Method Article

Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama

DOI:

10.3791/59140

⸱

February 22nd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteom karakterizasyonu oküler mikrovasküler yatak birçok oküler patolojiler insanlarda derinlemesine anlayış için çok önemli. Bu çalışmada protein çıkarma ve küçük kan damarlarının kütle spektrometresi esaslı proteomik analizleri kapları modeli olarak domuz kısa arka silier arterler istihdam üzerinden numune hazırlama için etkili, hızlı ve güçlü bir yöntem gösterir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İzole oküler kan damarları gelişmiş teknolojik yaklaşımlar kullanarak göz patofizyolojik durumunu çözmek için tüp bebek kullanımını büyük ölçüde bazı hastalıklar anlayışımızı genişletti. Kütle spektrometresi (MS)-tabanlı proteomik moleküler mekanizmaları ve sağlık ve hastalık damar yataklarında yollar sinyal protein çözmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, örnek hazırlık adımları önce MS analizleri tekrarlanabilir sonuçlar ve karmaşık Proteom derinlemesine aydınlatma elde etmek büyük önem taşımaktadır. Bu nerede örnek analizler için kullanılabilir miktarı genellikle sınırlıdır ve böylece, en iyi protein çıkarılması için bir meydan okuma teşkil oküler yüzdeki hazırlanması için özellikle önemlidir. Verimli, hızlı ve güçlü bir iletişim kuralı için numune hazırlama domuz kısa arka silier arterler istihdam bir örnek retrobulbar oküler vasküler yatağın üzerinden sağlamak bu makalede çabaları. Mevcut yöntem odak üstünde protein çıkarma yordamları hem süpernatant ve Pelet Homojenizasyon, aşağıdaki örnek örnek santrifüj filtre cihazları tek boyutlu Jel Elektroforez ve peptid arıtma öncesi temizlik etiket içermeyen miktar sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma doğrusal iyon kapanı-Orbitrap MS sistemindeki adımları. Her ne kadar bu yöntem özellikle proteomik analizlerini oküler yüzdeki için geliştirilmiştir, biz de o da kolayca diğer doku tabanlı örnekleri için istihdam edilebilir ki inandırıcı kanıt sağladı.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hangi izni entegre ve eşsiz veri koleksiyon güç, proteomik, ilerlemesi alanında büyük ölçüde bizim anlayışı yansıtan olduğu gibi de bazı hastalık şartları altında yatan moleküler mekanizmaları devrim yarattı fizyolojik devlet bir belirli hücre nüfus veya doku1,2,3,4. Proteomik da duyarlılık ve tarafsız analiz için nihai tanı ve prognoz, potansiyel hastalık işaretleri tanımlaması olarak kolaylaştırdı farklı oküler örnekleri sayesinde oftalmik araştırma önemli bir platform olduğunu kanıtlamıştır zarif tarafından birçok çalışma bazı bizim dahil olmak üzere son yıllarda1,5,6,7,8,9,10göstermiştir. Ancak, proteomik analizleri etik nedenlerle, özellikle güvenilir karşılaştırmalı analizler için sağlıklı bireyler üzerinden kontrol malzemesi ihtiyacını göz önünde bulundurarak insan örneklerini almak genellikle zordur. Öte yandan, örnekleri en uygun ve güvenilir kitle spektrometrik analiz için yeterli miktarda elde etmek zordur. Bu mikro-kan damarları göz gibi kitle-sınırlı biyolojik malzemeler için özellikle önemlidir. Bir tür büyük retrobulbar oküler kan akımı yönetmelikte önemli roller oynayan damar kısa arka silier arter (sPCA) olduğunu. Herhangi bir pertürbasyon veya vasküler bu yatakta anomaliler glokom ve nonarteritic anterior iskemik optik nöropati (NAION)11 gibi birkaç görüş tehdit eden hastalıkların patogenezinde yol açabilir ciddi klinik yansımaları neden olabilir , 12. ancak, yukarıda belirtilen sakıncaları nedeniyle bu Arteryel yatakta Proteom değişiklikler elucidating çalışmalar eksikliği yoktur. Bu nedenle, son yıllarda ev domuz (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) iyi bir hayvan modeli olarak insanlar ve domuzlar13arasındaki yüksek morfolojik ve filogenetik benzerlikleri nedeniyle oftalmik araştırmalarda ortaya çıkmıştır, 14,15. Domuz oküler örnekleri are kolayca elde edilebilir ve en önemlisi, insan dokulara daha doğru bir şekilde temsil vardır.

