Yöntem makalesi

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

DOI:

10.3791/59218

⸱

4 Nisan 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant virüs kullanımı temel veya uygulamalı Viroloji çok önemli olmuştur. Ters genetik hem viral çoğaltma mekanizması çözmeye ve antiviral ilaçlar ya da aşılar için geliştirme platformu sağlamak için son derece güçlü bir teknoloji olduğu kanıtlanmış. İnşaat ve bir negatif iplikçikli RNA virüsü gibi solunum sinsisyal virüs (RSV) için ters bir genetik sistemi by pass iddiası ancak, hassas kalır ve özel bilgi birikimi gerektirir. RSV genomu yaklaşık 15 KB hem viral RNA ve transkripsiyonu için bir şablon olarak hizmet veren bir tek iplikçikli, negatif anlamda RNA büyüktür. Ters genetik sistemimiz insan RSV uzun zorlanma genom (HRSV) cDNA kopyasını kullanır. Bu cDNA yanı sıra viral proteinlerin polimeraz karmaşık kodlama cDNAs (L, P, N ve M2-1), bireysel ifade vektörel çizimler T7 polimeraz kontrol dizilerini altında yer alır. Bu unsurların stabil T7 polimeraz hızlı, BSR-T7/5 hücrelerdeki transfection sitoplazmik ve rekombinant RSV transkripsiyonu için genetik olarak değiştirilmiş virions sebebiyet veren sağlar. Hücre yüzeyinde ve kültür süpernatant BSRT7/5, yeni bir RSV viral amplifikasyon için insan HEp-2 hücreleri enfekte için toplanıyor. Amplifikasyon iki veya üç mermi 1 x 106 -1 x 107 plak oluşturan birimler (PFU) içeren viral hisse senetleri almaları gerektiğini / mL. En uygun hasat, donma ve viral stoklarının titrasyon için yöntemler burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Biz burada iki rekombinant virüs ücretsiz yeşil flüoresan protein (GFP) (RSV-GFP) sırasıyla ifade oluşturma tarafından sunulan Protokolü göstermek veya viral M2-1 GFP (RSV-M2-1-GFP) erimiş. RSV GFP RSV çoğaltma ve RSV-M2-1-viral yapılarını gibi viral protein dynamics canlı hücrelerdeki video mikroskobu teknikleri kullanarak görselleştirmek için GFP ölçmek için nasıl kullanılacağını gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan RSV bebekler dünya çapında1' yatış akut solunum yolu enfeksiyonu için önde gelen nedenidir. Buna ek olarak, RSV erişkinlerde grip için karşılaştırılabilir ile hastaneye yatış ve mortalite yükü yaşlı2' deki en önemli hastalık yükü ile ilişkilidir. Var hiçbir aşı ya da belirli antiviral ilaçlar kullanılabilir RSV karşı ama umut verici henüz yeni ilaçlar çoğu geliştirme3,4' te. Karmaşıklığı ve miktar RSV çarpma teknikleri ağırlık antiviral ilaçlar veya geçerli önemli çabalara rağmen aşılar için arama engel. RSV çarpma tüp bebek miktar genellikle çoğunlukla cytopathic etkisi analizinde mikroskobu, immunostaining, plak azaltma tarafından deneyleri, nicel grafiklerden zahmetli, zaman alıcı ve pahalı yöntemler üzerinde dayanır ters transkriptaz (qRT)-Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve enzim bağlı immunosorbent assay testleri. Virüs genleri değiştirilmiş ve bu gibi muhabir gen ifade ile GFP için kodlama, böyle gösterimleri için daha uygundur. Otomatik Plaka okuyucu kullanmak için birleştiğinde, muhabir gen taşıyan rekombinant virüsler bu deneyleri standardizasyon ve yüksek üretilen iş amaçları için daha uygun hale getirebilirsiniz.

