Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

7.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59107

⸱

23 Mayıs 2019

 , 
1Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

Bu makalede

Özet

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Özet

Akut Greft-versus-Host hastalığı (GVHD), hematolojik eksiklikler ve malignite tedavisi olarak hematopoetik kök hücre nakli yapan hastalar için önemli bir sınırlamadır. Akut GVHD, donör T hücrelerinin bir yabancı antijen olarak ana dokular tanımak ve ev sahipliği için bir bağışıklık yanıtı monte oluşur. Mevcut tedaviler enfeksiyon ve nüks duyarlı hastalar render toksik immünrepresif ilaçlar içerir. Böylece, etkili bir şekilde donör T hücrelerini hedef ve yan etkileri azaltmak akut GVHD tedavisi sağlamak için sürekli araştırma vardır. Bu öncesi klinik çalışmanın çoğu, bir in vivo sistemde murine hücreleri yerine insan hücrelerinde immünopresif tedavilerin test edilmesini sağlayan ksenojen GVHD (xenogvhd) duvar modelini kullanır. Bu protokol, xenoGVHD 'ye nasıl neden olduğunu ve tutarlı sonuçlar sağlamak için klinik skorlamayı nasıl kör ve standartlaştırmayı özetliyor. Ayrıca, bu protokol, daha sonra test edilen tedavilerin etkinliğini ölçmek için kullanılabilecek fare dokularında insan T hücrelerini algılamak için dijital PCR nasıl kullanılacağını açıklar. XenoGVHD modeli sadece GVHD terapileri test etmek için bir model ancak daha sonra birçok inflamatuar hastalıklara uygulanabilir insan T hücrelerini bastırabilir herhangi bir tedavi sağlar.

Giriş

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (HSCT), lösemi gibi hematolojik malignite hastalarında kötü prognoz ile rutin tedavi haline gelmiştir. HSCT 'nin önemli bir komplikasyonu akut Greft-versus-Host hastalığıdır (GVHD). Bir 2012 çalışma, akut GVHD 'nin HSCT hastalarının% 39 ' inde, kardeş bağışçılardan nakil alan hastaların% 59 ' inde, alakasız bağışçılar1' den nakli alan hastalarda geliştiği bildirildi. Akut GVHD, donör türeyen T hücrelerinin alıcı organlarına saldırırken oluşur. GVHD için tek başarılı terapi, son derece toksik olan ve enfeksiyon ve tümör nüks riskini artıran, son derece immünpresif ilaçlar2ile tedavi etmektir. Böylece, son yıllarda akut GVHD hayatta kalımına yapılan iyileştirmeler rağmen3,4,5, hala uzun vadeli remisyon teşvik minimal toksisite ile geliştirilmiş GVHD tedaviler için kritik bir ihtiyaç vardır.

