Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59192

⸱

11 Şubat 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan > 1000 TFs tek denemede.

Özet

Her insan gen düzenleyen transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tanımlayan çok sayıda deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar entegre gerektiren bir iştir. Böyle bir yöntem hangi Hofstede TFs ve DNA bölgeleri reporter genler kullanarak Maya çekirdeği ortamda sınanır Maya bir hibrid (Y1H) tahlil olduğunu. Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (e.g., organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek için ekranlı av,'. Y1H ekranlar yerine getirmek için kullanılan en yayımlanmış protokolleri TF-av kitaplıkları veya dizileri DNA-yem maya suşları dönüşüm üzerinde temel alır. Burada, biz bir ardışık düzen tanımlamak, gelişmiş Y1H denilen (eY1H) deneyleri, nerede TF-DNA etkileşimleri DNA-yem suşları dizilmiş bir koleksiyonundan bir yüksek yoğunluklu kullanarak TF-av suşlarının çiftleşme tarafından sorguya bir 1,536 tarama sağlar (HDA) robot platformu Koloni biçimi. Bu işlem hacmi dramatik bir artış sağlar (karşı 60 DNA-yem dizileri > 1000 TFs araştırmacı başına iki hafta alır) ve tekrarlanabilirlik. Biz insan organizatörü dizileri 1,086 insan TFs yanı sıra ekranlar ve onları giderme sırasında ortaya çıkabilecek sorunları örnekleri bir dizi karşı test ederek beklenen sonuçları farklı türleri gösterilmektedir.

Giriş

Biyomedikal alanında merkezi bir sorun hangi tarafından her insan gen düzenlenmiştir mekanizmaları belirliyor. Transkripsiyon gen ifade düzeyleri kontrol ilk adım, ve bu her gen özgüdür transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tarafından düzenlenir. Verilen bu insan için kodlamak > her gen ifadesi kontrol TFs eksiksiz kümesi tanımlayan 1.500 TFs1,2, kalır açık bir meydan okuma.

İki tür yöntemi TF-DNA etkileşimleri eşlemek için kullanılan: TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri3 (resim 1A). TF merkezli yöntemlerinde, bağlama genomik DNA bölgeleri veya onun DNA bağlama özgüllük belirlemek için bir TF ilgi probed. Bu yöntemler yüksek üretilen iş sıralama, protein bağlayıcı microarrays ve SELEX4,5,6takip kromatin immunoprecipitation (ChIP) içerir. DNA merkezli yöntemlerinde, DNA dizisi bağlamak TFs kümesini belirlemek için bir DNA dizisi ilgi probed. Bu yöntemlerden en yaygın olarak uygulanan Maya bir hibrid (Y1H) deneyleri, TFs ve DNA arasında hangi etkileşimleri bölgeleri reporter genler7,8,9kullanarak Maya çekirdeği ortamda test edilir var.

Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (örneğin, organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek9,10 için (Şekil 1B) ekranlı av,'. DNA-yem akıntıya karşı klonlanmış iki muhabir gen (LacZ ve HIS3) ve her iki DNA-bait::reporter yapıları chromatinized 'DNA-yem suşları.' oluşturmak için Maya genom entegre edilmiştir TF-av, harekete geçirmek etki alanına Gal4 TF, Maya (AD) erimiş bir TF ifade eder bir plazmid kodlanmış TF-DNA etkileşimleri için balık için DNA-yem gerilim girmiştir. TF-av DNA-yem sırasına bağlanır, TF-av içinde mevcut reklam her iki gazeteci genleri harekete geçirmek yol açacaktır. Sonuç olarak, olumlu etkileşim içeren hücreler büyüme histidin eksik yanı sıra bir rekabetçi inhibitörü, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), üstesinden plakaları için seçilen ve X-gal huzurunda mavi koloniler olarak görüntülenir. Çünkü güçlü Maya Gal4 AD kullanıldığında, Y1H deneyleri ilgili transkripsiyon aktivatörleri yanı sıra repressors etkileşimleri algılayabilir. Ayrıca, verilen bu TF-dualarının güçlü Maya organizatörü (ADH1) ifade edilir, etkileşimleri için bile çip11,12' algılamak için zorlu düşük endojen ifade seviyesine sahip TFs algılanabilir.

