TR SFX içinde de toplanabilir. Biz lipidik küp aşama kristalleri ile yüksek hızlı alınan ekstrüzyon istikrar tedavinin temel örnek kompozisyon ayarlayarak takip cihazı kaplin roman üç yollu kullanarak homojen dağılımı ile hazırlayarak bu hedefe ulaşmak kamera ayarları. Metodoloji diğer microcrystals akışını optimize etmek için adapte edilebilir. Belgili tanımlık tertibat yeni İsviçre ücretsiz elektron lazer tesis kullanıcıları için kullanılabilir hale gelir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seri femtosecond kristalografisi (SFX) x-ışını serbest elektron lazerler (XFEL) oda sıcaklığında yapıları belirlemek için benzersiz özellikler yararlanan bir Yapısal Biyoloji mikrometre ölçekli kristalleri binlerce çoğu ekme tekniktir radyasyon hasarı "kırınım imha önce" ilke1,2,3.

Bir zaman çözüldü uzantısı SFX (TR-SFX) içinde XFEL üzerinden femtosecond bakliyat proteinler4,5yapısal değişiklikleri incelemek için kullanılır. Protein ilgi bir optik lazer (ya da başka bir etkinlik tetikleyici) ile sadece bir pompa-sonda kurulumunda XFEL tarafından önce vurulduğunu etkinleştirilir. Tam olarak pompa ve sonda nabız arasında gecikme kontrol ederek, hedef protein farklı eyaletlerde geçirilerek. Onbir büyüklük zamanında üzerinde yapısal değişikliklerin moleküler Filmler çeşitli protein hedefleri6,7,8,9dynamics çalışmaya yeni XFEL kaynakları güç göstermek, 10,11,12,13. Prensip olarak, yöntem dinamik spektroskopik ve statik yapı teknikleri bir, atomik çözünürlük yakınındaki protein dynamics içine bir bakış sağlayan katılır.

TR-SFX için basit sistemleri harekete geçirmek ile bir fotoğraf duyarlı bileşeni retina bacteriorhodopsin (bR)9,10, photosystem II12,13' te kromofor gibi endojen bir tetikleyici içerebilir, fotoaktif sarı protein (PYP)6,7 ters photoswitchable floresan protein11veya photolyzable karbon monoksit miyoglobin8. Hala geliştirme tekniği heyecan verici varyasyonları mix itimat ve enzimatik reaksiyonlar ya da yapısal değişiklikler16ikna etmek için kullanılan elektrik alan eğitim programları14,-15 enjekte. XFEL kaynakları sadece be elde edilebilir için birkaç yıl ve başarıları geleceğe extrapolating, yöntemi nasıl bizim anlayış açısından gerçek bir oyun değiştirici olarak potansiyel gösterir verilen bu proteinlerin işlevi.

Biyolojik örnekleri tek bir yüksek güç XFEL darbe maruz tarafından yok edilir çünkü protein kristalografisi yeni yaklaşımlar gerekliydi. Bu yordamları arasında Tekdüzen microcrystals büyük miktarda büyümeye yeteneği gelişmiş17,18,19olması gerekiyordu. Bir XFEL, veri toplamayı etkinleştirmek için bu kristaller gerekir teslim, atılan olup her XFEL darbe için yenilendi. XFELs 10-120 Hz'de kullanışlı bakliyat ateş göz önüne alındığında, örnek teslimat da sağlam ve sınırlayıcı tüketimi kristalleri tutarken hızlı, istikrarlı ve güvenilir, olmalıdır. Arasında en başarılı çözümler oda sıcaklığında kristal yüklü lipidik üçüncü aşama (LCP) sütunun pulsed röntgen ışını20akarsu bir işletmesi teslim etmek yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör var. Rastgele odaklı kristalleri, gömülü nerede bir kırınım deseni kaydedilir bir Dedektör üzerine XFEL bakliyat dağılım x-ışınları tarafından yakalanan LCP akışında. Sık sık membran protein kristalleri17,21,22,23için henüz diğer yüksek viskozite taşıyıcı medya bir büyüme aracı olarak kullanıldığı gibi LCP bir örnek teslim orta için doğal bir seçim yapıldı. 24,25,26,27,28,29,30 ve çözünür proteinler31 de kullanıldığını enjektör içinde. SFX yüksek viskozite enjektör ile membran proteinleri13,32 G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs)33,34dahil yapısı belirlenmesi sırasında başarılı olmuştur, 35,36,37, hem zaman hem de örnek etkili olurken yerli aşamalı38,39 için yeterli veri kalitesiyle. Şu anda, bu enjektörler daha düzenli olarak Oda sıcaklık ölçümleri sinkrotron kaynakları28,30,40,41 yanı sıra daha fazla sırasında için kullanılmakta olan teknik olarak TR-SFX deneyler XFELs9,10,13,42talep.