RSV bir saran, nonsegmented olumsuz anlamda RNA Pneumoviridae aile, sipariş Mononegavirales5 Orthopneumovirus cins ait virüstür. RSV genomu yaklaşık 15 kodlamayan bölge lideri ve römork ve 11 protein kodlama 10 transkripsiyon birim adı verilen 3' ve 5' ekstremitelerde, içeren KB, tek iplikçikli, negatif anlamda RNA büyüktür. Genlerin aşağıdaki gibi sıralanır: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 ve M2-2 proteinler için kodlama) ve L-5'. Genomik RNA nükleoprotein N. kullanma encapsidated genomik RNA bir şablon olarak tarafından sıkıca paketlenmiş, viral RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) transkripsiyon ve çoğaltma viral RNA'ın sağlayacaktır. Viral RdRp başına nükleotit polimeraz etkinlik taşıyan büyük protein L oluşmaktadır, onun zorunlu kofaktör Fosoprotein P ve viral transkripsiyonu işlevleri M2-1 protein6faktör. Enfekte hücrelerde, RSV dahil organları (IBS) adı verilen sitoplazmik kapanımlar oluşumuna neden olmaktadır. Morfolojik benzer sitoplazmik kapanımlar birkaç Mononegavirales7,8,9,10için gözlemledim. Kuduz virüsü, vesicular Stomatit virüs (VSV), Ebola virüsü ve viral RNA sentezi böylece viral fabrikalar8,9,11, kabul edilebilir IBS içinde oluştuğunu gösterdi RSV son çalışmalar 12. virüs fabrika RNA ve viral proteinler viral RNA sentezi için gerekli konsantre ve hücresel proteinler13,14,15,16, da içeren 17. IBS sergilemek hangi konsantre IB ilişkili granül (IBAGs) denilen bir fonksiyonel subcompartment yeni synthetized yeni doğmakta olan viral mRNA M2-1 protein ile birlikte. Genomik RNA ve L, P ve N IBAGs algılanmaz. IBAGs küçük dinamik küresel sıvı organelleri12özelliklerini sergileyen IBS içinde yapılardır. Merkezi rolü IBS rağmen viral çarpma, doğa, iç yapısı, oluşumu ve viral Bu fabrikaların işleyişi hakkında çok az bilinir.

İfade bir cDNA sayfasından poliovirus genomunun 198118ilk bulaşıcı viral klon üretimini etkin. Tek iplikçikli negatif RNA virüsleri, 1994'e kadar plazmid transfection hücreleri19 takip ilk bir kuduz virüsü üretimi gerçekleşti değildi. Plazmid tabanlı ters genetik için ilk sistemi RSV 199520dakika sonra yayımlandı. Ters genetik Viroloji alanında önemli gelişmeler yol açmıştır. Viral genom içine belirli değişiklikler tanıtma imkanı çoğaltma ve RNA virüsleri patogenezinde önemli anlayışlar sağlamıştır. Bu teknoloji da büyük ölçüde aşıların geliştirilmesi hedeflenen değişiklikler dizi belirli zayıflama izin vererek kolaylaştırdı. Viral çarpma hızlı bir miktar büyük ölçüde izin genom değişiklikler antiviral tarama ve eylem onların modu çalışma geliştirilmiş.

Daha önce açıklanan rağmen genetiği değiştirilmiş RSVs alma hassas kalır. Burada, iki tür rekombinant HRSV, sırasıyla RSV GFP veya RSV-M2-1-GFP ifade oluşturmak için bir protokol ayrıntılı. Bu protokol için yeni rekombinant virüsler gibi yüksek titresi, tekrarlanabilir Hollow'a için uygun ile viral stokları elde etmek için onların amplifikasyon kurtarmak için gerekli transfection koşulları tanımlamak. Ters genetik vektörel çizimler inşaat başına burada açıklanmıyor. En uygun hasat ve viral stokları dondurulması için yöntemleri açıklanmaktadır. Viral enfeksiyon parçacıklar ölçmek için en doğru yöntemi plak tahlil kalır. Hücreleri analiz süspansiyon seri dilutions ile enfekte ve süpernatant ücretsiz viral parçacıkların Difüzyon yasaklayan bir bindirme ile inkübe. Bu şartlar altında virüs sadece ilk her bulaşıcı parçacık için bir "plak" oluşturan bitişik hücreleri enfekte edecek. Geleneksel RSV titrasyon assay olarak, plaklar immunostaining tarafından ortaya ve mikroskobik gözlem altında sayılır. Bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Burada çok basit bir protokol plaklar çıplak gözle görünür oluşumu sağlar Mikrokristalin selüloz bindirme kullanılarak RSV plak tahlil için açıklanan. RSV GFP ölçü RSV çoğaltma ve böylece, için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir antiviral ilaçlar etkisini ölçmek. Ters genetik ve canlı görüntüleme teknolojisi birleştiren, biz nasıl bilim adamları IBS gibi viral hücre içi yapılar dinamikleri takip etmek ve M2-1 canlı hücrelerdeki görselleştirmek için RSV-M2-1-GFP sağlar göstermek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. malzeme hazırlama