Gözde bu kan damarlarının önemli rol, hem de göz önüne alındığında bu yüzdeki verimli protein çıkarma ve analizler için yiyecek ve içecek metodoloji eksiklik, biz daha önce bir in-house kullanarak domuz sPCA Proteom nitelendirmiştir proteinler16yüksek sayıda kimlik sonuçlanan iletişim kuralı. Bu çalışmaya dayanarak, biz daha fazla en iyi duruma getirilmiş ve derinlemesine açıklanan metodolojimiz bu makalede, domuz sPCA modeli doku kullanarak örnekleri dakika tutarlardan Proteom analiz sağlar. Bu çalışmanın temel amacı kitle-sınırlı oküler kan damarları için MS-uyumlu metodoloji kurmak oldu gerçi biz açıklanan iş akışı da geniş çeşitli doku tabanlı örnekleri için uygulanabilir olduğunu önemli deneysel kanıtlar sağladı.

Bu iş akışı enstrümantal kapsamlı Proteom analizleri için malzemelerin az miktarda yüksek kaliteli MS uyumlu örnekleri hazırlanması için öngörülen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan örnekleri kullanarak tüm deneysel prosedürler vizyon Araştırmaları Derneği ve Oftalmoloji (ARVO) deyim için Ophthalmic ve vizyon araştırma ve kurumsal yönergeleri tarafından hayvan kullanımı sıkı bağlılık içinde gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma yapıldı ve Oftalmoloji, Üniversitesi Tıp Merkezi Mainz Bakanlığı onaylı.

Not: Optik sinir ve Gözdışı doku domuz gözleri elde edilen taze yerel mezbaha hemen öldükten sonra. Enucleated gözler için buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) laboratuvarda taşınır ve hemen kullanılabilir. Şekil 1' de gösterildiği gibi istihdam iş akışı şematik bakış sunulmuştur.

1. çözümler

  1. Krebs-Henseleit (K-H) hazırlamak için arabellek, bir kuru ve temiz 50 mL konik santrifüj tüpüne aşağıdaki kimyasallar (NaCl 27.68 g, NaHCO38.4 g, KCl 1.4 g, MgSO41,18 g ve KH2PO40,64 g) tartmak ve , 1,47 g CaCl2 ve 8.0 g glikoz başka bir tüp içine.
    Not: Bu kimyasalların toz karışımı bir serin ve kuru yerde muhafaza edilmelidir. CaCl2 ve glikoz toz karışım en iyi nem ve topaklanma emilimini önlemek için taze hazırlanır.
  2. Hazırlamak için ayıklama arabellek 2A Pelet örnek, ayıklama arabellek 2 ve 100 µL Reaktif A transmembran protein ayıklama dan mix 100 µL başına 200 µL kit (B6 Malzemeler tablobakınız).
    Not: Aliquot ayıklama tampon 2, Reaktif A ve proteaz inhibitörü kokteyl içine çalışma bölümleri ve mağaza-20 ° c için oluşan transmembran protein ekstraksiyon kiti bileşenlerinin kullanımı uzun. Tekrarlanan dondurma ve çözme kaçının. Reaktifler oda sıcaklığında (RT) için Pelet ayıklama işlemi başlamadan önce çözülme.
  3. Amonyum bikarbonat (ABC, 100 mM) çözüm hazırlamak için ABC 0,39 g 50 mL deiyonize su içinde çözülür.
  4. 10 mM hazırlamak için 1, 4-dithiothreitol (DTT) çözüm, DTT 30 mg 20 ml 100 mm ABC geçiyoruz.
  5. 55 mM Iodoacetamide (IAA) çözüm hazırlamak için IAA 200 mg 20 ml 100 mm ABC geçiyoruz.
    Not: IAA karanlıkta tutulmalıdır. Işığa duyarlı çözümler tüplerini sarmak için bir alüminyum folyo kullanın.
  6. 10 mM ABC ve % 10 içeren tripsin arabellek hazırlamak (vol / vol) Asetonitril (ACN). Tripsin arabellek 1,5 mL 20 µg tripsin 13 ng/µL tripsin çalışan bir çözüm hazırlamak için içeriği dağıtmak için bir şişe ekleyin.
    Not: Değiştirilen notu tripsin sıralama tarafından sağlanan liyofilize ve -20 ° C kadar kullanım depolanması gerekir.
  7. Peptid ayıklama arabellek hazırlamak için 1:2 (v/v) %5 formik asit ACN ile karıştırın.
    Not: 1.3-1.7 taze kullanmadan önce tüm adımları çözümlerinde hazırlamak ve kullanılmayan herhangi bir cilt atmak.
  8. % 0.1 trifluoroacetic asit (TFA) hazırlamak için TFA 10 µL 10 mL deiyonize su ile karıştırın.

2. izolasyon kısa arka silier arter

Not: Domuz göz temelde anterior (Şekil 2A) ve arka bölümlerde (Şekil 2B) ayrılmıştır.