Karşılaştırılabilir TR SFX deneyler sıvı faz teslim akışı başlığı6,7,12odaklanmış gibi diğer enjektör türleri kullanılarak gerçekleştirilen, ancak, bu yöntem için pek çok protein miktarları mevcut değil gerektirir biyolojik olarak ilginç hedefleri. Viskoz ekstrüzyon bir ortalama tüketimi başına 10.000 dizin oluşturulmuş kırınım desenleri ile karşılaştırıldığında 9,35 mg protein 0,072 mg için sıvı jet kullanarak statik yapılar belirlenmesi için püskürtme (yani, 130 kat daha fazla örnek hakkında bildirilmiştir verimli)20. Yüksek viskozite enjektör sadece bu örnek verim43bazıları feda ederken uygun örnek teslimatı için TR SFX olmak gösterilmiştir. İçinde Nogly ve ark. (2018)10, örneğin, örnek tüketimi yaklaşık 1,5 olumlu nerede ortalama örnek tüketimi çok daha yüksek protein başına 10.000 74 mg ile PYP kullanarak benzer TR SFX deneyleri için karşılaştıran mg başına 10.000 dizin oluşturulmuş desen, yapıldı. Dizin oluşturulmuş desen6. Yüksek viskozite enjektörleri böylece protein mevcut miktarını sınırlayarak veya kristaller doğrudan LCP yetiştirilmektedir açık avantajları vardır.

TR-SFX için yüksek viskozite kullanarak birkaç teknik sorunları en güvenilir veri vermeye enjektörleri ele alınması gerekmektedir: akış hızı en az kritik değeri; kalmaya ihtiyacı isabet oranı veri toplama yavaş işlemez bir düzeyde muhafaza edilmelidir (örneğin, % 5'den büyük); ve örnek aşırı aksamalar teslim edilecek. İdeal olarak, bu koşullar zaten yerine kullanılabilir XFEL zamanı olabildiğince verimli bir şekilde kullanmak için uzun bir zamanlanmış TR SFX deneyin önce. Pricipally, bir yavaşlama LCP akışındaki birden fazla optik lazer nabız ve sonuç karışık etkin Birleşik Devletleri ile etkinleştirildi kristalleri problama veya umpumped malzeme ışının içinde beklenen pompalanan malzeme sondalama izin verebilir. Enjeksiyon öncesi test ek bir yararı, bir XFEL, veri toplama sırasında kapalı kalma saat başlıklarının tıkalı olmayan ekstrüzyon örnekleri, değiştirme, değiştirme için küme olarak küçültülür ve diğer bakım görevleri azaltılır olmasıdır.