  1. Satın cep medya (düşük serum medya, en az temel medya [MEM] 10 x MEM ve Dulbecco kartal orta [DMEM] değiştirilmiş'ın), transfection reaktif ve Mikrokristalin Selüloz (bkz: Malzemeler tablo).
  2. Aşağıdaki vektörel çizimler için ters genetik elde etmek: genomik vector(s) ve N protein ve polimeraz karmaşık proteinleri kodlama ifade vektörel çizimler. Genomik vektörel çizimler bakteriyofaj T7 RNA polimeraz (T7 pol) organizatörü üzerinden tam cDNA genom RSV-GFP (p-RSV-GFP) ve RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) aşağı içerir. İfade vektörel çizimler (p olarak belirlenmiş-N, p -P, p-L ve p-M2-1) kodlama dizisini N, P, L veya M2-1 aşağı T7 pol içeren (Rincheval ve ark.12 ve Rameix-Welti vd.21 plazmid yapıları ile ilgili ayrıntılar için bakınız).
  3. Medya ve transfection ve enfeksiyon için bir hücre kültüründe steril bir ortam hazırlayın. % 10 fetal buzağı serum (FCS), 1000 adet/mL penisilin ve 1 mg/mL streptomisin (veya olmadan antibiyotik) kullanım DMEM 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve MEM ile 2 mM L-glutamin % 0, % 2 veya % 10 FCS, 1000 adet/mL penisilin ve 1 mg/mL ile desteklenmiş streptomisin, aşağıdaki iletişim kuralındaki "tam orta" olarak belirlenmiş.
  4. BSRT7/522 hücreleri elde etmek ve hisse senetleri ile % 10 Dimetil sülfoksit (DMSO) 1-2 x 106 hücre/mL, takıma tam orta yapmak. Sıvı azot hücre hisselerinde tasarrufu. HEp-2 hücreleri elde edilir. Kültür BSRT7/5 hücrelerde tam DMEM ve 37 ° C ve % 5 CO2 steril bir ortamda tam MEM hücrelerde HEp-2.
  5. 10 x RSV koruma çözeltilerine (0,5 M HEPES ve 1 M MgSO4 [pH 7,5] su) steril bir ortam hazırlayın.
  6. Bir ters Floresans mikroskobu GFP Floresans ölçümleri ile uyumlu ve uyumlu bir enfeksiyon izlemek gerekirse canlı görüntüleme ile elde edilir. RSV GFP çoğaltma Nefelometri için GFP Floresans ölçümleri ile uyumlu bir Mikroplaka okuyucu elde edilir.

2. kurtarma ve ilk rekombinant virüs geçirilmesi

Not: Aşağıdaki adımları kullanarak bir sınıf II Emanet dolabı steril bir ortamda gerçekleştirin.