Y1H deneyleri gerçekleştirmek için en yayımlanmış protokolleri seçimi, koloni tespit ve etkileşen TF tanımlamak için sıralama veya havuza alınmış TF-av kitaplıkları dönüştürerek Maya DNA-yem suşları TF-dualarının tanıtımı üzerinde temel alan bireysel dönüşüm8,9klonlar. Bunlar araştırmacı test edilebilir DNA dizileri sayısını sınırlama zaman alıcı kurallarıdır. Y1H deneyleri, adı verilen bir son gelişme Y1H Gelişmiş (eY1H), önemli ölçüde artmıştır tarama işlem hacmi Maya DNA-yem suşları maya suşları topluluğu ile her bir farklı ifade dostum için bir yüksek yoğunluklu dizi (HDA) robot platformu kullanarak TF-av10,13 (Şekil 1 c). Bu ekranlar bir 1.536 koloni biçimine izin en insan TFs sadece üç tabak kullanarak quadruplicate test etmek için istihdam. TF-DNA etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir göz önüne alındığında, daha fazla, bu yaklaşım etkileşimler DNA-yemler (örneğin iki kodlamayan tek nükleotid çeşitleri) arasında farklı TFs arasında karşılaştırmak için olanak tanır veya TF türevleri11,12 ,14.

EY1H deneyleri kullanarak, biz en büyük insan ve Caenorhabditis elegans DNA merkezli TF-DNA etkileşimleri ağlar-Tarih belirlendi. Özellikle, 246 insan gelişimsel arttırıcılar ve 283 TFs122,230 Hofstede belirledik. Ayrıca, biz eY1H deneyleri 109 tek nükleotid kodlamayan değişik gelişimsel malformasyonu, kanser ve nörolojik bozukluklar gibi genetik hastalıklar ile ilişkili değişmiş TF bağlama ortaya çıkarmak için istihdam. Daha yakın zamanlarda, eY1H 21,714 etkileşimleri 2,576 C. elegans gen rehberleri ile 366 TFs11arasında oluşan bir ağ betimlemek için kullanılır. Bu ağ, C. elegans TFs onlarca işlevsel rolü ortaya çıkarmak için bir vesile oldu.

Protokol DNA-yem lekeleri oluşturmak ve arka plan muhabir etkinliği düzeylerini değerlendirmek için başka bir yerde15,16,17bildirdi. Burada, herhangi bir insan genomik DNA bölge 1,086 insan TFs bir dizi karşı ekran için kullanılan bir eY1H boru hattı açıklayın. Bir kez bir Maya DNA-yem zorlanma oluşturulur ve bir TF-av dizi karşılık gelen tabak fark edilir, tüm protokol iki haftada (Tablo 1) gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, böylece tek bir araştırmacı 60 DNA-yem dizileri aynı anda ekran protokol parallelized. Protokol göstermek için iki sitokin gen CCL15 ve IL17F ve ekranlı. Buna ek olarak, eY1H deneyleri ve onları giderme işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları türlerini göstermek için başarısız ekranlar sonuç göster.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlıkları

  1. SC −U −H levha (150 mm Petri yemekler)
    Not: Bu tabakları DNA-yem maya suşları büyüyen için kullanılacaktır.
    1. Bırakma mix, Maya azot Bankası (YNB), adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 5 M NaOH (yaklaşık medya litre başına 1 mL; kompozisyon için bkz: Tablo 2 ) ile geçiyoruz. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de heyecan tabağa ve serin bir su banyosu içinde 55 ° c.
    5. Lösin ve triptofan ortamına Ekle. De heyecan tabağa mix ve 150 mm Steril Petri yemekler (çanak başına ~ 80 mL) içine dökün. 3-5 gün oda sıcaklığında, Kuru şal plastik torbalarda ve 6 aya kadar oda sıcaklığında saklayın.
  2. YAPD dikdörtgen tabak
    Not: Bu tabakları DNA-yem zorlanma ve TF dizi koleksiyonu ile çiftleşme için çim büyüyen için kullanılacaktır.
    1. (Bkz Tablo 3 . kompozisyon için) tozlar, agar dışında 950 mL su 2 lt şişeye içinde dağıtılması ve heyecan çubuğu ekleme.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün.
    5. Glikoz ekle mix de bir heyecan plaka ve serin ile 55 ° c Medya dikdörtgen kalıplara dökmek ( Tablo malzemelerigörmek; ~ 70 mL plaka başına) peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve depolamak için 6 aya kadar soğuk odasında.
      Not: Önerilen ortam birimi plaka başına 70 mL olsa da, 50-80 mL plaka başına kullanılabilir. Otelde 1 dökme tabaklara dikkate alınacak üç kritik konular) agar medya plaka boyunca aynı kalınlıkta olması onlar seviyelendirilir (plaka dökme için düzeltilmiş tablo veya yüzey kullanma ve yediden fazla tabak yığınlarda dökmek değil) 2) agar kabarcıkları yokluğu sağlamak için medya (balonlar attı bir steril iğne kullanarak) ve 3) tabakları sadece bir gün için kurutma ambalajlama ve tabakları Maya sabitleme içinde hatalarını önlemek için plastik torbalarda.
  3. SC −Trp ve Sc −U −Trp dikdörtgen tabak
    Not: Bu tabakları TF dizi koleksiyon (Sc −Trp) büyüyen ve diploit Maya (Sc −U −Trp) çiftleşmeden sonra erkeğini seçmek için kullanılır.
    1. Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 NaOH 5 M (yaklaşık medya litre başına 1 mL) ile dağıtılması (bkz. kompozisyon için Tablo 4 ). Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye
    5. (Sc −U −Trp plakalar urasil'ı atın) lösin, histidin ve urasil ekleyin.
    6. Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. Oda sıcaklığında 1 günde kuru, tabakları plastik torbalarda kaydırmak ve Soğuk Oda 3 aya kadar saklayın.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal dikdörtgen levha
    Not:     bu plaka okuma plakaları eY1H deneyleri için kullanılacaktır.
    1. Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 850 mL su içinde erimesi (bkz. kompozisyon için Tablo 5 ). Değil pH yapmak. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 850 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. 10 BU tuzları (1 L) x 900 mL su, Na2HPO4∙7H2O 70 g ve 34,5 g NaH2PO4∙H2O. tozlar dağıtılması ve 7.0 kullanarak 5 M NaOH pH ayarlamak için bir heyecan çubuğunu kullanarak Mix birleştirerek hazırlayın. 1 L ve basınçlı kap getirmek için su ekleyin.
    5. X-gal çözüm bir 50 mL plastik tüp dimetil formamide 42,5 mL içeren 3.5 g X-gal tozu ekleyerek hazırlayın. X-gal toz daha kolay çözülmeye dimetil formamide ekleyin (Bu 30 dakika sürer). Hisse senedi çözüm (kullanım opak 50 ml tüp veya kapak folyo) anlatmamanı. -20 ° C'de mağaza
    6. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin ve 10 x (bkz. Tablo 5 kompozisyon için) BU tuzları, mix de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye
    7. (Bkz. Tablo 5 kompozisyon için) lösin, 3AT ve X-gal ekleyin.
    8. Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve alüminyum folyo kaplı soğuk odada depolamak (3AT ve X-gal ışığa duyarlı olan) en fazla 1 ay.

