Burada, bir tahlil transposase erişilebilir Kromatin (ataç-seq) aktif CD4 + insan lenfositler üzerinde sıralama için gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Protokol % 50 mitokondrial DNA okuma yeni bir lizis arabellek başlanarak % 3 bulaşıcı en aza indirmek için değiştirildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
ATAÇ-seq tahlil birincil insan CD4 + T lenfositleri kirlenme düşük mitokondrial DNA ile
Bu makalede
Özet
Özet
ATAÇ-seq epigenetik genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme için hızlı ve basit yaklaşımı nedeniyle çalışmada yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Bu yazıda biz mitokondrial DNA okuma kirletici azaltır geliştirilmiş bir ataç-seq Protokolü mevcut. Önceki ataç-seq protokolleri ile mücadele var ise ortalama % 50 oranında mitokondrial DNA kirletici okur, bu protokol için sunulan en iyi duruma getirilmiş lizis arabellek % 3 ortalama mitokondrial DNA kirlenme azaltır. Bu gelişmiş ataç-seq iletişim kuralı sıralaması maliyet bir çevre % 50 azalma sağlar. Bu yüksek kaliteli ataç-seq kütüphanelerin aktif CD4 + lenfositlerinin, hazır nasıl CD4 + lenfosit izolasyonu tam kan veri analizi ile kimden adım adım yönergeler sağlama göstermektedir. Bu gelişmiş ataç-seq Protokolü hücre tipleri geniş bir doğrulanır ve Kromatin erişilebilirlik eğitim araştırmacılar için acele kullanma olacaktır.
Giriş
Tahlil transposase erişilebilir Kromatin (ataç-seq) sıralama için hızla Kromatin mimari sorguya için önde gelen yöntem haline gelmiştir. ATAÇ-seq tagmentation, parçalanan ve DNA'ın hangi ile karşıdan karşıya tüm bir genom Kromatin erişilebilirlik sıralama belirleyebilirsiniz kitaplıkları üretmek için aynı enzim tarafından etiketleme işlemi boyunca erişilebilir Kromatin bölgeleri tanımlayabilirsiniz. Bu tagmentation işlem yalnızca Kromatin nucleosomic steric engel nedeniyle açık bölgelerinde keser hiperaktif Tn5 transposase tarafından aracılık ettiği. Bu kesim, Tn5 transposase da hızlı Kütüphane İnşaat tarafından PCR ve yeni nesil sıralama genom genelinde erişilebilir ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu geliştirilmiş iletişim kuralı veri analizi (şekil 1) ile tam kan başlangıç malzemesinden ataç-seq CD4 + lenfosit, gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar.
1. yalıtım CD4 + T hücre tam kan
Not: Başlangıç bu iletişim kuralı için seçilecek başlangıç materyali kaynağıdır araştırma gereksinimleri temel alarak izin veren standart prosedürler kullanarak toplanan taze tam kan 15 mL malzemedir. Protokol gerektiği şekilde ölçeklendirin. Önceden sıcak fosfat tamponlu tuz (PBS) + %2 fetal buzağı serum (FCS) oda sıcaklığında (RT) için ve CD4 + T hücre zenginleştirme yor....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Taze tam kan 15 mL, bu protokol ortalama 1 milyon CD4 + T hücreleri oluşturur. Bunlar daha sonra işlenmek için dondurulmuş ya da hemen kullanılabilir. CD4 + T hücreleri, taze veya çözülmüş, canlılık olduğunu sürekli > % 95. Bu yöntem CD4 + T hücre izolasyon kaynak malzeme ve toplama zamanında için esneklik sağlar. Bu gelişmiş ataç-seq Protokolü 1 ng/µL sıralama için daha büyük bir final Kütüphanesi üretir. Kalite kontrol ticari olarak mevcut sistemleri kullanılarak yapılır DNA parçalar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede sunulan değiştirilmiş ataç-seq protokolü en az mitokondrial DNA kirlenme ile tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Protokol başarıyla Kromatin mimari insan birincil PBMCs10, insan monosit, fare dendritik hücreler (yayınlanmamış) karakterize ve kültürlü melanoma hücre11hatları için kullanılmıştır. Biz bu geliştirilmiş lizis tahmin durumu diğer hücre türleri için de iş potansiyeline sahiptir. Ayrıca bu çekirdeklerin yalıtım iletişim kuralı tek çekirdek ataç-seq protoko.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Atsede Siba teknik destek için teşekkür ederiz. C.S.C. NIH grant 1R61DA047032 tarafından desteklenir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1x PBS, Steril | Gibco | 10010023 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| 5810/5810 50 mL, 15 mL ve 1.5 mL Tüp Kovaları ile R Salıncak Kovalı Soğutmalı Santrifüj | Eppendorf | 22625501 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| 96 Kuyu Yuvarlak Alt Plaka | Thermo Scientific | 163320 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| Agilent 4200 Teyp İstasyonu Sistemi | Agilent | G2991AA | Kalite değerlendirmesi için önerilmiştir. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| Dynabeads İnsan T-Aktivatör CD3 / CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Kritik Bileşen |
| Dynabeads El Değmemiş İnsan CD4 T Hücreleri Kiti | Invitrogen Yaşam Teknolojileri | 11346D | Kritik Bileşen |
| Dynamagnet | Invitrogen Yaşam Teknolojileri | 12321D | Kritik Bileşen |
| FCS | İkizler Biyo Ürünleri | 100-500 | Diğer karşılaştırılabilir kullanabilirsiniz Ürünler. |
| Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti | Agilent | 50674626 | Kalite değerlendirmesi için önerilir. |
| Magnezyum Klorür, Hekzahidrat, Moleküler Biyoloji Sınıfı | Sigma | M2393 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| MinElute PCR Saflaştırma Kiti (Tampon PB, Tampon PE, Elüsyon Tamponu) | Qiagen | 28004 | Kritik Bileşen |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| NaCl, Moleküler Biyoloji Sınıfı | Sigma | S3014 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Kritik Bileşen |
| Nextera DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti (2x TD Tamponu, Tn5 Enzimi) | Illumina | FC1211030 | Kritik Bileşen |
| Nükleaz İçermeyen Steril dH20 | Gibco | 10977015 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| Polisorbat 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Kritik Bileşen |
| Hassas Su Banyosu | Thermo Scientific | TSGP02 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| QIAquick PCR Saflaştırma Kiti | Qiagen | 28104 | Kritik Bileşen |
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Kalite değerlendirmesi için önerildi. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Kalite değerlendirmesi için önerildi. |
| Rozet Eylül İnsan CD4+ Yoğunluk Orta | Kök Hücre Teknolojileri | 15705 | Kritik Bileşen |
| Rozet Eylül İnsan CD4+ Zenginleştirme Kokteyli | Kök Hücre Teknolojileri | 15022 | Kritik Bileşen |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| Steril Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
| T100 Isıtmalı Kapaklı Thermocycler | BioRad | 1861096 | Diğer benzer ürünleri kullanabilir. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Diğer karşılaştırılabilir ürünleri kullanabilir. |
Kaynaklar
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