  1. Transfection, önceki gün BSRT7/5 hücre kültürünü süspansiyon 5 x 105 hücre/mL tam orta yapmak. Hücre süspansiyon 6-şey plaka bir kuyu başına 2 mL dağıtın. Kurtarılmayı virüs başına bir şey ve bir ek iyi negatif kontrolü için hazır olun. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya. Hücrelerin % 80-%90 izdiham ertesi gün olduğundan emin olun.
  2. Ters genetik vektörel çizimler (Kimden adım 1.2) p-RSV-GFP ve p çöz-RSV-M2-1-GFP, yanı sıra p-N, p -P, p-L ve p-M2-1. 1 µg p-N ve p -P, p 0,5 µg kurtarmaya her virüs için karışımı-L, p 0,25 µg-M2-1 ve p-RSV (GFP veya M2-1 GFP) bir tüp 1,25 µg.
    Not: Farklı ifade vektörel çizimler N, P, L ve M2-1 için kullanılabilir; Ancak, proteinler arasındaki oran muhafaza edilmesi gerekir. Negatif kontrol ile boş bir vektör p-RSV vektör değiştirerek gerçekleştirin.
  3. Transfection reaktif üreticisinin protokol sonrası transfection için devam (tablo malzemeleri görmek).
    1. İndirimli serum orta 250 µL karışık vektörler ekleyin. Başka bir tüp içinde düşük serum orta 250 µL transfection reaktif 10 µL sulandırmak. Yavaşça girdap hem tüpler ve 5 dk. hem de içeriğini tüpler ve oda sıcaklığında 20 dk bekleyin Mix bekleyin.
    2. İndirimli serum orta 1 mL BSRT7/5 hücrelerle durulama ve MEM ile % 10 FCS olmadan antibiyotik iyi başına 1,5 mL dağıtmak. 2.3.1. adımda anlatılan kuluçka tamamlanıncaya kadar gerekirse, 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçkaya.
    3. 500 µL 20 dk kuluçka süresi bittiğinde bir de 2.3.1. adımda hazırlanan transfection karışımı ekleyin. Hücreleri kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 3 gün boyunca yerleştirin. Hücre kültür orta transfection sırasında değiştirmeyin.
  4. GFP floresan (488 nm, uyarma) ve emisyon 515-535 nm, 20 x büyütme 1 adlı bir ters floresan mikroskop altında gözlemlemek x kurtarma verimliliği izlemek için günlük, GFP kullanarak filtre uygulama.
  5. Transfection sonra ikinci gününde hücreleri kurtarıldı virüs ilk geçiş için tohum. HEp-2 hücre, 5 x 105 hücre/mL tam orta bir süspansiyon hazırlamak. Hücre süspansiyon 6-şey plaka (virüs kurtarma ve bir negatif kontrol için başına bir de) bir kuyu başına 2 mL dağıtın.
  6. Transfection, transfected BSRT7/5 6-şey plaka her şey sıfırdan hücrelerde üçüncü gününde farklı bir kazıyıcı her şey için kullanıyor. Her iyi içeriği (hücreleri ve süpernatant) steril 2 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Girdap her tüp şiddetle için en az 30 s hücre zarlarında kurtarıldı virüsü serbest bırakmak için.
    Not: Bu geçiş 0 (P0) kurtarılan virüsü (şekil 1) karşılık gelir.
  7. Taze viral P0 süspansiyon kurtarıldı virüs ilk amplifikasyon gerçekleştirmek için kullanın.
    1. HEp-2 6-şey plaka kültür ortamından numaralı seribaşı önceki gün Kaldır (bkz. Adım 2,5) ve hızlı bir şekilde (Kimden adım 2.6) P0 süspansiyon iyi başına 500 µL ekleyin. HEp-2 plaka 37 ° C 2 h için yumuşak ajitasyon için bkz: testere rocker üzerinde yerleştirin.
    2. Kaldırmak ve inoculum 500 µL atın ve 2 mL % 2 FCS ile MEM ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 3 gün kuluçkaya. Bu kurtarıldı virüsler (şekil 1) ilk geçiş (P1) üretecektir.
  8. 1/10 / 10 x RSV koruma çözümü (0,5 M HEPES ve 1 M MgSO4 [pH 7,5]) hacmi kalan P0 süspansiyon (Adım 2.6) ekleyin. Girdap mikrotüpler 5 s ve aliquot için şiddetle kriyojenik tüpler içeriğinde alkol dayanıklı etiketleri ile Etiketlenmiş. Tüpler için en az 1 h-80 ° C'de precooled alkol bırakın ve onlara-80 ° C'de depolayın
  9. P0 hisse senedi titre (bkz. Adım 2.6) kurtarılan her virüs (Mikrokristalin selüloz titrasyon için 4 bölümüne bakın).
  10. Enfeksiyon izlemek için günde 1 x 20 x büyütme, bir ters floresan mikroskop altında P0 süspansiyon ile GFP floresan (488 nm, uyarma) ve emisyon 515-535 nm, HEp-2 hücre enfekte gözlemlemek. Aydınlık alan mikroskop altında küçük syncytia görünümünü gözlemlemek ve hücre RSV cytopathogenic etkisi (CPE) yansıtan dekolmanı (bkz. Şekil 2).
  11. Ne Floresans ne de CPE 2-3 gün sonra görünür durumdaysa kurtarma başarısız olduğunu unutmayın.
  12. Günde 3 veya 4 2.6. adımda açıklandığı gibi ilk geçiş (P1) toplamak. Kısacası, hücreleri kazımak, hücreler ve süpernatant birlikte, onları, örnek 2.8, aliquot adımda anlatıldığı gibi koruma çözümü eklemek ve Don o girdap toplamak.
  13. (Bkz: Bölüm 4 titrasyon tahlil için) titre ve ilk geçiş (amplifikasyon için 3 bölümüne bakın) yükseltmek.