2. bir TF dizi lekelenme

  1. TF-av dizi çözdürme
    1. TF-av dizi buz ile Maya gliserol hisse senedi plakalar çözülme.
      Not: Daha önce yayımlanmış10,12,13,18TF-av diziler oluşturulabilir.
    2. Bir sonraki adım önce 1-3 dakika içinde 12 kanallı pipet kullanarak Maya resuspend.
  2. Maya Sc −Trp dikdörtgen tabaklar lekelenme.
    1. HDA robot (bakınız Tablo malzemeler), select çok iyi 96 plakaları kaynak, hedef ve 96 uzun PIN altlığı olarak 96 ağar kaplamalar olarak.
      Not: PIN pad yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.
    2. 96-şey plaka başına iki kopya yapmak için Çoğaltmak birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanmayın veya dondurulmuş stoklarının arka kirlenmesini önlemek için seçenekleri tekrar.
    3. Yukarı ve aşağı Maya karışımı kaynağında girdap seçeneğini belirleyin.
    4. Benekli dizi çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2 – 3 gün kuluçkaya.
  3. 384 koloni diziler Sc −Trp dikdörtgen levha üretme
    1. Robotun içine 96 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa PIN altlığı seçin.
    2. 1:4 dizi programı seçin. Bu şekilde, dört 96 koloni tabak (her bir farklı TF içeren) bir 384 koloni plaka konsolide edilecek. Geri dönüşüm kullanmayın veya seçenekleri farklı plakalar arasında kirlenmesini önlemek için tekrar.
    3. Tabakları çanta ve benekli 384-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C de 2 gün kuluçkaya.
  4. Sc −Trp dikdörtgen levha 1.536 koloni diziler oluşturma
    Not: Bu dört kolonileri her TF avlarına içeren diziler sonuçlanır.
    1. Robotun içine 384 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 384 kısa PIN altlığı seçin.
    2. 1:4 tahlil tek kaynak programı seçin. Her koloni quadruplicates elde etmek için dört kolonileri kopyalamak için hedeftir. Geri dönüşüm kullanın ve işin içinde dört kez her koloni kopyalama seçenekleri tekrar.
    3. Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.
  5. Sc −Trp dikdörtgen tabaklar 1.536 koloni dizide yükseltecek
    1. Robotun içine 1.536 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 1.536 kısa PIN altlığı seçin.
    2. 3-4 kopya çoğaltmak için Çoğaltma birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanın ve seçeneği tekrar ama çapraz bulaşma kaçınmak için dizi farklı bir tabak için geçiş yaparken panelindeki atmak.
    3. Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı adımları (aşağıya bakın) çiftleşme için kullanmak 3 gün 30 ° C'de kuluçkaya. Bundan sonra tabakları oda sıcaklığında ve kopya tarama yeni bir turu için 7 gün sonra tekrar tutmak.