Burada, örnek teslim yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör ile TR SFX veri toplama için en iyi duruma getirmek için bir yöntem mevcut. İş yerinde bir sinkrotron beamline29 daha fazla bilgi beklenen isabet oranları ve kristal kırınım sağlamak, ancak kolaylık olması için açıklanan yöntemleri bir x-ışını kaynağına erişim güvenmeyin. Protokolümüze deneyler proton pompa bacteriorhodopsin10 retina isomerization yakalamak için en iyi duruma getirmek için geliştirilmiştir ve Ekstrüzyon ekstrüzyon izleyerek takip için kristal örnekleri hazırlama ile başlayan iki aşamada yapılmaktadır bir yüksek hızlı kamera Kurulumu kullanarak. Bir aşamasında, kristal yüklü LCP ek LCP, düşük geçiş sıcaklığı lipidler veya diğer katkı maddeleri son karışımı tıkanma veya yavaşlama'dır örnek ortamına uygun olduğundan emin olmak için ile karıştırılır. Yeni bir üç yönlü şırınga coupler karıştırma performans ve örnek homojenliği geliştirmek için geliştirilmiştir. İkinci aşama doğrudan ekstrüzyon hızı istikrar ölçmek için yüksek hızlı bir kamera tarafından kaydedilen bir ekstrüzyon testi oluşur. Video veri analizi, deneysel sonuçlar geliştirmek için örnek hazırlama protokolü için ayarlamalar yapılabilir. Bu yordamları en az değişikliklerle TR SFX veri toplama için diğer proteinler hazırlamak için uyarlanmış ve sınırlı XFEL beamtime verimli kullanmak için katkıda bulunacaktır. Sadece onların işlemi44,45 ve enjektör tabanlı seri veri toplama yöntemleri transfer synchrotrons28,30,40,41 başlayan yeni XFEL imkanları ile , önümüzdeki birkaç yıl mutlaka protein hedefleri hiç daha geniş bir yelpazesi yapısal dinamikleri heyecan verici yeni görüşler sağlamaya devam edecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. protein Crystal numune hazırlama

  1. Örnek enjekte edilebilir için önce yaklaşık 30 dk monoolein kristal yüklü yük 50 µL 100 µL şırıngada LCP dayalı.
  2. Atmosfer basıncında enjeksiyon için: ikinci bir şırınga arkası içine Sıvı parafin, yük 10 µL. Şırınga dikey tutarak, şırıngadan hava kabarcıkları sınırdışı.
    1. Vakum ortamı içine enjeksiyon için: yük 5 µL MAG 7,9 ve ikinci bir şırınga arkası içine Sıvı parafin 5 µL. Şırınga dikey tutarak, şırıngadan hava kabarcıkları sınırdışı.
  3. Şırınga ile parafin/MAG 7,9 standart şırınga coupler için bağlanmak, pistonu üzerinde bir küçük birim kadar yavaşça basarak baðlantý birimi Hava Temizleme (< 1 µL) parafin/lipid coupler iğne ucunda görülür.
  4. Örnek şırınga herhangi bir hava örnek tanıtmak değil dikkat çekici şırınga baðlantý birimi bağlayın. Lipid/parafin örnek malzeme bağlantı ile birden çok kez geçirerek karıştırın.
  5. Premix LCP (' PEG, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO) 20 µL başka bir 100 µL şırınga yükleyin. Hava kabarcıkları gerektiği gibi kaldırın.
  6. Boş şırınga bağlaştırıcı kaldırmak ve bir standart şırınga coupler kullanarak şırınga içeren kristal premix LCP ekleyebilirsiniz. Örnek bağlantı aracılığıyla 100 kere geçmektedir.
    Not: Örnek karıştırma örnek ısı biraz46. Karıştırma yavaş bir hızda nerede örnek sıcaklığını makul sürekli tutulabilen yapılmalıdır.
  7. Örnek karşı bir ışık kaynağı şeffaflık için kontrol edin. NET homojen bir LCP oluşturmuştur, 1.9 adıma gidin.
  8. Örnek küp aşamasında içine getirmek için monoolein 3 µL ve 50 kere (yukarıda açıklandığı gibi) karıştırın. Sadece monoolein aşırı önlemek için şeffaf bir faz kurdu kadar bu yordamı yineleyin.