3. kurtarıldı virüs amplifikasyon

Not: Aşağıdaki iletişim kuralı bir 75 cm2 şişe kurtarıldı virüs amplifikasyon açıklar. Gerekli birime ebatı ve enfeksiyon (MOI) gerekli çokluğu adapte. Tablo 1 birimleri farklı Şişeler için gösterir. Bir sınıf II Emanet dolabı steril bir ortamda tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. HEp-2 hücre, 5 x 105 hücre/mL tam ortamda bir süspansiyon gün amplifikasyon önce hazırlayın. Hücre süspansiyon 75 cm2 şişe başına 15 mL dağıtmak ve 37 ° C ve % 5 CO2şişeler kuluçkaya. Yükseltmek için virüs başına bir şişe hazırlayın.
  2. Gün kuluçka başladıktan sonra hücrelerin % 80-%100 birleşmesi olduğunu denetleyin.
  3. Adımda 2.12 MEM olmadan FCS 50.000 PFU/mL (0.01 PFU/hücre bir MOI için karşılık gelen), 3 mL süspansiyon elde etmek için üzerinden viral süspansiyon sulandırmak.
  4. Orta kaldırın ve hızlı bir şekilde 3 mL viral süspansiyon ekleyin. 2s için yumuşak ajitasyon için bkz: testere rocker olarak 37 ° C'de şişeye koyun.
  5. Kaldırmak ve inoculum atın ve MEM % 2 FCS ile 15 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2 ' de 2-4 gün için kuluçkaya.
  6. Hücre morfolojisi ve GFP floresan (488 nm, uyarma) ve emisyon 515-535 nm, 20 x büyütme, bir ters floresan mikroskop altında belgili tanımlık virüs hasat için doğru bir zaman tahmin etmek için kontrol edin. Bu genellikle ne zaman HEp-2 hücre tabakasının % 50-%80 48 ve 72 s postinfection arasında (özel dedektif) oluşur RSV CPE nedeniyle ilişkisi kesildi olduğunu unutmayın (bkz. şekil 3).
  7. Bir hücre kazıyıcı kullanarak tüm hücreleri kazı. Hücreleri ve süpernatant araya toplamak ve 50 mL santrifüj tüpü aktarabilirsiniz.
  8. 1/10 / 10 x RSV koruma çözümü (0.5 M HEPES ve 1 M MgSO4 [pH 7,5]) hacmi ekleyin. Girdap tüpler şiddetle için 5 s ve süspansiyon tarafından 5 dk aralıklarla 200 x gde açıklığa kavuşturmak.
  9. Süpernatant 50 mL tüp aktarın. Kısaca girdap ve aliquot kriyojenik tüpler süspansiyon alkol dayanıklı etiketleri ile Etiketlenmiş. Precooled-80 ° C alkol en az 1 h için tüplerde bırakın ve onlara-80 ° C'de depolayın
  10. Viral süspansiyon (bakınız Bölüm 4) titre aliquots birini çöz.