  1. Göz dünya buz gibi K-H arabellek içeren bir diseksiyon odası yerleştirin. Dikkatle çevreleyen kas ve dokulara keskin Mayo makas çifti ile Kes gitsin.
  2. Bir kesik bir neşter ile yapmak ve göz anterior ve posteiror yarıya içine ayrılır kadar dünyanın Ekvator uçak boyunca keskin Mayo makas çifti ile kesti. Bir çift standart desen forseps kullanarak göz posterior yarısı üzerinden mümkün olduğunca çok vitreus vücut olmaktan çıkarın.
    Not: Göz dünya ayrılması iki yarısı içine sPCA yalıtım diseksiyon tabak içinde hareketli göz kalmadan kolaylıkla kolaylaştırır. Ancak, bu adım zorunlu değildir. Damarları da göz dünya açmadan ayrılmış olabilir.
  3. Retina tarafı aşağı ve yukarı bakacak şekilde doğru deneyci optik sinir diseksiyon pimleri dikkatle göz posterior yarısını aşağı pin kullanın.
  4. Yavaşça temel retrobulbar damarlara öğrenci kenasen bahar makas çifti ile ortaya çıkarmak için optik sinir çevreleyen bağ dokusu Kes gitsin.
  5. SPCA sklera nüfuz ve optik sinir kafa (Şekil 2C) çepeçevre saran damarlar (5-8 şube arasında) kısa dalları görülebilir. Paraoptic ve çevresindeki bağ doku tipi 5 hassas cımbız ve kenasen capsulotomy makas (Şekil 2D) bir çift ile birlikte distal sPCA izole etmek.
    Not: K-H arabellek ayırma prosedürü buz gibi kalmasını sağlamak. Ortam sıcaklığına bağlı olarak her 20-30 dk arabellek değiştirmek için önerilir.

3. numune hazırlama

  1. Yavaşça ilave ince uçlu tip 5 hassas cımbız ve bir stereomicroscope altında kenasen capsulotomy makas kullanarak Arteryel kesimleri bağ dokusu kaldırmak ve izole arter buz gibi PBS kirletici kaldırmak ve artıkları kan durulayın.
    Not: Örnekleri hemen sonraki adımlara tabi değil, ek-onları sıvı azot ve-80 ° C'de store kadar daha fazla kullanılmasını kıpırdama.
  2. Havuzu arterler bir biyolojik REPLICATE, elde etmek için iki göz üzerinden 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarmak ve bir analitik denge kullanarak örnekleri tartmak.
  3. Her tüp için 0,5 mm ve 1.0 mm zirkonyum oksit boncuklar, doku protein ayıklama reaktif tarafından takip karışımı ekleyin (T-ücret; B7 Malzemeler tablobkz:).
    Not: T hacmi-başına her tüpün örneklerinde ağırlık 1 mL örnek 50 mg için reaktif oranında bağlıdır. Homojenizasyon 1 bir hacim oranı için tüpler yüklenirken takip etmek başparmak genel kural: 1:2 = örnek: Boncuk: T-(şekil 3A) başına. Çok büyük bir miktarda ayıklama arabellek ve çok az bir miktar boncuk verimsiz homojenizasyon önlemek için kullanmayın.
  4. Örnek tüpler bir blender homogenizer yük (bkz. Tablo reçetesiD6). 2 dk ve hız seviye 6 zamanlayıcıyı ayarlayın ve homojenizasyon başlatın. Çalıştırdıktan sonra tamamen örneklerdir tam homojenizasyon ve örnekleri kadar yineleme döngüsü için onay (şekil 3B) homojenize.
    Not: Toplam 24 örnek tüplerinin bir vadede homojenize. Örnekleri proteini denatürasyon en aza indirmek için homojenizasyon işlemi sırasında soğuk tutmak önemlidir. Bu çalışmada kullanılan kurşun blender homogenizer örnekleri soğuk tutar bir doğal soğutma özelliği vardır. Hiçbir iç soğutma özelliği homogenizer kullanılabilir olduğu durumlarda, örnekleri her çalışması arasında buz üzerinde tutulabilir.
  5. Dikkatle homogenate taze microcentrifuge tüpler içine pipet. 10.000 x g 4 ° C'de çözünmez proteinler ve çözünür protein içeren ayrı süpernatant cips için 20 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi. Dikkatlice süpernatant temiz microcentrifuge tüpler içine Pelet katman (şekil 3C) dokunmadan pipet.
    Not: Süpernatant ve Pelet-80 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanabilir.

4. Pelet sindirim

  1. 200 µL ayıklama arabellek 2A ve proteaz inhibitörü kokteyl 5 µL Pelet örnekleri ekleyin. Pelet bir pipet ile birkaç kez askıya alma.
    Not: Ayıklama reaktifler de Pelet için eklemeden önce karıştırın. Ayıklama arabellek 2A buz ve proteaz inhibitörü RT ayıklama işlemi devam et.
  2. Ultrasonik bir homogenizer tamamen Pelet homojenize için kullanın.
    1. Genlik 60 ve döngü için 1 olarak ayarlayın. Küçük hacimli (10-500 µL) örneklerinin homojenizasyon için uygundur (Ø 0,5 mm, 80 mm uzun), titanyum yapılmış bir sonda kullanın.
    2. Sondayı Pelet ve ayıklama arabellek karışımı içine sokmak ve ultrasonik dalgalar için örnek ortaya çıkarmak için Başlat düğmesine basın.
    3. Pelet kümeleri tamamen homojenize oluncaya kadar örnek solüsyon içeren temizleyicide. Bir kaç saniye arasında her sonication için duraklatma.
    4. Tam homojenizasyon için görsel olarak kontrol edin. Homogenate hiçbir kümeleri sağlamak için bir pipet ile birkaç kez karıştırın.
      Not: Pelet çıkarma yordamı buz proteini denatürasyon homojenizasyon (şekil 4) sırasında üretilen ısı nedeniyle önlemek için yapılmalıdır.