3. eY1H ekran

  1. DNA-yem zorlanma çimenler çiftleşme için hazırlanıyor
    1. Maya DNA-yem suşları Sc −U −H plaka üzerinde spot ve 30 ° C'de 3 gündür büyümek
    2. Böylece her plaka 12-16 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün kuluçkaya
    3. Böylece her plaka 4 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün için kuluçkaya
    4. Değil herhangi bir agar raspa ve 500 µL steril su ile 1,5 bir tüp içine eklemek emin steril bir kürdan kullanarak Maya kazı.
    5. 10-15 steril cam boncuk YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya süspansiyon plaka üzerine ekleyin ve Maya kalenin yayılır emin olmak 1 dk her yöne iyice çalkalanır.
    6. Kalenin hemen ters çevir ve böylece boncuk kapak için dokunun. Kaldırmak ve boncuk geri dönüşüm.
    7. Tabakları çanta ve agar tarafı aşağı 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya Daha sonra çiftleşme adıma geçin.
  2. Maya DNA-yem ve TF dizi suşları çiftleşme
    1. TF dizi YAPD dikdörtgen plaka robot ile aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Her TF dizi plaka 3-4 YAPD tabak (bağlı olarak dizi levha sayısı) aktarmak için kullanılabilir. Çiftleşme için kullanılan TF dizi tabak 2 – 3 gün eski olması gerekir ama çiftleşme olarak daha verimsiz olabilir.
    2. Bahçede büyük bir DNA-yem yük zaten içeren TF dizi robot YAPD plakaları aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Maya aynı noktadan almaktan kaçının için kaynak ~0.6 mm yarıçaplı rasgele sapmalarla kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak hedefte karıştırın. Kaynak ve hedef olarak 3.2.1. adımda benekli TF dizi içeren YAPD plakaları olarak DNA-yem suşları (Bölüm 3.1) içeren çim kullanın.
    3. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.
  3. Diploit Maya yelpazesi
    1. Şeklindeki Maya YAPD plakaları ile robot Sc −U −Trp tabakaları bana aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin. Kaynak ve hedef karıştırın.
    2. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2-3 gün (uzun kuluçka yüksek arka plan muhabir etkinliği için olur) için kuluçkaya.
  4. Okuma plakaları için transfer
    1. Diploit Maya Sc −U −Trp plakalar aktarım okuma dikdörtgen tabaklar Sc −U −H −Trp + 5 mM 3AT + 0.4 mM X-gal robot kullanarak. 1.536 ağar kaplamalar kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin.
    2. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C de 7 gün için kuluçkaya.
  5. Okuma plakaların görüntüleme
    1. Yüksek arka plan muhabir etkinliği ile DNA-yem suşları için gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, 4 ve 7 gün fotoğraf çekmek. Olumlu etkileşimler mantar kolonileri büyüme ve mavi renk tarafından tanımlanır ve el ile belirlenebilir veya görüntü analiz yazılımı kullanarak belirlenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Üç ana faktör ne zaman analiz eY1H deneyleri sonuçları düşünülmelidir: arka plan muhabir etkinliği DNA-yem baskı, TF-DNA etkileşimleri ve olumlu kolonileri sayısına karşılık gelen muhabir etkinlik gücünü. DNA-yem zorlanma arka plan muhabir etkinliği (örneğin, autoactivity) genel büyüme ve okuma plaka bir TF-av yokluğunda bile Maya kolonilerde rengini gösterir. İdeal olarak, bir arka plan beyaz veya açık kahverengi renk, Sigara autoactive suşları göstermek colonies olumlu etkileşimler için daha büyük ve mavi olmak. Autoac...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Robot eY1H çiftleşme tarama yaklaşımı büyük ölçüde burada açıklanan faiz önceki Kütüphane tarama için karşılaştırıldığında, ya da dönüşüm üzerinde göre dizilmiş tarama yaklaşımlar bir DNA bölgesine bağlamak TFs kümesini tanımlamak için daha fazla işlem hacmi artar. Ayrıca, tüm dört kolonileri için olumlu TF test edilmiş ve etkileşimleri yüzde 90'ını aynı Maya DNA-yem zorlanma10 bağımsız bir ekranda tekrar test etkileşimleri % 90'ı tespit deneyleri son derece tekrarlanabilir şunlardır eY1H tarafınd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [J.I.F.B. için R35-GM128625] tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~% 95 TLCSigmaA8056-100Gürünleri için rekabetçi inhibitör