4. plak titrasyon tahlil

  1. 12-şey plakaları titrasyon titrasyon tahlil yapılmadan önce gün için hazırlamak (altı kuyuları ecek gerekli bir tüp şunun titre için). 1 mL, 5 x 105 hücre/mL tam orta HEp-2 hücrelerinin Wells'le tohum.
  2. Ertesi gün, steril Mikrokristalin selüloz süspansiyon (%2,4 [w/v] su) hazırlamak (tablo malzemeleri görmek).
    1. 2.4 g Mikrokristalin selüloz tozu 100 ml distile su, toz (genellikle 4 – 12 h) tam dağılmasına kadar standart bir manyetik karıştırıcı kullanarak dağıtmak. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de süspansiyon ve kullanımdan önce oda sıcaklığında saklayın.
      Not: Bu koşullar altında süspansiyon 1 yıl boyunca stabildir.
    2. Steril bir ortamda çözüm açtıktan sonra 6 ay boyunca 4 ° C'de depolayın. Her zaman önce (el sallayarak veya vortexing) tarafından süspansiyon homojen olduğundan emin olmak için karıştırın.
  3. 2 hazırlamak MEM steril bir ortamda x. Ticari MEM 10 seyreltik steril su ile x ve L-glutamine, 1000 adet/mL penisilin ve 1 mg/mL streptomisin ekleyin. Seyreltme şiddetle çalkalanır ve 4 ° C'de saklayın
    Not: 4.4-4,10 steril bir ortamda bir sınıf II Emanet dolabı kullanma adımları.
  4. Altı tüpler (titrasyon tüpler) MEM FCS olmadan 900 µL başına titre için virüs içeren hazır olun. Virüs aliquots çözülme girdap onları şiddetle için 5 s ve transfer 100 µL ilk titrasyon için tüp.
  5. On kat seyreltme 6 gerçekleştirmek x, aşağıdaki gibi. Şunun için 900 μL orta ilk tüp 100 μL televizyonda kap koymak ve içeriğini vortexing tarafından bir kaç saniye karıştırın ekleyin. Pipet ucunda değiştirmek, orta ikinci tüp içinde 900 µL ilk seyreltme 100 µL eklemek, tüp ve girdap kap koymak. Yordamı altıncı tüp kadar yineleyin.
    Not: Her seyreltme için belgili tanımlık uç değiştirmek çok önemlidir.
  6. Virüs adı ve kat dilutions HEp-2 12-şey Tabaklarda yazmak. Onlar (Adım 4,9) boyama sırasında ayrılmış çünkü plaka ve kapağına eşleştirmek için bir işareti ekleyin. Orta plakalar kaldırmak ve bir seyreltme iyi başına 400 µL dağıtın. Plakalar için virüs adsorpsiyon için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Pipet ucu her inoculum arasında değiştirebilir veya düşükten en yüksek konsantrasyon aynı ucu ile devam edin. Aynı anda kurutma hücreleri önlemek için tabak (1-2) sınırlı bir dizi aşılamak.
  7. Mikrokristalin selüloz bindirme virüs adsorpsiyon (hazırlıksız hazırlık) sırasında hazırlamak. 100 mL düzeninin elde etmek için 10 mL % 2.4 Mikrokristalin selüloz süspansiyon, 2 x MEM 10 mL ve 80 mL MEM % 2 FCS ile karıştırın.
    1. 2 pH ayarlama renkli göstergesi takip MEM için yaklaşık 7,2 steril sodyum bikarbonat solüsyonu %7.5 x. Mikrokristalin selüloz süspansiyon ve MEM ekleyip kuvvetle karıştırın.
  8. 2 h kuluçka sonunda 2-3 mL düzeninin inoculum kaldırmadan 12-şey plakaları her şey için ekleyin. Yüksek viral titresi inoculums bitişik Wells'le kirlenmesini önlemek için dikkatli olun. 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 6 gün kuluçkaya. Plaka hareket etmiyor ve kuluçka kuluçka sırasında hareket etmiyor.
  9. Kristal violet çözüm (% 8 kristal violet [v/v], %2 formaldehit [v/v] ve % 20 etanol [v/v] su) kullanarak hücreleri, leke için devam edin.
    1. (Kristal violet yüzeyleri güçlü renkler) bir levha ile kabine Biyogüvenlik çalışma yüzeyini korumak.
    2. Yavaşça plakalara Mikrokristalin selüloz bindirme almak sallamak. Supernatants kaldırmak ve hücreleri 2 yıkama x 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile. Tek tek hücreleri kurutma önlemek için plakalar ele. 1-2 mL kristal violet çözeltisi ekleyin ve 10-15 dk. Kaldır sonraki plaka boyama için yeniden kullanılabilir çözüm bekleyin.
    3. Tabakalar ve kapaklar temiz çamaşır suyu, bir kaç saniye için bırakın ve sonra iyice musluk suyu ile yıkayın. Tabakalar ve kapakları çamaşır suyu tarafından dekontamine unutmayın.
    4. Plakalar ve kapakları kağıt havlu üzerine koyup koyup kuruyuncaya kadar bırakın. Plakayı bir ortam sıcaklığında su durulama sonra kuru ve oda sıcaklığında saklayın. Uzun depolama dönemleri (ay), tutmak için ışık rengi korumak için korumalı plakaları. Hücreleri onların renklendirme kaybederseniz, onlar tekrar kristal violet ile Boyanabilen olduğunu unutmayın.
  10. Virüs titreleri hesaplayın. Çıplak gözle görülebilir kuru plakaların Wells plaklar saymak. Farklı dilutions plaklar sayısı tutarlı (10 arasında faktörü her seyreltme) olup olmadığını denetleyin. Plaklar en kolay saymak için olduğunuz şey seçin. Plaklar karşı inoculum birim ve seyreltme sayısını değerlendirmek.
    Not: Şekil 4' te sağlanan örnek üzerinde 21 plaklar 10-5 seyreltme dikkate alınır. Bunlar bir titresi karşılık
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2

5. küçük müdahale RNA veya antiviral ilaçlar ile tedavi hücrelerdeki Viral çoğaltma izlemek için HRSV-GFP rekombinant virüs kullanımı

Not: Bir sınıf II Emanet dolabı kullanma steril bir ortamda 5.1 ve 5.2.5 hariç tüm adımları uygulayın.