Aşağıdaki yöntemlerin genel amacı, xenogeneic GVHD 'yi (xenoGVHD) teşvik etmek ve puanlar etmektir. XenoGVHD modeli klinik deneyler için önceden klinik GVHD araştırma daha doğrudan çeviri için izin murine hücreleri yerine insan hücreleri ile akut GVHD ikna etmek için bir araç olarak geliştirilmiştir6. Bu model, intravenöz olarak insan periferik kan mononükleer hücreleri enjekte eder (PBMC) içine NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) sublethally ışınlanmış fareler. Enjekte insan T hücreleri insan antijen sunan hücreler tarafından aktive edilir (APCs) murine antijeni sunan ve aktif T hücreleri sistemik inflamasyona neden uzak dokulara göç ve sonuçta ölüm6,7, 8 , 9 , 10. hastalık patolojisi ve xenoGVHD modelinde progresyon yakından insan akut GVHD taklit. Özellikle, patojenik insan t hücreleri, insan GVHD6,9' da T hücresi kodlamaktadırlar 'a benzeyen, murine büyük histouyumluluk kompleksi (MHC) proteinlerine reaktif olmaktadır. XenoGVHD modelinin birincil avantajı fare MHC-uyuşmazlığı modeli, diğer yaygın olarak kullanılan GVHD modeli üzerinde, insan hücreleri yerine murine hücreler üzerinde tedaviler test etmek için izin verir. Bu, insan hücrelerini hedef almak için yapılan herhangi bir değişiklik olmadan doğrudan kliniğe tercüme edilebilir ürünlerin test etmek için izin verir. Son zamanlarda, bu model bir insan anti-IL-2 antikor test etmek için kullanılan11, insan timik düzenleyici T hücreleri (tregs)12 ve insan mesenkimal kök hücreleri13 akut GVHD için potansiyel tedaviler olarak. Daha geniş bir bağlamda, bu model, insan T hücresi etkinliğini bastırabilir herhangi bir ilaç veya hücre türü için bir in vivo bastırma tahlil olarak kullanılabilir. Örneğin, stockis ve al.14 , xenogvhd modelini, αvβ8 entegrenin engelleme efektini in vivo olarak Treg baskılayıcı aktivitesinde incelemek için kullandı . Böylece, xenoGVHD modeli bir in vivo ayarında T hücrelerini hedefleyen herhangi bir tedavinin mekanizması içine anlayış sağlayabilir.

Bu protokolde açıklanan ek bir yöntem, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) kullanarak fare dokularındaki insan T hücrelerini nasıl algılayabilirsiniz. Bu yöntemin amacı, bu modelde test edilen immünosupresif tedavilerin etkinliğini ölçen hedef dokularda T hücrelerinin göç ve proliferasyonu ölçmek için bir araç sunması. dPCR, nükrenik asitlerin ölçülmesini belirlemek için nispeten yeni bir yöntemdir15. Kısaca, PCR reaksiyon karışımı, hedef dizinin az sayıda veya hiçbir hedef içeren bölümlere ayrılır. Hedef dizi daha sonra güçlendirilir ve DNA enterkalasyon boyalar veya floresan hedef spesifik problar kullanılarak algılanır. dpcr pozitif bölümler ve Poisson istatistikleri15,16kesir dayalı hedef dizinin kopya sayısını nicelik. DPCR ile T hücrelerinin tespiti, Akış sitometrisi ve histolojisi de dahil olmak üzere diğer alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında çok daha az doku gerektirir ve dondurulmuş veya sabit doku üzerinde yapılabilir. dPCR kopya numaralarını belirlemek için standart bir eğri gerektirmez, ne de teknik çoğaltır gereklidir. Bu, geleneksel nicel PCR (qPCR)16Ile karşılaştırıldığında dpcr için gereken reaktif ve şablon DNA miktarını azaltır. PCR reaksiyonunun dPCR 'de alt reaksiyonlarına bölünmesi, hedefleri17' ye yoğunlaşır. Böylece, dPCR öncelikle olmayan hedef DNA büyük miktarda nadir hedefleri tespiti için bir araçtır. Örneğin, dPCR süt bakteriyel kontaminasyonu algılamak için kullanılan18, östrojen reseptör geni nadir mutasyonlar belirlemek19, ve hastaların KANıNDA dolaşan tümör DNA algılamak20. Bu protokolde dPCR, xenoGVHD ile fare dokularında insan T hücrelerini tespit etmek ve ölçmek için etkili bir araç olarak hizmet vermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fare denemeleri uygunluk ve onayı ile yapıldı, Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi. Tüm sağlıklı insan kanı örnekleri bilgilendirilmiş onay altında ve Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi 'nde kurumsal Inceleme Kurulu onayı ile elde edildi.

1. NSG fareler ışınlama

  1. PBMC enjeksiyonu için bir gün önce, 8 – 12 haftalık NSG fareler (ya seks kullanılabilir) radyasyona. Steril bir Biyogüvenlik kabininde, fare sterilize edilmiş bir pasta kafesi veya mikroizolatörde yer. Bir CS137 kaynak veya küçük hayvan radyatörü (örn., RS 2000) ırradiate fareler toplam doz Ile 150 cGy yavaş rotasyon bile ışınlama sağlamak için.
  2. Steril Biyogüvenlik kabininde fareler temiz kafeslere yerleştirin.

