Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

6.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59237

⸱

24 Temmuz 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of North Carolina Chapel Hill, 2Neuroscience Center, University of North Carolina Chapel Hill, 3Neuroscience Curriculum, University of North Carolina Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Özet

Yetişkin nörogenezi, dentat girus (DG) ' nin subgranüler bölgede (SGZ) yeni aktif nöral kök hücrelerinin (NCIS), mevcut bir nöron devresine entegre olan ve spesifik hipokampel işlevlerine katkı sağlayan dinamik bir süreçtir. . Önemlisi, Yetişkin nörogenezi çevresel uyaranlara son derece duyarlıdır, bu da çeşitli bilişsel işlevlerin faaliyete bağımlı olarak düzenlenmesi için izin verir. Çeşitli beyin bölgelerinden gelen sinir devreleri geniş bir yelpazede bu karmaşık bilişsel fonksiyonları düzenler. Bu nedenle, özel nöral devrelerin yetişkin nörogenezi nasıl düzenleylediğini anlamak önemlidir. Burada, sinirsel devre aktivitesini, NSCs 'Yi ve yeni doğmuş kemirgenleri düzenleyen tasarımcı ilaçlar (DREADDs) teknolojisi ile özel olarak aktive eden tasarımcı reseptörü kullanarak manipüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kapsamlı protokol, viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonu, spesifik nöral devrelerin kemogenetik stimülasyon, timidin analog yönetim, doku işleme, immünofloresan etiketleme, konfoksal görüntüleme ve görüntüleme içerir. nöral öncü hücrelerin çeşitli aşamalarında analizi. Bu protokol, nscs ve onların kendi kendi kendi onların kendi ve onların onların onların onların onların onların görselleştirmek için kullanılan antijen alma teknikleri hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar ve klozapin N-oksit (CNO) veya CNO içeren içme suyu kullanarak beyin devreleri modüle basit, ama etkili bir yol DREADDs-virüs ifade. Bu protokolün gücü, NSCs 'den elde edilen yetişkin nörogenezi etkileyen çok çeşitli nöral devrelerin incelenmesi için uyum içinde yatıyor.

Giriş

Yetişkin nörogenezi yeni nöronların bir yetişkinde doğmuş ve mevcut sinir ağları1entegre olan biyolojik bir süreçtir. İnsanlarda, bu süreç Hippocampus dentat girus (DG) oluşur, yaklaşık 1.400 yeni hücreler her gün2doğdu. Bu hücreler, subgranüler bölge (SGZ) olarak adlandırılan, bir nörojenik niş liman DG, iç bölümünde ikamet. Burada, hipokampal yetişkin sinir kök hücreleri (NSCs), öğrenme ve bellek, ruh düzenleme ve stres tepkisi dahil olmak üzere belirli beyin fonksiyonlarının düzenlenmesi için katkıda tam işlevsel nöronlar olmak için karmaşık bir gelişimsel süreç geçmesi3 ,4,5,6. Davranışları etkilemek için, Yetişkin NSCs, yerel ve distal kimyasal ipuçlarını bir dizi yanıt olarak bir aktivite bağımlı şekilde çeşitli dış uyaranlar tarafından son derece düzenlenir. Bu kimyasal ipuçları, nörotransmitter ve nöromodüller içerir ve çeşitli beyin bölgelerinden bir devre belirli bir şekilde hareket. Daha da önemlisi, NSCs üzerindeki bu kimyasal ipuçlarını devre geniş yakınsama kök hücre aktivasyonu, farklılaşma ve kader kararları benzersiz ve kesin düzenleme sağlar.

Yetişkin NSCs in vivo devre düzenlemesi için en etkili yollarından biri, devre geniş manipülasyonları ile immünofluorescence Analizi eşleştirerek olduğunu. Yetişkin NSCs 'nin immünofloresan analizi, Yetişkin NSCs 'nin gelişimsel aşamasını göstermek için spesifik moleküler işaretlere karşı antikorların kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu işaretçiler şunlardır: bir radyal glia hücre ve erken nöral progenitör Marker olarak nestin, bir ara progenitör Marker olarak Tbr2, ve bir Nöroblast ve olgunlaşmamış nöron Marker olarak DCX7. Ayrıca, BrdU, Cidu, IDU ve edu gibi timidin analogları yöneterek, S aşaması geçiren hücre popülasyonları bağımsız olarak etiketli ve8,9,10görselleştirilebilir. Bu iki yaklaşımı birleştirerek, çeşitli ipuçlarını NSC farklılaşma ve nörojenezi nasıl etkilediğini, belirli gelişimsel aşamalarında proliferasyon nasıl düzenlendiği arasında değişen çok sayıda soru araştırılabilir.