  1. Hücresel gen RSV çarpma üzerinde susturmak etkisini izleme
    Not: Transfection iletişim kuralı üzerinde reaktif bağlıdır ( Tablo malzemelerigörmek).
    1. 96-şey plakaları GFP ölçüm için hazırlayın. İki gün önce tahlil, küçük müdahale RNA (siRNA), hazırlamak bir çözüm siRNA, 100 bir konsantrasyon içeren düşük serum medya nM ve 1/500 seyreltilmiş bir siRNA transfection reaktif. Oda sıcaklığında 30 dk için çözüm kuluçkaya.
    2. 5.1.1 (içinde nüsha) hazırlanan tabak wells 25 µL çözüm ekleyin. Tohum, 4 x 105 hücre/mL 3 x 105 hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik olmadan tam orta A549 hücrelerinin bir süspansiyon, 75 µL Wells'le. 48 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
      Not: Son siRNA konsantrasyon 25'nm ve son transfection reaktif hacmi olduğunu 0.5 µL/iyi).
    3. Hücreleri aşağıdaki gibi bulaştırmak. Orta kuyulardan kaldırın. 50.000 PFU/mL 100 µL RSV GFP süspansiyon ekleyin ve 2 h 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya. Viral süspansiyon kaldırın ve DMEM % 2 FCS ve fenol red olmadan 100 µL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    4. 24 saat ve 48 h p.ı., Floresans ölçmek, bir spectrofluorometer kullanarak 488 ve 520 nm, uyarma ve emisyon boyları için sırasıyla ayarla (göreli floresan biriminde Floresans ifade edilir). Noninfected A549 hücreleri floresan ve arka plan düzeyleri için standartları olarak kullanın.
      Not: Hücreleri plaka kapak ölçme önce %4 paraformaldehyde (PFA) ile sabit olması gerekir.
  2. RSV GFP kullanarak uyuşturucu inhibisyon değerlendirilmesi
    1. 96-şey plakaları GFP ölçüm için hazırlayın. Tahlil, önceki gün bir süspansiyon HEp-2 hücre fenol red olmadan tam orta 5 x 105 hücre/mL, 100 µL Wells'le tohum.
    2. Test edilmiş bir seri seyreltme hazırlamak % 2 FCS ve antibiyotik (iyi başına 50 µL) ile tamamlanmaktadır MEM ilaçlar (Bu örnekte AZ4316). Bir viral süspansiyon MEM 10.000 PFU/mL, fenol red (iyi başına 50 µL) olmadan ve stromal vasküler faktörü (SVF) hazırlayın.
    3. Orta 96-şey HEp-2 yerinden kaldırmasını plaka ve uyuşturucu süspansiyon 50 µL ve viral süspansiyon (içinde nüsha) 50 µL ekleyin. Sahte bir enfeksiyon paralel olarak bir denetim olarak gerçekleştirin.
      Not: Uyuşturucu seyreltme ve viral süspansiyon sayfasındaki hücreleri eklemeden önce karışık olması veya ardışık olarak eklenebilir.
    4. 48 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    5. 5.1.4. adımda açıklandığı gibi bir spectrofluorometer kullanarak Floresans ölçmek. Sahte enfekte HEp-2 hücreleri floresan arka plan düzeyleri için standartları olarak kullanın.

6. M2-1 yerelleşme Vivo RSV-M2-1-GFP rekombinant virüs ile karakterizasyonu

Not: Bir sınıf II Emanet dolabı kullanma steril bir ortamda 6.1 ve 6.2 numaralı adımları gerçekleştirin.