5. örnek temizlik ve Exchange tampon

  1. Santrifüj filtre cihazları ile 3 kDa kesme kullanın (bkz. Tablo reçetesiD3) değişiklikler ile üretici yönergelerine göre bu yordam için uygun olan yerlerde. İlk olarak, filtre ünitesi (filtre paketinde sağlanan) bir microcentrifuge tüp takın.
  2. Örnek homogenate bir süzgeç aygıt için 200 µL pipet ve 200 µL deiyonize su aynı filtre ekleyin. O güvenli bir şekilde kap (şekil 5A).
  3. Filtre ünitesi bir santrifüj ve 14.000 x g 4 ° C'de 15 dakika tur içine koyun
  4. Santrifüj aygıtı kaldırın ve örnek konsantre filtrate içeren microcentrifuge tüp içeren filtre ünitesi ayrı. Filtrate (şekil 5B) atmak.
  5. Konsantre 400 µL deiyonize su filtresi birim içine ekleyerek yeniden oluşturma. 5,3 ve 5.4 üç kez arasındaki adımları yineleyin. Dikkatli bir şekilde temiz bir microtube içine 'temiz' örnek konsantre pipette.
    Not: Genellikle, bir 200 µL ham örnek ~ 50-70 verecektir µL konsantresi filtrasyon sonra.
  6. 5.1-5.5 kalan örnek homogenates için yineleyin.

6. protein ölçümü

  1. Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil kullanın sPCA örnekleri süpernatant ve Pelet kesirler protein konsantrasyonları bir plaka okuyucu üzerinde belirlemek için (bkz. Tablo reçetesiB5) kit.
  2. Albümin standart (BSA) dilutions (son BSA konsantrasyonları aralığı 25-2.000 µg/mL arasında) 2 mg/mL BSA, oluşan bir 1 mL ampul üreticinin yönergelerine göre hazırlayın.
  3. Her BSA standart seyreltme 10 µL pipet ve örnek bir 96-şey düz-alt Mikroplaka her kuyuya (süpernatant ve Pelet) çoğaltır.
  4. Reaktif BCA reaktif b, 1 kısım BCA Reaktif A 50 parça ekleyerek çalışma BCA hazırlamak
    Not: Her ölçüm öncesinde hazırlanması için gerekli çalışma reaktif hacmi hesaplamak ve taze yeterli hacim örnekleri ve denetlesinler için standart dilutions sayısına göre hazırlayın.
  5. Dikkatle her kuyuya reaktif çalışma BCA 200 µL pipet. Mikroplaka kapağı ve 30 dakika için 37 ° C'de kuluçkaya. RT plakasına soğutma sonra 562 Absorbans ölçmek bir plaka okuyucu üzerinde nm (D13 Malzemeler tablobakınız).
  6. Her BSA standart toplama (µg/mL) için oluşturulan standart eğri dayalı, örnekleri protein konsantrasyonları olmadığını.

7. tek boyutlu Jel Elektroforez (1DE)