    Not: LCP oluşumu sıcaklık bağımlı47 ve biraz 20 ° C'nin üzerinde en iyi sonuçlar elde edilir Ek monoolein miktarı kalan precipitant çözüm kristalizasyon taşınan hacmi bağlı olacaktır.
  9. Bir başlangıç olarak test (LCP faz beklendiği gibi) örnek sertlik ve Yükselt-yetenek için şırınga coupler boş şırıngadan ayırmak ve, şırınga dikey tutarak, örnek küçük bir miktar sıkmak (< 2 µL) baðlantý birimi yoluyla. Bir dik silindir haddelenmiş örnek formlar, örnek ekstrüzyon test etmek için hazırsınız.
  10. 100 µL için örnek hacmi (aynı derecede içinde adım 1.5) daha premix LCP ekleyerek ayarlayın.
  11. Örnek şırınga ve iki boş şırınga (coupler önce gelen Hava Temizleme) üç yönlü şırınga coupler iliştirin. En az 50 kez (veya kadar homojen) mix örnek yarısı ikinci şırınga geçen ve örnek iki yarısını üçüncü şırınga aynı anda basarak.
  12. Kristalleri homojen bir dağılım doğrulamak için stereo mikroskop altında karışık örnek içeren şırınga yerleştirin.

2. yüksek hızlı kamera Kurulumu kullanarak örnek ekstrüzyon testi

  1. Deneysel parametrelerin belirlenmesi.
    1. Test için meme boyutunu seçin.
      Not: Meme boyutları genellikle 50-75 µm iç çapı (ID), ama kabaca 30-100 µm kimliği kabul edilebilir herhangi bir boyutu vardır. Seçim ortalama tıkanma zaman, arka plan saçılma, örnek tüketimi ve isabet oranı arasında bir denge temel alır.
    2. Deneysel lazer nokta boyutu (1/e2 çapı) ve (örneğin, araya eklenmiş ışık ve karanlık) düzeni XFEL kullanılacak olan veri toplama göre optimum akış hızı hesaplamak.
    3. Hesaplamak istediğiniz akış hızı (figure-protocol-1) örnek optimum akış hızı (figure-protocol-2) ve seçili meme çapı (figure-protocol-3):
      figure-protocol-4
      Akış hızı belirlemek (figure-protocol-5) amplifikasyon faktör dayalı HPLC pompa girilmelidir (figure-protocol-6), enjektör.
      figure-protocol-7
      Maksimum basınç hesaplamak (figure-protocol-8) meme bağlantı parçaları anma basıncı üzerinden (figure-protocol-9) ve enjektör büyütme faktörü (figure-protocol-10):
      figure-protocol-11
  2. Yüksek viskozite ekstrüzyon enjektör şekil 1' deki gösterildiği gibi çevrimdışı kullanım için kurulumu.
    Not: Çift Kompenantlı hidrolik macun aracılığıyla enjektör işlevleri bir HPLC pompası tarafından desteklenmektedir ve Gaz Regülatörü tarafından denetlenen bir ortak akan helyum gaz kılıf kullanır. Pompa ve regülatör kurulum değil bu protokol için ele alınmıştır. Ayrıntılı bir kılavuz için James (2015)48 yılında dördüncü bölüm bkz.
    1. Pompa ve flowrates doğru olduğundan emin olmak için tüm su hatları temizlemek. Enjektör Hidrolik sahne temizlemek.
    2. Enjektör (ya da kamera) çerçeveleme ve odaklama için yüksek hızlı video kolaylaştırmak için üç eksenli sahnede bağlayın. Objektif lens, aydınlatma, yansıtıcı ekran ve harcanan örnek yakalamak için küçük bir ölçek için enjeksiyon nokta etrafında boşluk bırakın.