Uygun maya büyümesi için gereklidir
Agar Yüksek Jel Mukavemeti - Bakteriyolojik sınıfAmerikan Uluslararası KimyasalAGHGUPMaya büyümesi için besleyici ortam
Amonyum SülfatUS BiologicalsA1450Sentetik maya ortamında nitrojen kaynağı
D + SusuzGlikoz US BiologicalsG3050Maya büyümesi için gerekli
Bırakma Karışımı eksi His, Leu, Tryp ve Urasil, maya azot bazlı adenin açısından zenginUS BiologicalsD9540-02Maya büyüme kenarı için gerekli sentetik komple ortam
Çok Parametreli pH MetreHanna InstrumentsHI2020-01Seçici ortamın pH'ını ölçmek için
Düz Kürdan 750 ctElmasBezelyeleri petritlerin üzerine sürmek için
Cam BoncuklarWalter Stern100CÇim yaparken mayayı püskürtmek için
Gliserol & %99Millipore SigmaG9012-1LDondurulmuş maya stokları yapmak için gereklidir
L-HistidinUS BiologicalsH5100Seçici ortamda maya büyüme seçimi için
L-LösinUS BiologicalsL2020-05Seçici ortamda maya büyüme seçimi için
L-TriptofanSigmaT-0254Seçici ortamda maya büyüme seçimi için
N, N-DimetilformamidSigma319937-1LX-gal çözeltisi yapmak için
Omnipense EliteWheatonW375030-ASinger plakalarına doğru hacimlerde ortam dağıtmak için
Peptone, BakteriyolojikAmerikan Uluslararası KimyasalPEBAUPMaya büyümesi için gerekli protein kaynağı
Petri Kabı, 150 mm x15 mmVWR10753-950Maya yemleri yetiştirmek için tarama
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003kullanmak üzere dikdörtgen agar plakaları yapmak
için Maya plakalarını sabit sıcaklıkta inkübe etmek için
RePads 1.536 kısaSinger InstrumentsREP-005TF-av dizisini aktarmak için, mayayı eşleştirin ve mayayı diploid seçim ve okuma plakalarına aktarın
RePads 384 kısaSinger InstrumentsREP-004TF-av dizisini 384'ten 1.536'ya aktarmak için koloni formatı
RePads 96 uzunSinger InstrumentsREP-001TF-prey dizisini gliserol stoğundan agar plakasına aktarmak için
RePads 96 kısaSinger InstrumentsREP-002TF-av dizisini 96'dan 384 koloni formatına aktarmak için
Singer HDA RoToR robotuSinger InstrumentsMayayı yüksek verimli bir şekilde aktarmak için
Sodyum Hidroksit (Peletler/Sertifikalı ACS)FisherS318-1Seçici ortamın pH'ını ayarlamak için
Sodyum Fosfat dibazik heptahidratSanta Cruz Biyoteknolojisc-203402CX-gal 'de LacZ muhabir etkinliği için gereklidir;
Sodyum Fosfat monobazik monohidratSanta Cruz Biyoteknolojisc-202342BX-gal 'de LacZ muhabir etkinliği için gereklidir;
UracilSigmaU0750-100GSeçici ortamda maya büyüme seçimi için
X-gal (5-Bromo-4-kloro-3-indoksil-beta-Dgalaktopiranosid)Altın BiyoteknolojiX4281C100β-galaktosidaz, protein-DNA etkileşimini tespit etmek için renksiz X-gal mavisine döner
Maya ÖzüUS BiologicalsY2010Mayanın
büyümesi ve yayılması için besleyici ortamMaya Azot Baz (toz) AA, karbonhidrat ve AS  olmadan;US BiologicalsY2030Güçlü maya büyümesi için gereklidir
HIS3 geni Adenin sülfat (hemisülfat), dihidrat US Biologicals A0865 Singer Robot Hassas Düşük Sıcaklık BOİ Soğutmalı İnkübatör ThermoFisher Scientific PR205745R ile ,

Kaynaklar

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50(2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Maya Tek-hibrit DeneyiDNA Yem SuşlarıTF Av DizisiYüksek Yoğunluklu DiziRobotik Platform1536 Koloni FormatıTriptofan Eksikliği Olan SC BesiyeriRaporlayıcı Gen AktivasyonuFonksiyonel Genomik
İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.