  1. Örnekleri (için bir örnek) Tablo 1 ' de gösterildiği gibi 1DE için hazır olun. Örnek karışımı iyi bir pipet ile karıştırın. Örnekleri 15 dk ve RT. soğumaya için 70 ° C'de ısı
  2. 1 x çalışan arabellek 950 mL deiyonize su 50 mL MES SDS çalıştıran arabelleği ekleyerek hazırlayın. İyice karıştırın.
  3. Prekast 4-%12 Bis-Tris protein jelleri (B4 malzemeleri tablo bakınız) hazırlayın.
    1. Jel kaset kaldırmak ve kaset deiyonize su ile durulama için plastik torba kesmiş.
    2. Jel kaset dışarı tarak kuyuları zarar vermemeye dikkat çekici bir sıvı hareket halinde kaldırın.
    3. Yavaşça yükleme wells bir pipet kullanarak çalışan arabellek x 1 ile 2 - 3 kez yıkayın. Ters çevir ve hafifçe orada hiçbir hava kabarcıkları Wells sağlamak arabellek kaldırmak için jel kaset sallamak.
    4. Jel kaset altındaki beyaz bandı çıkarın.
  4. Tank çalıştıran jel içine ve sonra tamamen monte jelleri (en fazla iki kaset) eklemek, jel gerginlik kama kilitleyin.
  5. Dolgu üst (katot) arabellek Oda 200 mL ile çalışan arabellek kuyuları tamamen kaplıdır kadar. Herhangi bir sızıntı için kontrol edin.
  6. Antioksidan 500 µL ekleyin (bkz. Tablo reçetesiA14) çalışan Buffer.
    Not: İndirgeyici ile azaltılmış örnekleri ile kullanılması gerekir bir görgü reaktif antioksidandır ( Tablo 1ve azalan bakiyeli koşulları Elektroforez sırasında korumak için re-triptofan gibi hassas amino asitleri oksidasyonunu önlemek için bakınız) ve metiyonin.
  7. Dikkatle örnek bir pipet kullanarak lane başına 50 µg yükleyin. O zaman, önceden lekeli protein standart moleküler bir yığın işaretçisi olarak yük (A18 Malzemeler tablobakınız).
  8. Daha düşük (anot) arabellek odası çalıştıran arabellek 600 mL ile doldurulması.
  9. Jelleri ~ 60 dk 175 V sabit bir gerilim çalıştırın. Çalışmanın sonunda, jel bir jel bıçak kullanarak kaset plaka dikkatli bir şekilde çıkarın.
  10. Dikkatle jelleri kutusu boyama bir jel aktarın.
    1. Taze, üreticinin yönergelerine göre Tablo 2' de açıklandığı gibi lekeli gerek jelleri toplam sayısını temel alan sabitleme çözüm hazırlamak.
    2. Gel(s) sallanan bir platformda RT, 10 min için sabitleme çözümde sallamak.
  11. Sabitleme çözüm atın ve jelleri ile kolloidal boyama seti mavi leke.
    1. Lekeli gereken jelleri toplam sayısına göre boyama çözümleri taze hazırlamak Tablo 3' te açıklandığı gibi üreticinin talimatlarına göre.
    2. İlk olarak, uygun birimin tedbir ve doğrudan kutusu boyama jel yıldızla (*) İşaretli bileşenler karıştırın. Gel(s) 10 dk RT az sallanan bir platform üzerinde boyama üçün Stainer B olmadan salla.
    3. Stainer B doğrudan boyama kutu içeren içine ekleyin * çözüm boyama. Stainer B kullanmak için de önceden sallamak emin olun.
      Uyarı: 7.10.1 ve duman başlık altında 7.11.1 hazırlık adımları uygulayın.
  12. Gel(s) gecede en iyi genel sonuçları için boyama çözümde sallamak.
    Not: Lekeli bantları sonra en az 3 h d. Stainer boyama eklenmesi gerektirir ve yoğunluğu boyama çözümünde daha uzun saatler için bırakılırsa değişir değil 10 dk içinde görünür olacak.
  13. Dikkatle boyama çözüm dikkatle boşaltmak ve 200 mL deiyonize su ile değiştirin. Gel(s) en az 7-8 h arka temizlemek için su için salla.
    Not: Deiyonize su daha iyi aşırı leke çıkarmak için destaining yordamı sırasında birkaç kez değiştirilmesi gerekir. Gel(s) da suya 3 gün için protein grubu yoğunluğu ödün vermeden bırakılabilir. Gel(s) sıradaki adımlara hemen tabi tutulur değil uzun süreli depolama için 4 ° C'de % 20 amonyum sülfat çözümde saklanabilir.

8. içinde-jel Tryptic sindirim

Not: Bu iletişim kuralı Shevchenko ve ark. tarafından17, hafif değişiklikler ile yönteme göre yapılır. Bu yordamı bir laminar akışı gerçekleştirilmesi gerektiğini hood ve Pipetler, ipuçları, tüpler ve Züccaciye Mağazaları adanmış kümesi özellikle bu amaç için kullanın. Eldiven ve uygun laboratuvar giyim keratin ve diğer kontaminasyonu önlemek için her zaman giymek. Tüm çözümler ve bu yordamı kullanmadan önce kısa bir süre içinde kullanılan reaktifler hazırlayın.