  1. HEp-2 hücre, 5 x 105 hücre/mL tam orta bir süspansiyon hazırlamak. Tohum 35 mm Petri kabına permeant CO2 ve adapte için hücre süspansiyon 1,5 mL görüntüleme yaşıyor.
  2. 3.3-3.5 adımlarda açıklandığı gibi enfeksiyon MOI 1, RSV-M2-1-GFP virüsle tohum sonra gün gerçekleştirmek (orta kaldırmak, 500 µL inoculum, 1 mL için eklemek ve 2 h için hafifçe sallayarak süre örneği 37 ° C'kuluçkaya; inoculum kaldırmak ve MEM 1,5 mL 2 ekleyin % FCS). 37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri (IBS 10 h p.ı. görünmeye başlar) istenen kez kuluçkaya.
  3. 40 x 100 x hedeflere 37 ° C'de Sahne Alanı'nda enfekte hücreleri içeren Petri kabına koyarak önce ile donatılmış bir ters mikroskobu kuluçka odası Onceden. CO2 kaynağı açın ve odak stabilization için bekleyin.
  4. Fototoksisite en aza indirmek için bir düşük uyarma yoğunluğu ve görüntü frekansı (1 min başına 0.1 görüntü için) altında GFP uyumlu filtrelerle Imaging gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, floresan protein (Şekil 2) ifade rekombinant RSV virüs üretmek için detaylı bir protokol nitelendirdi. PRSV-GFP GFP gen P ile M arasında gen için daha önce yayımlanmış çalışma21kiraz gen açıklandığı gibi kullanılmaya başlandı. PRSV-M2-1-GFP, M2 gen dokunulmaz ve bir ek gen M2-1-GFP için kodlama SH ve G genler12arasında eklenmiş. İlk adım, belgili tanımlık virüs BSRT7/5 hücrelerdeki kurtarmak için k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada rekombinant RSVs beş plazmid gelen kurtarma yöntemi ve onların amplifikasyon mevcut. Virüs genomu işleme yeteneği mutasyon test etmek ve ek bir gen veya etiketli bir viral protein hızlı Viroloji araştırma devrim yarattı. RSV biz açıklanan ve bu makaledeki örnek bir muhabir gen, RSV-GFP (yayınlanmamış) ve bir M2-1 protein bir GFP etiketi12' ye erimiş ifade ifade bir virüs olduğu gibi kullanılabilir. RSV kurtarmak zordur ve pratik gerektirir. Transfection verimlilik, transfection reaktif akıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Dr Qin Yu AstraZeneca R & D Boston, MA, ABD AZD4316 uyuşturucu verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Cymages platforma erişim ScanR Olympus mikroskop için minnettarız tarafından desteklendiği bölgesinden Ile-de-France (LOŞ bir sağlık) verir. Yazarlar INSERM ve Versailles Saint-Quentin Üniversitesi destek kabul etmiş oluyorsunuz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Canlı hücre görüntüleme için 35 mm ve mikro çanakIbidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591Avicels ile ilgili teknik ve diğer bilgiler http://www.fmcbiopolymer.com adresinde mevcuttur. Oda sıcaklığında saklayın. Adım 4'teki protokol bu reaktif için optimize edilmiştir.
BSRT7/5ticari olarak mevcut değildirReferans 22'a bakın. Buchholz ve ark. 1999
Kristal viyole çözeltisiSigmaHT90132
Gözlemler için floresan mikroskobuOlympusIX73 Olympus mikroskobu
Videomikroskopi için floresan mikroskobuOlympusScanR Olympus mikroskobu
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES &; ge; %99,5SigmaH3375
L-Glutamin (200 mM)ThermoFisher Scientific25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAKTIFIThermoFisher Scientific11668019Protokolü adım 2.3'te yer alan bu reaktif için optimize edilmiştir.
MEM (10x), glutamin içermezThermoFisher Scientific11430030
MEM, GlutaMAX TakviyesiThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus, & ge; %99,5SigmaM7506
Opti-MEM I İndirgenmiş Serum OrtamıThermoFisher Scientific51985-026
Paraformaldehit Sulu Çözelti, %32, EM Dereceli ElektronMikroskobu Bilimleri15714
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Plazmitlerticari olarak mevcutdeğildirReferans 21 bakın. Rameix-Welti ve ark. 2014
Bkz. Testere RockerVWR444-0341
Si, RNA, GAPDH, Dharmacon,ON-TARGETplus siRNA
, D-001810-10-05		SMARTpool ve Dharmocon tarafından tasarlanan 4 ayrı siRNA'dan 3'ü.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Havuzu- İnsan
L-004330-00-0005		Dharmacon.
tarafından tasarlanan 4 ayrı siRNA'dan oluşan SMARTpool Bireysel referanslar ve diziler
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus özel siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU ve UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus Hedeflemeyen Havuz
SiRNA transfeksiyon reaktifiDharmaconDharmaFECT 1 Ref: 2001.ve 03. adımlardaki T-5.1-5.1.2 protokolü bu reaktif için optimize edilmiştir.
Sodyum Bikarbonat% 7.5 çözeltiThermoFisher Scientific25080094
SpektroflorometreTecansonsuz M200PRO
, , , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958(2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563(2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104(2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Rekombinant Respiratuar Sinsitiyal Vir sTers Genetik SistemiViral Stok AmplifikasyonuPlak Titrasyon AnaliziBSR T7 5 H creleriHEp 2 H cre EnfeksiyonuGFP Floresan TakibiMikrokristalin Sel loz KaplamaViral Hasat DondurmaPlak Olu turan Birimler

İlgili makaleler