Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Özet

Bu iletişim kuralı fare uzun kemik ve kemik iliği makrofajlar oluşturup Osteoklastlar makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) kullanarak üretmek için kemik iliği yalıtım, diseksiyon içerir veya tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve anti-c-fms antikor, M-CSF reseptör tarafından onların tutuklama.

Özet

Kemik remodeling karmaşık bir süreçtir ve ifade ve rezorpsiyonu dönemleri içerir. Kemik rezorpsiyonu tarafından kemik Osteoklastlar farklı uyaranlara yanıt olarak tarafından bozuldu bir süreçtir. Osteoklast öncüleri makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) yanıt olarak multinuclear Osteoklastlar içine ayırt etmek. Patolojik koşullarda sitokin profili farklıdır ve inflamatuar sitokinlerin karışımı içerir. Bu bölgelerde inflamatuvar mekanizmaları ile ilgili büyük miktarlarda bulunur gibi tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) en önemli sitokinler biridir. Hangi fare kemik iliği Osteoklastlar M-CSF ve RANKL veya daha sonra anti-c-fms antikor, reseptör doz artırarak inhibe TNF-α ile indüksiyon yoluyla oluşturmak için izole bir yöntem sağlamak amacıyla bu iletişim kuralının amacı olduğunu M-CSF. Bu deney anti-c-fms antikor inflamatuar kemik rezorpsiyonu hastalıklarında tedavi edici değerini vurgular.

Giriş

Osteoklastlar uzmanlaşmış hücrelerdir ve hematopoetik kök hücre birden çok Osteoklast öncüleri füzyonu sayesinde ayırt. Onlar romatoid artrit ve periodontal hastalık¹gibi inflamatuar osteolitik hastalıklarla ilişkili patolojik kemik rezorpsiyonu katkıda ve sağlıklı kemik tadilat nedeniyle gereklidir.

Osteoclastogenesis ve Osteoklast işlevi iki anahtar faktör tarafından aracılı; makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör kappa B ligand (RANKL). M-CSF ve RANKL Osteoklast farklılaşma²için önemlidir. Kemik iliği makrofajlar tüp bebek üzerinden Osteoklast oluşumu ikna etmek için gösterilen başka bir tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α)^3,4,5faktördür. TNF-α Osteoliz romatoid artrit⁶, periodontal hastalık⁷ve Postmenopozal Osteoporoz⁸gibi yıkıcı kemik hastalıklarında için kritik olmak aracılı Osteoklast oluşumu gösterilmiştir.

C-fms M-CSF membran reseptör ve eylem aracılık eder. C-fms (anti-c-fms antikor) karşı bir antikor yönetimini tamamen osteoclastogenesis artrit modelinde tutuklandı yanı sıra TNF-α içinde kemik erozyonlar süre indüklenen gösterilmiştir gibi c-fms rolü de literatürde belgelenen iltihaplı eklem üzerinden uzak osteoclastogenesis hala sağlam⁹yaşındaydım. Anti-c-fms antikor İdaresi Osteoklast oluşumu ve kemik rezorpsiyonu fare calvariae¹⁰ de olduğu gibi LPS kaynaklı periodontitis modeli¹¹. lipopolysaccharide (LPS) tarafından indüklenen inhibe Ayrıca, anti-c-fms antikor mekanik stres kaynaklı kök rezorpsiyonu ortodontik diş hareketi¹², aynı zamanda Ortodonti diş hareketi sırasında ve ortodontik diş hareketi¹³ile ilişkili kemik rezorpsiyonu inhibe.

M-CSF konak immün yanıt için gerekli olan diğer işlevler için rapor edildi. M-CSF bakteriyel pnömoni ile op/op farelerde yokluğu bakteri yükü ve karaciğere hepatik nekroz¹⁴ile bakteri yayılmasını artış yol açar. Bu nedenle, M-CSF enfeksiyon korunmasında immünolojik yanıt için önemlidir.