  1. Jel protein grup temiz, yeni microtome Bıçaklar ile tüketim. Grup (yaklaşık 1 mm x 1 mm 2 mm x 2 mm) küçük parçalara kesilmiş. Dikkatle jel adet 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın.
    Not: Çok küçük adet pipet ipuçları yapışmasına neden ve daha büyük parçalar peptid kurtarma azaltacaktır. Son derece keskin microtome bıçaklar, kullanırken dikkatli olun.
  2. Destaining
    1. Destaining çözüm 100 mM ABC çözüm/ACN (1:1, v/v) içeren 500 μL ekleyin ve RT, örnekleri ile ara sıra sallayarak ya da vortexing 30 dk için kuluçkaya.
    2. Dikkatlice destaining çözüm pipet. Görsel olarak herhangi bir kalıntı leke tüplerini kontrol edin. Jel parçaları hala mavi lekeli Eğer 8.2.1 adımları yineleyin.
  3. Azaltma ve alkillenme
    1. ~ 400 µL taze hazırlanmış DTT çözüm ekleyin ve 30 dk. yapmak için çözüm tamamen jel adet kapsadığından emin 56 ° C'de kuluçkaya. Dikkatle azalan bakiyeli çözüm pipet ve.
    2. ~ 400 µL taze hazırlanmış IAA çözüm ekleyin ve 30 dk. alkylating bir pipet ile tampon ve atmak Kaldır, RT karanlıkta kuluçkaya.
  4. Sindirim
    1. Jel adet küçültmek ve opak haline kadar temiz ACN 500 µL RT 10-15 dk için ekleyin. ACN pipet ve jel adet başlık altında 5-10 dakika kuruması.
    2. Tripsin çözüm 50 µL tamamen jel parçaları kapsayacak şekilde her tüpün pipet. 4 ° C'de 30 dk için tüplerde kuluçkaya.
    3. 30 dakika sonra tüm tripsin çözüm jel parçaları tarafından emilir her tüp kontrol edin. Tripsin arabelleği (tüp hacmine bağlı olarak 50-100 µL) yeterli hacim tamamen jel parçaları karşılamak için gerekirse ekleyin. Gecede 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya
  5. Peptid çıkarma
    1. Dikkatle tüpleri ve mikrotüpler temizlemek için transfer ayıklanan peptid çözümden pipette. Santrifüj vakum Evaporatör süpernatant kuru.
      Not: Kalan jel adet atmayın.
    2. Ayıklama arabelleği 100 µL ekleyin (1.7 adıma bakın) her tüp ve 37 ° C'de sallayarak ile 30 dk için kuluçkaya.
    3. İlgili grup göre çıkarılan peptidler içeren aynı mikrotüpler içine süpernatant pipette ve aşağı bir vakum santrifüje kuru.
      Not: Hemen kullanılmaz, kurutulmuş peptid özleriyle-20 ° c kadar birkaç ay öncesine kadar kullanmaya devam etmenize saklanabilir.

9. peptid arıtma

Not: Bu peptid örnek desalting ve saflaştırma prosedürü C18 pipet ipuçları kullanımı ile yapılır (bkz. Tablo reçetesiC15). Yeni bir ipucu her örnek için kullanın.

  1. Tablo 4' te gösterildiği gibi aşağıdaki çözümleri taze konik santrifüj tüpleri ve aliquot 2 mL microcentrifuge tüpler içine peptid arıtma yordamı için hazır olun. Tüpler peptid arıtma için aşağıdaki gibi bir özetidir: (örnek çözümü), tüp tüp B (ıslatma çözüm), tüp C (denge çözüm), tüp %d (çamaşır çözüm), tüp F (bağlı olarak bir boş 2 mL veya 5 mL microcentrifuge tüp, tüp E (elüsyon çözüm) temizlenmesi için atık bertaraf örnekleri sayısı) ve tüp G (temiz, boş microtube, kapasite 0.2 mL).
  2. Adım 8.6.3 10 µL % 0.1 ile kurutulmuş peptid özler sulandırmak TFA. Bu tüp tüp A. atanır
  3. Solüsyon içeren bir ultrasonik banyo 5 min için buz ile A tüplerde temizleyicide.
  4. Spin aşağı 1.000 x g de benchtop santrifüj 1 dk. için örnek çözümde.
  5. P10 micropipette 10 µL maksimum ses ayarını ayarlayın ve güvenli bir şekilde C18 pipet ucu ekleyebilirsiniz.
  6. Pipet ucu ıslatma çözüm (tüp B) sokmak ve dikkatli bir şekilde ambalaj malzemesi Aspire edin. Yavaş yavaş tüp F. tekrar içine atık bu adım en az 7 - 8 kez dağıtmak.
    Not: Pipet pompası ölü durmak için bunalıma girmek ve yavaşça serbest veya dalgıç prosedürü boyunca dağıtmak. Hava kabarcıkları ipuçları-C18 sütun en fazla peptid bağlama emin olmak için pipetting sırasında tanıtmak değil önlem almak.
  7. Peptid bağlama için belgili tanımlık uç equilibrate tarafından alıyorum 10 µL denge çözüm tüp C. çözüm atıp 3-4 kez bu yordamı yineleyin.
  8. Ardından, Aspire edin ve sütun ipucu peptidler bağlamak için birkaç kez (kalınlığına bağlı olarak ilgili jel grubu) tüp A örnek çözümü dağıtmak.
    Uyarı: Aspirasyon ve bağlama işlemi (adım 9,8) sırasında dağıtım adımları A. tüp içinde yürütülen Kaybedecek örnek çözümü dağıtmak değil.
  9. C18 pipet ucu tüp D çamaşır çözümde aspirating ve 4-5 kez (tüp F) harcayacak atılmadan yıkayın.
  10. Son olarak, elüsyon çözüm (tüp E) pipetting ve eluant G. tüpüne dağıtımı ilişkili peptidler elute
  11. 2-3 devir-de örnek örnek kurtarma artırmak için tüm adımları yineleyin.
  12. Belgili tanımlık uç bir örnek arıtma sonra atın ve sonraki örnek için yeni bir ipucu kullanın.
  13. Vakum yoğunlaştırıcı arıtılmış peptid eluates kuru.
    Not: Arıtılmış örnekleri LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS sisteminde LC-MS/MS analizleri için hazırsınız. Kurutulmuş örnekleri kadar daha fazla kullanılmasını-20 ° C'de depolayın.

10. sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma-MS/MS analizleri

Not: Etiket içermeyen nicel proteomik çözümleme bir sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma doğrusal iyon kapanı-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS sistemde yapılır. LC Rheos Allegro Kuvaterner pompa (HTS PAL Otomatik Örnekleyici için birleştiğinde ve sistem bir 150 mm x 0,5 mm C18 sütuna bağlı bir 30 x 0.5 mm C18 ön sütun oluşur. online bir degasser ile donatılmış oluşur Kullanım ters faz sulu çözelti A LC-MS sınıf suyla %0,1 (v/v) formik asit ve organik çözücü B LC-MS sınıf Asetonitril %0,1 (v/v) formik asit ile oluşan oluşan. Degrade jel grup, başına 60 dk çalışan bir zamanı ile ayrıntılı olarak bizim önceki çalışmalar6,16açıklandığı gibi kullanın.

  1. 10 µL % 0.1 arıtılmış peptid örneklerinde dağıtılması TFA. Örnekleri on Ice 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.
  2. 10 µL örnekleri bir V-alt 96-şey plaka pipet ve tutkal ile açık, kendinden yapışkanlı-kapak film.
  3. Plaka için Otomatik Örnekleyici aktarın.
  4. Aşağıdaki degrade 60 min: 0 çalışan her zaman için kullanın-35 dk (% 15-40 çözücü B), 35-40 dk (% 40-60 çözücü B), 40-45 dk (% 60-90 çözücü B), 45-50 dk (% 90 çözücü B), 50-53 min (90-%10 çözücü B) ve 53-60 dk (% 10 çözücü B).
  5. Araç aşağıdaki kitle spektrometrik koşullarını kullanın: pozitif iyon electrospray iyonlaşma modu, sprey gerilim (2.15 kV), kapiller sıcaklığı (220 ° C), veri bağımlı edinme modu, otomatik Alım Orbitrap-MS arasında geçiş yapma ve LTQ MS/MS, orbitrap çözünürlük (30.000), m/z aralığı (300-1,600) hedef otomatik kazanç kontrolü (AGC, 1.0 x 106 iyonları), iç ayarlamayı (polydimethlycyclosiloxane [PCM] m/z 445.120025 iyonları gerçek zamanlı olarak,), kitle seçeneği MS modunda etkin kilit, tandem veri ilk beş en yoğun habercisi iyonları, daha fazla çarpışma kaynaklı ayrılma (CID), tarafından parçalanma normalleştirilmiş çarpışma enerji (NCE, etkinleştirme süresi 30 ms yineleme sayısını 3 ile ile % 35) ve dinamik hariç tutma süresi seçerek elde (600 s).
    Not: Sonuçta ortaya çıkan parçalanmış iyonları LTQ içinde kaydedilir.
  6. Her örnek için en az üç biyolojik çoğaltır çalıştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sınırlı örnek durumu, oftalmik araştırmada büyük dezavantaj biridir. Buna bağlı olarak, oküler kan damarlarının çoğu kez tartışılabilir gibi en iyi protein ayıklama yöntemleri örnekleri küçük miktarlarda verim. Bugüne kadar özellikle retrobulbar kan damarları protein çıkarılması için yiyecek ve içecek yöntemlerden bir yetersizlik vardır. Bu nedenle, bir ilk adım olarak yöntemi en iyi duruma getirme ve bir kanıtı-of-etkinlik ve sağlamlık birkaç yaygın olarak karşılaştırmak için ilke olarak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsamlı Proteom oküler örnekleri çeşitli bir yelpazede profil oluşturma moleküler mekanizmaları ve sağlık ve hastalık karıştığı sinyal yolları aydınlatmak için bir önemli ve vazgeçilmez ilk adımı oluşturur. Yüksek kalite verilerini elde etmek için ve bu analizler elde edilen sonuçlar tekrarlanabilirlik emin olmak için yukarıdaki örnek hazırlık adımları çok önemli, vurgulanmış olarak bir inceleme tarafından mandalina ve ark. derinlemesine ele örnek işleme yordamları göz farklı bölümleri için iki boyutlu Jel Elektroforez ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Manicam iç Üniversitesi Araştırma Fonu (Stufe 1) Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1) hibe ve Johannes Gutenberg Üniversitesi Mainz Üniversitesi Tıp merkezinden tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A. Kimyasallar< / güçlü>
1, 4-Ditiyotreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2< / sub>)   Carl Roth 5239.12.5 mM 
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) Thermo Fisher Scientific14190169
Formik asit (CH2< / sub>O2< / sub>)AppliChemA0748
HPLC sınıfı asetonitril (ACN, C < sub > 2 < / sub >H < sub>3 < / sub>N)AppliChemA1605
HPLC sınıfı metanol (CH < sub > 3 < / sub>OH)Fisher ScientificM/4056/17
