Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği
Bu makalede
Özet
Özet
Yetişkin nörogenezi, dentat girus (DG) ' nin subgranüler bölgede (SGZ) yeni aktif nöral kök hücrelerinin (NCIS), mevcut bir nöron devresine entegre olan ve spesifik hipokampel işlevlerine katkı sağlayan dinamik bir süreçtir. . Önemlisi, Yetişkin nörogenezi çevresel uyaranlara son derece duyarlıdır, bu da çeşitli bilişsel işlevlerin faaliyete bağımlı olarak düzenlenmesi için izin verir. Çeşitli beyin bölgelerinden gelen sinir devreleri geniş bir yelpazede bu karmaşık bilişsel fonksiyonları düzenler. Bu nedenle, özel nöral devrelerin yetişkin nörogenezi nasıl düzenleylediğini anlamak önemlidir. Burada, sinirsel devre aktivitesini, NSCs 'Yi ve yeni doğmuş kemirgenleri düzenleyen tasarımcı ilaçlar (DREADDs) teknolojisi ile özel olarak aktive eden tasarımcı reseptörü kullanarak manipüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kapsamlı protokol, viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonu, spesifik nöral devrelerin kemogenetik stimülasyon, timidin analog yönetim, doku işleme, immünofloresan etiketleme, konfoksal görüntüleme ve görüntüleme içerir. nöral öncü hücrelerin çeşitli aşamalarında analizi. Bu protokol, nscs ve onların kendi kendi kendi onların kendi ve onların onların onların onların onların onların görselleştirmek için kullanılan antijen alma teknikleri hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar ve klozapin N-oksit (CNO) veya CNO içeren içme suyu kullanarak beyin devreleri modüle basit, ama etkili bir yol DREADDs-virüs ifade. Bu protokolün gücü, NSCs 'den elde edilen yetişkin nörogenezi etkileyen çok çeşitli nöral devrelerin incelenmesi için uyum içinde yatıyor.
Giriş
Yetişkin nörogenezi yeni nöronların bir yetişkinde doğmuş ve mevcut sinir ağları1entegre olan biyolojik bir süreçtir. İnsanlarda, bu süreç Hippocampus dentat girus (DG) oluşur, yaklaşık 1.400 yeni hücreler her gün2doğdu. Bu hücreler, subgranüler bölge (SGZ) olarak adlandırılan, bir nörojenik niş liman DG, iç bölümünde ikamet. Burada, hipokampal yetişkin sinir kök hücreleri (NSCs), öğrenme ve bellek, ruh düzenleme ve stres tepkisi dahil olmak üzere belirli beyin fonksiyonlarının düzenlenmesi için katkıda tam işlevsel nöronlar olmak için karmaşık bir gelişimsel süreç geçmesi3 ,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedürler, Kuzey Carolina Chapel Hill Üniversitesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıesuc) tarafından onaylanmıştır.
1. viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonu
- Söz konusu nöral devreleri belirleyin. Bu, aşağıdaki prosedür için kullanılan virüs ve fare çizgisini belirleyecektir.
Not: Bu örnek için, kontralateral yosunlu hücre projeksiyonları yetişkin nörojenez üzerindeki etkilerini analiz etmek için uyarılır. Viral parçacıklar kodlama AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry 5ht2A-CRE fareler15DG teslim edilir. - 8 haftalık erkek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıda açıklanan deneysel prosedürleri takiben (Şekil 1a,B), Hippocampus içinde nörojenik niş üzerinde kontralateral yosunlu hücre projeksiyonları uyarıcı etkilerini belirlemek başardık. Bir CRE bağımlı GQ kullanarak-bir yosunlu hücre 5-HT2A CRE-Line etiketleme ile eşleştirilir uyarıcı dreadd virüs eşleşen, biz seçmeli olarak kontralateral DG üzerine yosunlu hücrelerden uyarıcı projeksiyonları etkinleştirmek başardık ve bu güçlü yosunlu hücre tespit stimülasyon teşvik kök .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün amacı, bir dizi immünhistokimya tekniklerini kullanarak özel nöral devrelerin nasıl manipüle edildiğini değerlendirmek. Spesifik nöral devrelerle aracılık edilen yetişkin nörojenezinin aktiviteye bağımlı olarak düzenlenmesi, çeşitli nöral devrelerin incelenmesi için büyük bir potansiyele sahip değerli bir tekniktir. Bu tür deneylerin başarısı, doğru viral teslimat, istenilen manipülasyon için uygun viral seçim, bir timidin analog, hayvan yaşı, immünostasyon verimliliği, başarılı uygun teslim dahil olmak üze.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
L.J.Q. Ulusal Sağlık Enstitüsü Ruh Sağlığı Ulusal sağlığı Enstitüleri çeşitlilik Supplement R01MH111773 yanı sıra T32 eğitim hibe T32NS007431-20 altında tarafından desteklenmektedir. Bu proje NıH (MH111773, AG058160 ve NS104530) dan js verilen hibe desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 Kuyulu Plaka | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Kuyulu Plaka | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Etinil-2'-deoksiuridin (Edu) | Karbosynth | NE08701 | |
| Alkol %70 İzopropil | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alkol Hazırlama Pedleri | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Tavuk Nestin Aves | NES; RRID: AB_2314882 | ||
| Keçi Karşıtı DCX | Santa Cruz | Kedisi # SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Fare Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Çözeltisi (povidon-iyot) | Amazon | ||
| Sitirik Asit Stoku [.1M] Sitrik Asit (21g/L sitrik asit) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Klozapin N-Oksit | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Konfokal Yazılım (Zen Siyahı) | Zeiss Mikroskobu | Zen 2.3 SP1 FP1 (siyah) | |
| Bakır (II) Sülfat Pentahidrat | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Pamuklu Çubuklar | Amazon | ||
| Lamel | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Hassas Görev Mendili Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Matkap Ucu 0,5 mm | İnce Bilim Araçları | 19007-05 | |
| Etilen Glikol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton İğne 2 inç | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Şırınga 5 & L Model 75 RN | Hmailton Şirketi | Ref: 87931 | |
| Yüksek Hızlı Matkap | Foredom | 1474 | |
| İnfüzyon Pompası | Harvard Aparatı | 70-4511 | |
| Enjekte Edilebilir Salin Çözeltisi | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| İnsülin Şırıngası | BD Ultra İnce İnsülin Şırıngaları | ||
| İzofluran | Henry Schein | 29405 | |
| Küçük Hayvan İçin Stereotax | KOPF Aletleri Model | 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Mikrotom | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Mikroskopi | ||
| Nair (Epilasyon Ürünü) | Nair | ||
| Paraformaldahyde %4 | Sigma-Aldrich | ||
| Plus Şarjlı Slayt | Denville Scientific | M1021 | |
| Fosfat Tamponlu Çözelti (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Veteriner Merhem | Puralube | ||
| Slayt Rafı 20 slayt ünitesi | Elektron Mikroskobu Bilimi | 70312-24 | |
| Sürgülü Raf tutucu | Elektron Mikroskobu Bilimi | 70312-25 | |
| Küçük Hayvan Isıtma Yastığı | K & H | ||
| Sükroz | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Süper PAP Kalem 4 mm uçlu | PolySciences | 24230 | |
| Cerrahi Neşter | MedPride | 47121 | |
| Tris Tamponlu Çözelti (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodyum sitrat Stoku [0.1 M] Tri-sodyum Sitrat (29.4g/L tri-sodyum sitrat) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Cımbız | Amazon | ||
| Vet Bond Doku Yapıştırıcısı | 3M | 1469SB |
Kaynaklar
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