    3. Bir "kukla meme" oluşturmak (bağlı bir meme ile boş bir rezervuar) ve enjektör üzerinde konumlandırma, odak ve aydınlatma kolaylaştırmak için yükleyin.
    4. Meme ucu objektif odak noktası yakınındaki yüksek hızlı kamera bağlayın.
    5. Enjektör arkasında yansıtıcı ekran konumlandırın ve aydınlatma açık-meme ışık için ayarlayın.
    6. Açmak ve kameraya verilen yazılımı ile bağlayın. Görsel geribildirim için çalışan bir canlı video ile meme ucunu çerçevesinin ortasında konumlandırın ve üç eksenli sahne ile odak haline getirmek.
    7. Aydınlatma edene kadar meme açıkça görülmeye başlıyor ve arka plan aydınlatılmış eşit olarak ayarlayın.
  3. Kameranın yüksek hızlı time-lapse video kaydetmek için yapılandırma.
    1. 1000 FPS set framerate. Çözünürlük 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.
    2. Meme görünene kadar maruz kalma süresi şimdi tarafından kare hızını ayarlamak için aydınlatma düzeyini ayarlayın (yani, altında değil-ya da pozlanmış). Meme ucu bu ortalanacak şekilde yeniden konumlandırmak soldan sağa ve çerçevenin üst üçüncü yer alır.
    3. Herhangi bir arka plan düzeltme veya beyaz dengesi işlemleri çalıştırmak.
    4. Kameranın hızlandırılmış modunda ayarlayın. İçin belirlenen aralıkta 30 s ve tekrarlar 40 kez, rasgele (veya rasgele Sıfırla) tetikleyici modunu ayarlayın ve 1000' e kaydetmek için kare sayısını girin.
  4. Havzanın 20 µL test örneği ile yük ve kapiller başlık ekleyebilirsiniz.
  5. Dolgulu rezervuar enjektör için ekleyin. Gaz borusu meme üzerinde bağlantı noktasına ekleyin ve gaz akışı başlar.
  6. El ile piston hatlı vana açma ve şırınga basarak önceden. Piston rezervuar örnek ile sağlam iletişim kurduğunda vanayı kapat.
  7. Hesaplanan akış hızı ile pompa program ve maksimum basınç hesaplanan değere ayarlayın (bkz. Adım 2.1.3).
  8. Pompa ve kamera kaydı da eşzamanlı olarak başlatılır.
  9. Ekstrüzyon başladığında, istikrarı artırmak için gaz basıncı ayarlayın. Eğer bir sütun yerine meme ucunda bir damla sıvı formlar gaz basıncı artırmak. Ekstrüzyon gaz akışı aşırı makas nedeniyle bozuk veya hızla salınan azalma basınç (kırbaçlanan).
  10. Ekstrüzyon izlemek (10 dk olduğunu genellikle homojen akışı durumu tanımak yeterli) ve pompa basınç keskin beklenen bitiş saati hızlanınca, kaydı, pompa kapatmak kapa durdurmak ve sistem basınç tahliye vanası açarak delik.
  11. Video dosyalarını analizi
    Not: açıkça yetersiz örnek ekstrüzyon detaylı bir analiz gerektirir. Ancak, örnek optimize başarısızlık modu belirlemek yine de yararlıdır.
    1. (Örneğin, Fiji49) analiz yazılımı ile video dosyasını açın ve ölçüm araçları kalibre.
    2. Ölçümler bilinen uzunlukta bir satır satır Seçim aracıyla görüntüyü seçerek kalibre. Analiz yoluyla Ölçeği ayarla penceresini açın | Ayarla ölçek ve bilinen mesafe ve ölçü birimlerini girin.
      Not: Bilinen çapı çıkmasına izin verir bu ölçümler için yeterli kalibrasyon uzunluğu sağlar.
    3. Bir çerçeveyi video bulmak içinde ekstrüzyon izlenebilir özelliği görünür (örneğin, bir kristal) olduğu. Çerçeve kaydedin.