2. enjeksiyon için insan PBMC hazırlanması

  1. 1,1 x 107 PBMC fare başına izole etmek için yeterli sağlıklı insan kanı toplayın. Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) içinde 2% fetal sığır serumu (FBS) eşit hacimli heparinize kan seyreltilir.
    Not: Bu protokol Ile, PMBC verim genellikle 0,5 – 1 x 107 başına 10 ml tam kan. Her fare, PBS 100 μL 'de 107 PBMC alacaktır. Ekstra 1 x 106 ın 10 μL başına fare her fare PBMC tam doz almasını sağlar, herhangi bir sorun olması gerekir şırınga doldurma.
  2. 15 mL lenfosit ayırma yoğunluğu degrade Orta (örneğin, Ficoll) bir 50 mL konik tüp ekleyin ve daha sonra dikkatle yoğunluk gradyan üzerine 25 mL seyreltilmiş kan kadar bindirme. Yoğunluk degradesi ve seyreltilmiş kanı içeren tüpü 400 x g 'de, fren olmadan oda sıcaklığında 40 dakika boyunca santrifüjün.
  3. 50 mL konik tüpte PBMC arayüzünü 10 mL PBS 'ye topla. 400 x g 'de hücrelerin Santrifüjü 10 dakika boyunca kaldırın.
  4. PBMC yıkamak için 10 ml PBS tüp ve pelletini Flicking tarafından Pelet gevşetin. 400 x g 'de hücreleri 5 dakika santrifüjler.
  5. Isteğe bağlı Pelet hacmine eşit olan amonyum klorür-potasyum (ACK) liziz tamponunun bir hacmini ekleyerek hücre peleti içinde süpernatant ve Lyse kırmızı kan hücrelerini (RBCs) atın. Yavaşça Pelet pelletini ve girdap tüp 30-60 s. dolgu tüp serum-ücretsiz rpmi medya ve santrifüj tüp 400 x g 5 dakika.
  6. Süpernatant çıkarın ve PBS 5 ml hücre Pelet yeniden askıya. Bir hemokytometer ve mikroskop ile tripan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
  7. Hücreleri 5 dk. 400 x g 'de santrifüjler, PBS 'de 1 x 108 hücreli/ml 'de süpernatant ve pelletini hücrelerini çıkarın.

3. Retro-farelere ınsan PBMC orbital enjeksiyon21

  1. Sterilitesi korumak için bir laminar akış kaputu bir anestezi odası yerleştirin. Anestezi odasını 5 dakika boyunca% 5 isofluran ve 1 L/dak oksijen debisi ile ön şarj edin.
  2. Isoflurane 'i% 2 ' ye azaltın ve aynı kafesten anestezi odasına fareler koyun. Fareler nişan aldıktan sonra, 5 dakika boyunca farelere anestezi yapın. Bu süre zarfında, 100 μL (1 x 107 hücreli) hücreli süspansiyon ile şırıngayı önceden doldurun.
  3. Anestezi korumak için bir burun koni içinde burun ile bir Isıtma Pad üzerine fare yerleştirin. Bir ayak Pad pinching ve refleks eksikliği kontrol ederek bilinç kaybını kontrol edin.
  4. Başparmak ve orta parmak ile fareyi restrain. 28 G 1/2 iğne içine eğim ile medial canthus lateral aşağı yerleştirin, konjonktival membran göz geri ulaşılana kadar. İğneyi biraz geri çekin ve 100 μL hücre (1 x 107 hücre) yavaşça enjekte edilir.
  5. İğneyi tamamen geri çekin ve şırınga ve iğneyi düzgün bir şekilde atın. Göz kapağı kapatın ve bir gazlı bez sünger ile enjeksiyon site hafif basınç uygulayın.
  6. Şişme veya diğer görünür travma için enjeksiyon site inceleyin. Fare ev kafesi geçmeden önce yatak aspirasyonu önlemek için kağıt havlu ile kaplı steril bir kafes içinde bilinç yeniden kazanmak için izin verin. Herhangi bir kanama durdu sonra, analjezi için göz proparakain tek bir damla uygulayın.
    Not: kuyruk ven enjeksiyonu, Macholz ve al.22tarafından açıklandığı gibi bu protokol için PBMC intravenöz enjeksiyonu alternatif bir yöntemdir.