HPLC sınıfı su AppliChemA1589
İyodoasetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125
Kalyum klorür (KCl)    Carl Roth 6781.14.7 mM 
Kalyum dihidrojen fosfat (KH2PO4)  Carl Roth 3904.21.2 mM 
LC-MS dereceli asetik asit  Carl Roth AE69.1
Magnezyum sülfat (MgSO4)     Carl Roth 261.21.2 mM 
NuPAGE AntioksidanThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Örnek tamponu Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Çalışan Tampon Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Numune azaltıcı ajan Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 önceden boyanmış protein standardı Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Sıralama sınıfı modifiye tripsinPromegaV5111
Sodyum klorür (NaCl)  Carl Roth 9265.2118.3 mM 
Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3)  Carl Roth 965.325 mM 
Trifloroasetik asit (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
&alfa;-(D)-(+)- Glikoz monohidrat  Carl Roth 6780.111 mM 
< güçlü > B. Reaktifler ve Kitler< / güçlü >
0,5 mm zirkonyum oksit boncuklar ve nbsp;Sonraki İlerlemeZROB05
1.0 mm zirkonyum oksit boncuklar Sonraki İlerlemeZROB10
Kolloidal Mavi Boyama  KitThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025Kit başına 25 mini jeli lekelemek için
NuPAGE %4-12 Bis-Tri jellerThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1.0 mm, 10 oyuklu
Pierce Biskinconinic Acid (BCA) Protein Test Kiti Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract Transmembran Protein Ekstraksiyon Kiti, TM-PEKMerck Millipore71772-3Kit başına 20 reaksiyon
Doku Protein Ekstraksiyon Reaktifi (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Araçlar
96 kuyulu V-alt plakalarGreiner Bio-One651180
Corning 96 kuyulu düz tabanlı plakalarSigma-AldrichCLS3595-50EA
Tek kullanımlık mikrotom bıçaklarıpfm Medical207500014
Tek kullanımlık neşterler #21pfm Medical200130021
Diseksiyon pimleri Carl RothPK47.1
Ekstra İnce Bonn Makas  Güzel Bilim Araçları14084-08
Falcon konik santrifüj tüpleri (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Mayonez makas, Sert kesim  Güzel Bilim Araçları14130-17
Hassas cımbız  Güzel Bilim Araçları11251-10Tip 5
Hassas cımbız, ekstra ince uçlu düzCarl RothLH53.1Tip 5
Mikroplakalar için kendinden yapışkanlı sızdırmazlık filmleriRatiolab (vWR)RATI6018412
Standart desen forseps  Güzel Bilim Aletleri11000-12
Öğrenci Vannas yaylı makas  Güzel Bilim Araçları91501-09
Vannas kapsülotomi makası   Geuder19760  Düz, 77 mm
Fermuar UcuC18 pipet uçlarıMerck MilliporeZTC18S096
D. Ekipman ve cihazlar
150 & kez; 0,5 mm BioBasic C18 sütunuThermo Scientific, Rockford, ABD72105-150565
30 > 0,5 mm BioBasic C18 ön kolon Thermo Scientific, Rockford, ABD72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Santrifüj Filtre Cihazları Merck MilliporeUFC50039696'lık paket.
Analitik teraziSartoriusH51
Otomatik numune alma cihazı CTC Analytics AG, Zwingen, İsviçreHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Fırtınası Sonraki AdvanceNA-BB-25
Eppendorf yoğunlaştırıcı, model 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf mikrosantrifüj, model 5424Fisher Scientific05-403-93Soğutmasız
Heraeus Primo R SantrifüjThermo Scientific75005440Soğutmalı
Labsonik M Ultrasonik homojenizatör SartoriusBBI-8535027
LC-MS pompası, model Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, ABD22080
LTQ Orbitrap XL kütle spektrometresi Thermo Scientific, Bremen, Almanya
Multiskan Ascent plaka okuyucu Thermo Labsystemsv2.6
Girdaplı Döndürücü neoLab7-0045
Titanyum prob (Ø 0,5 mm, 80 mm uzunluğunda)SartoriusBBI-8535612
Ultrasonik banyo, tip RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini HücreYaşam TeknolojileriEL0001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ocular MicrovesselsProtein ExtractionMass Spectrometry ProteomicsSample PreparationCentrifugal Filter DevicesOne Dimensional Gel ElectrophoresisPeptide PurificationLiquid Chromatography MSTissue Protein ExtractionPorcine Short Posterior Ciliary Arteries

Related Articles