Bu çalışmada anti-c-fms antikor etkisi M-CSF ve RANKL veya TNF-α Osteoklast oluşumu tüp bebek indüklenen ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması indüklenen gösterir. Bu iletişim kuralı yalıtım fare kemik iliği hücrelerinin uzun kemiklerde ve Osteoklast öncüleri kabul edilmektedir kemik iliği makrofajlar (BMM) oluşturmak ve BMM farklılaşma multinuclear Osteoklastlar içine iki tarafından ikna etmek için adımları gösterir yöntemleri; RANKL veya TNF-α. Protokol Ayrıca anti-c-fms antikor kullanarak her iki yöntem de osteoclastogenesis tutuklanması karşılaştırır.

Hangi kemik iliği çıkarılan ve daha sonra Osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan büyük miktarlarda uyuşturucu testi gibi birden çok downstream uygulamalarında kullanılan saf Osteoklast kültürlerin üretiminde güvenilir işlemidir. RANKL ya da TNF-α osteoclastogenesis bu protokolündeki ikna etmek için osteoclastogenesis fizyolojik bir süreç (RANKL) olarak osteoclastogenesis hangi sırayla rehberlik için iki alternatif yordam sağlar bir patolojik süreç olarak (TNF-α) ayıran bir aşağı akım uygulamalarda kullanılmak üzere reaktifleri açısından üstün olduğu karar. Bu iletişim kuralı Ayrıca hangi tarafından biz güvenli bir şekilde daha sonraki çalışmalar kemik rezorpsiyonu ve osteolitik hastalıklar için kullanılan anti-c-fms antikor uygun bir konsantrasyon belirleyebilirsiniz bir yöntem sağlar.

Protokol

Tüm hayvan yordamlar ve hayvan bakımı Tohoku Üniversitesi kurallara ve düzenlemelere göre yapıldı.

1. fare Hindlimb diseksiyon ve işleme

1. Diseksiyon önce bir tabak α-MEM konteyner boyutuna bağlı olarak yaklaşık 50 mL ile doldurun ve Buza koyun. Tüm kemikler diseksiyon tamamlanana kadar bu bir koleksiyon kapsayıcı olarak görev yapacak. Bu ve sonraki deneyler, α-MEM içeren % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 IU/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin kullanın.
2. C57Bl/6J fare %5 isoflurane aşırı dozda inhalasyon tarafından ötenazi.
3. Avuç içi ve ayak ve % 70 etanol ile iyice sprey ile deldi iğne kullanarak bir sırtüstü pozisyonda fare düzeltmek.
4. Steril Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kalça düzeyinde bir cilt kesi yapmak ve kasları açığa feet aşağı genişletir.
5. Kuadriseps kas ekleme tendon ve hamstring kas kemik ekleme tendon kesti. Kalça ve diz eklem açığa kasları peel Away. Bu tendonlar bulma yumuşak doku Etiketler terk etmeden her iki kas onların eklerinden boşaltma kolay olmayacaktır. Kemiğin içine kesme.
6. Makas uyluk kemiği başı ve ortak alanı arasında konumlandırın ve femur azat ama kemik olduğu gibi tutmak kesti. Bu dekolmanı kemik kemik iliği görünmesi riski olmadan sağlar.
7. Benzer şekilde tibia bağlama kasları Kes gitsin. Onun ekten ücretsiz tibia kemik kirlenmesini önlemek için olduğu gibi tutmak ayak bileği eklemi kes.
8. Femur ve tibia makas bıçakları ve kimwipe kullanarak herhangi bir kalan yumuşak dokudan raspa ve α-MEM buza yerleştirilir ile bir tabak içinde yerleştirin.