4. farelerde akut GVHD 'nin klinik skorlaması (Şekil 1)23

  1. Ölçü GVHD puan her gün fareler bir puan ulaşmak kadar 2 ve sonra her gün kurban gün kadar.
    1. Kafes bir laminar akış kaputu yerleştirin, gıda ve su kaldırmak ve kapağı geri koymak. 5 dakika fareler gözlemleyerek ve puanları aşağıdaki gibi atamak tarafından puanı aktivite : 0 = fare birkaç dakika içinde yürüyüş başlar ve kafes etrafında yürümeye devam eder, 1 = fare almak için bir kaç dakika sürer ve kafes etrafında yavaşça yürüyor, 2 = fare yukarı alamadım 5 dakika ve sadece dokundu zaman yürür.
  2. Bir cam kabı her fare tartmak ve kilo kaybı puanı vermek: 0 = <% 10 değişim, 1 = 10 – 25% değişim ve 2 = >% 25 değişim.
  3. Fare hala Beaker iken, duruşiçin kontrol edin: 0 = normal, 1 = dinlenirken hunching, 2 = hunching hareket zarar; kürk dokusu: 0 = normal, 1 = hafif için orta ruffling, 2 = şiddetli ruffling, ve cilt bütünlüğü : 0 = normal, 1 = pençeleri/kuyruk ölçekleme, 2 = denuded cildin belirgin alanları (kulak, kuyruk ve ölçekleme için pençeleri bakın).
  4. Beş kategori ve her kategori için 0 – 2 puan ile bir fare maksimum 10 puan ulaşabilir. Bir fare 7 veya daha büyük bir puan ulaştığında veya 42 gün sonrası enjeksiyon ulaştığında, CO2 ötenazi veya yerel kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış diğer yöntem aracılığıyla ötenize fare.
    Not: sonuçların doğruluğunu sağlamak Için Puanlama24tedavi gruplarına kör olan bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilir. Buna ek olarak, >% 20 ' si vücut kilo kaybı için tavsiye edilen insancıl uç noktadır, ancak bu protokolün ilave gerekçesi ile ıAKLUC onayı alınabilir.

5. ötenize farelerden genomik DNA için doku toplama ve genomik DNA 'Yı izole etme

  1. Steril Cerrahi aletler kullanarak fareler dissect. 3 mm x 0,5 mm büyüklüğünde küçük bir doku parçasını, örneğin, akciğer, karaciğer veya dalak gibi bir ilgi organından keser. Doku örneği tartmak ve steril 1,5 mL tüp doku parçası yerleştirin. Birden fazla doku toplama, her organ kesme arasında etanol ile yıkama araçları.
  2. Sıvı azot içinde doku içeren tüpler alt ederek dondurmak dokulara kadar köpüren durur ve mağaza-80 °C gece. Doku örneklerini çözün ve genomik DNA (gDNA) yalıtım setine göre onları Lyse.
  3. Üretici talimatlarına göre genomik DNA 'Yı kitte açıklandığı şekilde yalıtın. Elüe gdna (mg/μL) mikrolitre başına işlenen doku miktarını Not emin olun.
    Not: Frozen dokular daha sonra işleme için-80 °C ' de depolanabilir.