    4. Video nerede aynı özellik görünür ama önceki adımda pozisyonundan taşındı bir çerçeveye ilerlemek. Çerçeve kaydedin.
    5. Düz çizgi ölçüm aracını kullanarak özellik başlangıç ve bitiş noktası analiz yoluyla mesafe ölçmek | Ölçü.
      Not: Artık izlenebilir mesafe, daha az sayıda hataları ölçümdeki hesaplamaları etkiler
    6. Hesaplama jet hızı ölçülen mesafe ve geçen süre (framerate tarafından bölünmüş geçen çerçeve sayısı.)
    7. Adımları 2.11.3-2.11.6 video her segment için bir kaç kere tekrar edin.
    8. Şekil 2gibi veri serisini çizdirme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yordamları (şekil 3) için ideal başlangıç malzeme için enjektör viskoz taşıyıcı orta dahil microcrystals yüksek yoğunlukları vardır. Kristal bin Ladin'in taşıyıcı her hazırlık için yaklaşık 50 µL için yordamı çağırır. Bunlar doğrudan içinde LCP burada, örneğin (şekil 4), kullanılan veya geleneksel buharı difüzyon kurulumları içinde yetiştirilen kristalleri kullanılarak hazırlanan bR9,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TR-SFX yöntemi ile viskoz ekstrüzyon enjektör bacteriorhodopsin9,10 photosystem II ve13 yapısal dynamics çalışmaları için uygun bir teknik olduğu kanıtlanmıştır ve şimdi diğer sürüş proteinler çalışmaya hazır görünüyor İyon ışık temelli taşıma veya duyusal algı5,50fotoğraf biyolojik işlemler. Yukarıda açıklanan protokoller bacteriorhodopsin TR-SFX veri toplama başarısı en üst düzey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çakışan ilgi bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gebhard Schertler, Rafael Abela ve Chris Milne yüksek viskozite enjektörleri PSI adlı kullanımını desteklemek için anıyoruz. Richard Neutze ve ekibi tartışmalar zaman çözüldü kristalografisi ve yüksek viskozite enjektörleri kullanarak örnek teslimat için kabul vardır. Mali destek için hibe 31003A_141235, 31003A_159558 (js için) İsviçre Ulusal Bilim Vakfı anıyoruz ve PZ00P3_174169 (için P.N.). Bu proje Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı kapsamında Marie-Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi No 701646 fon aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sivrisinek LCP Şırınga KaplinTTP labtech mağazası3072-01050
Hamilton Şırınga 1710 RNR, 100 ve mikro; lHamiltonHA-81065
Hamilton Şırınga 1750 RNR, 500 ve mikro; lHamiltonHA-81265
MonooleinNu-Chek Hazırlık, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipidler A.Ş.850534O
%50 w/v PEG 2000Moleküler BoyutlarMD2-250-7
Parafin (sıvı)Sigma-Aldrich1.07162
Yüksek hızlı kameraPhotronPhotron Mini AX
Yüksek büyütmeli lensNavitar12X Zoom Lens Sistemi
Üç eksenli kademeliThorLabsPT3/M
Fiber ışıkThorlabsOSL2
Erimiş silika elyafMolex/PolymicroTSP-505375
Lite dokunmatik yüksükIDEXLT-100
ASU yüksek viskoziteli enjektörArizona Eyalet ÜniversitesiUwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pompasıShimadzuLC-20AD'den
Elektronik gaz regülatörüOran HavaGP1
satın alınabilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718(2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309(2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703(2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484(2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621(2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292(2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585(2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314(2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602(2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Time resolved Serial Femtosecond CrystallographyHigh Viscosity ExtrusionMicrocrystal DeliveryThree way Syringe CouplerLipidic Cubic PhaseHigh speed Camera AnalysisExtrusion Stability TestingBacteriorhodopsin MicrocrystalsXFEL Sample InjectionLCP Sample Preparation

İlgili makaleler