2. fare Hindlimb kemik iliği yalıtım

1. 30 G iğne şırınga α-MEM ile doldurun.
2. Diz eklemi uzak femur ve tibia kesmek.
3. Makas kullanarak her iki taraftan uzun kemik ucu kesilmiş.
4. Cımbız kullanarak şaft kemiğinden tutun, kemik iliği uzaya iğne yerleştirin ve yavaş yavaş bir 6 cm kültür tabak içine kemik iliği içeriğini floş. Kemik kemik iliği içeriğin tümü ayıklama gösteren beyaz görünür. Tüm kemikler için yineleyin.
5. Zorlanma kemik iliği ayıklamak bir 50 mL konik santrifüj tüpü ve 5 min için 300 x g , santrifüj içine bir 40 mikron naylon hücre süzgeç kullanarak.
6. Süpernatant atmak, α-MEM 5 mL ile yıkayın ve 300 x g 5 dakika süreyle de tekrar yıkama 2 kez olmak üzere toplam santrifüj kapasitesi.
7. Pelet α-MEM 10 mL resuspend ve bir hemasitometre aşağıdaki gibi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirin:
   1. 1:1 seyreltme hücre süspansiyon hücre süspansiyon 10 μL %0,4 trypan bir 1,5 mL tüp içinde mavi 10 μL ekleyerek yapmak ve bir kez pipet.
   2. Hemasitometre odası ile bir slayt kapak kapak ve boya süspansiyon hemasitometre için transfer. Değil bantlayın veya odası underfill ve süspansiyon odası kılcal eylem tarafından doldurmak izin vermek önemlidir.
   3. Hemasitometre mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin. 10 x amacı istimal, Merkez meydan odaklanmak. 3 çizgilerle bağlı tüm hücreleri saymak. Hücreleri iki kez sayılmaz emin olmak için her bir kare ve sağ üst köşelerine saymak. Ölü hücreleri koyu mavi görünür, bunlar sayımdan hariç tutulur.
8. Aşağı akım uygulamaya bağlı olarak, hücre bir uygun kültür gemi tohum. Bu özel deneme için Bölüm 3 izleyin.

3. nesil BMM

1. Tohum 1 x 10⁷ hücreler/10 mL 10 cm çanak kültür ve M-CSF 100 ng/mL ekleyin. Son M-CSF 100 ng/mL kültür ortamının bölgedir. Kültür 37 ° c, % 5 CO₂ 3 gün kuluçkaya.
2. 3 gün sonra kültür orta kaldırmak, fosfat tamponlu tuz (PBS) iki kez yapışık olmayan hücreleri kaldırmak, oda sıcaklığında %0.02 tripsin-EDTA 5 mL eklemek için 10 mL şiddetle hücrelerle PBS içinde yıkayın ve 37 ° c, % 5 CO₂ 5 min için kuluçkaya.
3. Hücreleri ayrıntılı pipetting tarafından bağlantısını kesin. Kültür (hücreleri yuvarlak ve medya kayan görünmesi gereken) bir mikroskop altında gözlemleyerek hücreleri ayırdıktan olduğunu emin olun. Hücreleri bağlı kalır, iyice onları ayırmak için pipetting işlemini yineleyin. Hücreleri müstakil, 5 mL tepki devre dışı bırakabilirsiniz için α-MEM de ekleyin.
4. 50 mL konik tüp ve 5 dk. atma süpernatant 300 x g , santrifüj içine hücreleri toplamak ve α-MEM 5 mL ile yıkayın.
5. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve Pelet α-MEM 10 mL resuspend.
6. Daha önce 2.7.1. adımda açıklandığı gibi bir hücre sayısı gerçekleştirin.
7. Tohum 1 x 10⁶ hücreler/10 mL 10 cm çanak kültür ve M-CSF 100 ng/mL ekleyin. Son M-CSF 100 ng/mL kültür ortamının bölgedir. Kültür 37 ° c, % 5 CO₂ 3 gün kuluçkaya.

4. nesil Osteoklastlar BMM üzerinden Osteoklast öncüleri olarak

1. 3 gün sonra BMM adımları 3.2-3.7 takip Osteoklast öncüleri temsil bağlı hücre hasat.
2. Tohum BMM, 5 x 10⁴ hücreleri/200 μL α-MEM 96 iyi plaka. RANKL 50 ng/mL veya TNF-α son bir konsantrasyon 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. M-CSF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ekleyin.
3. Anti-c-fms antikor Ekle (0, 1, 10, 100, son konsantrasyonları 1000 ng/mL) her şey için.
4. 37 ° c, % 5 CO₂ 4 gün kuluçkaya. Medya 4 gün boyunca her gün değiştirin.

5. tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) leke

1. Kuluçka 4 gün sonra yavaşça her şey kültür orta Aspire edin. Her oda sıcaklığında 1 x PBS 200 μL ile de bir kez yıkayın.
2. Her şey fiksasyon için % 10 formalin 200 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Formalin Aspire edin ve her şey 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
3. 0,2 her PBS Triton X-100 permeabilization için iyi ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya % 200 μL ekleyin. Triton X-100 Aspire edin ve her şey 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
4. TUZAK leke çözüm 200 μL her şey için ekleyin. Mikroskop altında leke görselleştirin. Üzerinden düzgün geliştirmek leke için 10-30 dakika sürer.
5. Leke ve her deiyonize su ile 3 kez iyi ve kuru hava yıkama Aspire edin. Daha fazla gözlem kullanmak için oda sıcaklığında tutmak.

6. nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil

1. Tohum BMM Osteoklast öncüleri, 5 x 10³ hücreleri/200 μL, α-MEM 96 iyi plaka olarak. M-CSF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ekleyin.
2. Anti-c-fms antikor Ekle (0, 1, 10, 100, son konsantrasyonları 1000 ng/mL) ve 37 ° c, % 5 CO₂ orta değiştirmek olmadan 3 gün kuluçkaya.
3. 3 gün sonra 1 x PBS hücrelerle yıkayın. α-MEM 100 μL her şey için ekleyin.
4. 10 μL seti çözüm sayma Hücre Ekle ve 37 ° c, % 5 CO₂ 2 h için kuluçkaya ve 450 her kuyuda Absorbans belirlemek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı Osteoklast oluşumu RANKL veya TNF-α huzurunda anti-c-fms antikor etkisini değerlendirmek ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması üzerindeki etkisini belirlemek için amaçtır. Bu protokol için biz güvenilir bir süreç büyük miktarlarda saf Osteoklast kültürler tarafından oluşturulduğu sağladı. Biz de farklı kültür koşullar altında Osteoklast oluşumu inhibe için uygun toplama anti-c-fms antikor test etmek için bir yol sağladı.

Tartışma

Bu çalışmada, biz anti-c-fms antikor RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α-indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen Osteoklast habercisi yayılması üzerindeki etkisini araştırdık. Biz anti-c-fms antikor osteoclastogenesis RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen yaygın Osteoklast öncüleri arasında inhibisyonu için etkili miktarı farklı olduğunu fark ettik.

RANKL aracılık eder osteoclastogenesis M-CSF tüp bebek huzurunda ve sırası boş...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-c-Fms antikoru			AFS98, bir sıçan monoklonal, antimurin, c-Fms antikoru (IgG2a)
TNF-&alfa;			Laboratuvarımızda hazırlanan rekombinant murin TNF-&alfa. TNF-&alfa; RT-PCR ile klonlanan ve bir GST-füzyon proteini oluşturmak için bir pGEX-6P-I'ye (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) klonlanan cDNA fragmanı. GST-TNF-&alfa; Escherichia coli BL21 hücre hücrelerinde (Stratagene, La Jolla, CA) eksprese edildi. Hücreler denatüre olmayan koşullar altında parçalandı ve GST-TNF-&alfa; bir glutatyon-Sefaroz sütunu üzerinde saflaştırıldı. GST, üretici tarafından PreScission Protease (Amersham Biosciences) tarafından ayrıldı yönleri ve bir glutatyon-Sefaroz sütunu tarafından çıkarıldı.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Rekombinant Murin sRANK Ligandı, Kaynak: E. coli
M-CSF			Rekombinant insan M-CSF. 1/10 hacim CMG14– 5x10 < sup> 6 < / sup> nbsp'de 12 hücre hattı kültürü süpernatanı; 10 cm'lik bir süspansiyon kültür kabındaki hücreler.
α-MEM	Wako		, L-Glutamin ve fenol kırmızısı ile
Fetal Sığır Serumu	Biowest	s1820-500	Fetal Sığır Serumu Fransız Kökenli
Kültür kabı	Corning		100 mm x 20 mm stil çanak
96 kuyulu plaka	Thermofischer Scientific		Nun clon Delta yüzey
Hücre sayma kiti-8	Dojindo, Kumamoto, Japonya
Mikroplaka okuyucu	Gündoğumu UZAKTAN KUMANDA; Tekan Japonya, Kawasaki, Japonya
Hücre süzgeci	Corning		40 & mu; m Naylon
Santrifüj tüpü	Corning		50 mL CentriStar kapağı
Triton X-100	Wako		Polioksietilen (10) Oktifenil eter