6. dijital PCR kullanarak insan T hücrelerinin ölçülmesini (Şekil 2)

  1. Dijital PCR reaksiyonlarını, kullanılan dijital PR makinesi için DNA bağlama boyaları protokolüne göre hazırlayın. İnsan CD3 Epsilon genomik DNA için özel aşağıdaki astar kullanın (NCBı referans sırası: NG_ 007383.1); İleri astar: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, ters astar: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Bu astar 105 BP tek bir bant verecektir.
    Not: genomik DNA 'yı sindirmek için her reaksiyon için Hindııı gibi bir kısıtlama enziminin 0,5 μL değerini ekleyin. Pozitif ve negatif damlacıklar ayrımı optimize etmek için farklı gDNA dilüsyonları test emin olun. Ayrıca, T hücrelerinin infiltrasyon bir alt kümesi patojenik olmayan düzenleyici T hücreleri olabilir. Bu hücreler düzenleyici T hücre işaretçileri için ek astar kullanılarak nicelik olabilir.
  2. Aşağıdaki koşullarda dijital PCR reaksiyonu gerçekleştirin: 105 °C ' de kapak, 95 °C ' de 10 dakika (1 döngü); 95 °C 30 s, rampa 2 °C/s ve 55 °C 1 dakika, rampa 2 °C/s (40 döngüleri); 72 ° 10 dk, 12 °C tutun.
    Not: Bu parametrelerin dijital PCR ekipmanlara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
  3. Analiz yazılımı ile dijital PCR verilerini edinin. Aşağıdaki denklemin kullanıldığı doku mg başına kopya sayısı olarak rapor verileri: (kopya/μL) x (reaksiyonda gDNA μL) x (seyreltme faktörü)/(Toplam gDNA mg doku/μL)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sublethally ışınlanmış 8-12-hafta eski NSG fareleri insan PBMC alınan her iki cinsiyetlerin gün etrafında GVHD klinik belirtileri görüntülemeye başladı 10 sadece PBS alınan negatif kontrol fareler ile karşılaştırıldığında Enjeksiyon sonrası (Şekil 1a). XenoGVHD fareler bir Median hayatta kalma 23,5 gün vardı (Şekil 1B). Dijital PCR ile, CD3 Epsilon pozitif insan T hücreleri insan PBMC alınan fareler akciğer ve karaciğer örnekleri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hastalık ilerlemesi genellikle xenoGVHD modelinde tutarlı, hatta farklı bağış PBMC enjeksiyon ile, bu yüzden birden fazla deney kombine edilebilir. Bu tutarlılığı korumak için gereken önemli adımlar doğru serum enjeksiyon tekniği, kör edici ve tutarlı skorlama. Nervi ve ark.25 tarafından yapılan bir çalışmada, intravenöz kuyruk ven enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, PBMC Retro orbital enjeksiyonları daha tutarlı Engraftman ve daha şiddetli GVHD sonuçlandı göstermiştir. Leon-Rico ve al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir ilgi çakışması ilan edildi.

Teşekkürler

Biz bu deneyler ve sağlanan teknik destek için kullanılan dijital PCR makine sağlamak için Lane Christenson Laboratuvarı kabul etmek istiyoruz. Ayrıca Dr. Thomas Yankee 'e rehberlik ve mentorluk için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışmalar Tripp Aile Vakfı tarafından destekleniyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL eppendorf tüpleriFisher05-408-129
10 mL serolojik pipetVWR International89130-898
10 mL BD Vacutainers - Sodyum Heparin ile kaplı yeşilBecton Dickinson366480
250 & mikro; L Ranin pipet uçlarıRainin17001118Damlacık oluşumu için başka pipetler veya pipet uçları kullanmayın
50 mL konik tüpVWR International89039-656
96 Kuyulu ddPCR plakasıBio-Rad12001925
ACK (Amonyum-Klorür-Potasyum) Lizing TamponuLonza10-548EOpsiyonel
Alkollü MendilFisher Scientific6818
Anestezi Odası DünyaHassas AletlerEZ-178Hayvan tesisi tarafından sağlanan
Anestezi MakinesiParkland ScientificPM1002Hayvan tesisi tarafından sağlanan
BD Vacutainer Safety-Lok Kan Alma SetiBecton Dickinson367281
QX100/QX200 Damlacık Jeneratörü için DG8 Kartuşları ve ContalarıBio-Rad1864007
DNAse ve RNAse içermeyen Moleküler Sınıf H2OYaşam Teknolojileri1811318
Moleküler biyoloji için Etil alkol, Saf, 200 kanıtSigma-AldrichE7023-500ML
Fetal Sığır SerumuAtlanta BiologicalsS11150
FicollFisher Scientific45001750
İnsülin ŞırıngaFisher Scientific
IsofluranSigma-AldrichCDS019936Hayvan tesisi tarafından sağlanır
Sıvı nitrojenN/AN/A
Fare Işınlayıcı Pasta KafesiBraintree Scientific, Inc.MPC 111 adede kadar fare alabilir
Nexcare Hassas Kağıt Bant (diğer adıyla 3M Mikro Gözenekli Cerrahi Bant / 3/4 inç)Fisher Scientific19-027-761
P1000 pipet makinesiMidSciA-1000
P200 pipetleyiciMidSciA-200
Delinebilir Folyo Isı YalıtımıBio-Rad1814040
Pipetaid Gilson MacromanFisher Scientific
Pipet-Lite Çoklu Pipet L8-200XLS+Rainin17013805Damlacık oluşumu için başka pipetler veya pipet uçları kullanmayın
Qiagen DNeasy Kan ve Doku KitiQiagen69506
qPCR plakalarıVWR International89218-292
QX200 Damlacık Dijital PCR SistemiBio-Rad12001925EvaGreen veya prob tabanlı dijital PCR uygulamaları için damlacık üreteci, damlacık okuyucu, dizüstü bilgisayar, yazılım, ilgili bileşen sarf malzemelerini içerir
Bio-Rad1864006QX200 ddPCR için QX200 Damlacık Üretim Yağı
EvaGreen SupermixBio-Rad1864033
RNase ve DNaz içermeyen plaka contasıThermo Scientific12565491
RPMI Advanced 1640Yaşam Teknolojileri12633012
Steril Gazlı Bez Pedleri (2" x 2", 12 Katlı)Fisher Scientific67522
Steril Fosfat Tamponlu SalinFisher Scientific21040CV
Steril rezervuarVWR International89094-662
Cerrahi MakasKent ScientificINS600393-4
Cerrahi ForsepsKent ScientificINS650914-4
329424F110756EvaGreen

Kaynaklar

  1. Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
  2. Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802. Blood. 124 (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).
  3. Gooley, T. A., et al. Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
  4. Hahn, T., et al. Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).
  5. Khoury, H. J., et al. Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era. Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).
  6. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  7. Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells. Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).
  8. Ito, R., et al. Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice. Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).
  9. Kawasaki, Y., et al. Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).
  10. Ito, R., et al. A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8. T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).
  11. Trotta, E., et al. A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism. Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).
  12. Dijke, I. E., et al. Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells. American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).
  13. Huang, F., et al. Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals. Frontiers in Immunology. 8, 68(2017).
  14. Stockis, J., et al. Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).
  15. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  16. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  17. Sykes, P. J., et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  18. Ma, H., et al. Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR. Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).
  19. Vitale, S. R., et al. An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA. Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).
  20. Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies. Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).
  21. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  23. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).
  24. Weisdorf, D. J., et al. Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).
  25. Nervi, B., et al. Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice. Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).
  26. Leon-Rico, D., et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice. LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).
  27. Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype. PLoS One. 7 (8), e44219(2012).
  28. van Rijn, R. S., et al. A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice. Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).
  29. Wunderlich, M., et al. OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues. Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).
  30. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).
  31. Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation? Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nsan T H cresi KantifikasyonuPeriferik Kan Monon kleer H creleriStromal Vask ler FraksiyonAk SitometrisiKlinik SkorlamaDoku SindirimiH cre zolasyonu
Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.