Elektrik stimülasyon, optogenetik ve kemogenetik, her biri kendi avantajları ve dezavantajları ile dahil olmak üzere nöral devreleri etkili bir şekilde işlemek için çeşitli seçenekler var. Elektriksel stimülasyon, elektrotların daha sonra hedeflenen bir beyin bölgesini modüe etmek için elektrik sinyallerini iletmek için kullanılan spesifik bir beyin bölgesine implante edildiği kapsamlı bir ameliyatla ilgilidir. Ancak, bu yaklaşım hem hücresel ve devre özgüllüğü yoksun. Optogenetiği, implante edilmiş bir optik liften yayılan bir lazer tarafından uyarılan bir ışık aktif reseptörü kodlayan viral partiküllerin teslim edilmesini içerir, ancak geniş manipülasyon, büyük maliyet ve karmaşık ameliyatlar11gerektirir. Chemogenetics daha sonra özel ve biyolojik olarak inert ligand klozapin N-oksit (CNO)12 olarak bilinen tarafından aktive edilir tasarımcı ilaçlar veya dreadds tarafından aktive bir tasarımcı reseptörü kodlayan viral partiküllerin teslimini içerir . Yetişkin NSCs düzenleyen yerel nöral devreleri işlemek için DREADDs kullanarak avantajı CNO yönetim kolaylığı ve çeşitli yolların yatıyor. Bu da, uzun süreli çalışmalar için nöral devreleri modüe etmek için kolayca adapte olan, azaltılmış hayvan elleçleme ile daha az zaman alıcı bir yaklaşım sağlar.

Bu protokolde açıklanan yaklaşım, hem immünofluoresesans teknikleri hem de devre manipülasyonlarını birleştiren yetişkin hipokampal nörojenezinin devre yönetmeliğini başarıyla sorgulamak için gerekli çeşitli protokollerin kapsamlı bir koleksiyonudur. chemogenetics kullanarak. Aşağıdaki protokolde açıklanan yöntem, Yetişkin nörogenezi üzerinde düzenleyici fonksiyonlarını belirlemek için aynı anda bir veya birden fazla devresi uyarıcı veya inhibe etmek için uygundur. Bu yaklaşım, soru yüksek derecede geçici çözünürlük gerekmiyorsa en iyi şekilde kullanılır. Belirli bir frekans stimülasyon/inhibisyonu hassas temporal kontrol gerektiren sorular, daha iyi optogenetiği kullanarak ele alınabilir13,14. Burada açıklanan yaklaşım, özellikle stres önemli bir sorun olduğu zaman minimal hayvan kullanımı ile uzun vadeli çalışmalar için kolayca adapte edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedürler, Kuzey Carolina Chapel Hill Üniversitesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıesuc) tarafından onaylanmıştır.

1. viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonu

  1. Söz konusu nöral devreleri belirleyin. Bu, aşağıdaki prosedür için kullanılan virüs ve fare çizgisini belirleyecektir.
    Not: Bu örnek için, kontralateral yosunlu hücre projeksiyonları yetişkin nörojenez üzerindeki etkilerini analiz etmek için uyarılır. Viral parçacıklar kodlama AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry 5ht2A-CRE fareler15DG teslim edilir.
  2. 8 haftalık erkek heterozigot 5HT2A-CRE fareye önceden empatif analjezi sağlamak için Meloksikam 'ı (5 mg/kg, subkutan) en az 30 dakika önceden operatif olarak yönetin.
  3. Nefes yavaşlatır ve fare bir izofluran odası kullanarak bilinçsiz kadar% 4 izofluran oksijen karışımı kullanarak fareyi anestezize. Toe hassas olmadığından emin olmak için fareyi tutam.
  4. Fare, termal düzenleme için küçük bir hayvan Isıtma pad üzerinde stereaks yerleştirin ve her göz göz yağlayıcı uygulayın. Hayvan stereomin içinde olduğunda% 1,5 için Isoflurane azaltın.
    Not: Bu aşamada kulak çubuğu yerleştirme önemlidir. Kulak çubuğunun yerleştirildikten sonra kafasının seviye olduğundan emin olun. Daha ayrıntılı talimatlar Geiger ve ark.16' da bulunabilir.
  5. Başını saç kaldırma ürünü yerleştirin ve en fazla 1 dk kadar oturmak izin. Etanol mendilleri ile başını silerek saç çıkarın. Saç tamamen kaldırılırsa, baş üst saçlı kadar bu işlemi tekrarlayın tüysüz.
  6. En az 3 kez bir povidone-iyot çözeltisi ile saçsız alanı dezenfekte.
  7. Baş tüysüz cilt üzerinde topikal lidokain solüsyonu yerleştirin ve 1 dakika bekleyin. deriden topikal lidokain çıkarın ve yaklaşık 2 mm cerrahi bir neşter kullanarak kulakları başlangıcından gözlerinin başından itibaren kafasına küçük bir kesi yapmak.
    Not: Toe herhangi bir kesikler yapmadan önce tamamen yatıştırıcı olduğundan emin olmak için fareyi tutam.
  8. Kafa derisi geri çekin ve kemiğinin kolayca tanımlanabilir kadar sterilize pamuk bezlerden kullanarak baş üst üzerindeki bağ dokusu temizleyin.
  9. Kemiğinin bulun ve böylece kemiğinin ve lambda aynı düzlemde her iki koordinatlarda matkap yerleştirerek ve onlar hizalamak güvence başını ayarlayın. Ayrıca, matkabı ve lambda arasında bir bölgenin sağdan sola/sağa koyarak sol ve sağ Yarımküre hizalayın.
    Not: Bu adım çok önemlidir; Düzgün hizalanmamış kafa yerleşimi stereotaktik koordinatları bozacaktır.
  10. 0,5 mm 'lik matkap biti kullanarak kemiğinin 'dan aşağıdaki koordinatlarda matkap: anterior posterior eksen (AP)-2,00 mm, medial lateral eksen (ml) + 1,50 0,5 mm
    Not: Bu adımı, söz konusu devreye özgü koordinatlar ile değiştirin. Bu örnek, moıpli hücreler içeren tek taraflı dentat girus hedefler ve Kontralateral tarafta yetişkin nöral kök hücreleri üzerindeki etkilerini belirler.
  11. Matkap 5 μL şırınga ve 26 − 33 G iğne ile değiştirin. Sıfır kemiğinin ve daha sonra aşağıdaki koordinatlara enjekte ön arka ekseninde matkap deliği iğne yerleştirerek-2,00 mm, medial lateral eksen-1,50 mm, dorsal ventral eksen-2,3 mm.
  12. İnfkullanım 500 nL Adeno ile ilişkili virüs (AAV) bir viral çekirdek veya ticari kaynaktan uygun Yarımküre için, 50 − 100 nL/min bir Infüzyon pompası kullanarak (malzeme tablosu). Yavaşça beyinden iğne çıkarmadan önce en az 5 dk Enjeksiyon sonrası bekleyin.
    Not: Bu koordinatlar, fare yaş ve boyutuna göre ayarlama gerektirebilir. Bazı viral serotipleri farklı difüzyon desenleri var, tam bir deney önce viral Spread test etmek için pilot deneyler yapmak en iyisidir.
  13. Tuz kullanarak kesi etrafında temiz kafa derisi ve cilt, sonra cımbız ile birlikte cilt tutarken doku yapıştırıcı (malzeme tablosu) kullanarak kesi mühür. Fare aktif olana kadar bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarma sırasında izleme, yarada analjezik uygulayarak ve iki gün boyunca ağrı kesiciler yönetmek gibi tüm post-operatif prosedürleri gerçekleştirin.
    Not: Birçok deney, doğru viral ifade için viral infüzyon sonra 2 − 4 hafta bekleme süresi gerektirir.

2. Clozapine N-oksit yönetimi

  1. 100 μL dimetil sülfoxid (DMSO) ve vortexing içinde 10 mg CNO çözünerek bir hisse senedi CNO çözüm hazırlayın.
    Not: Çözüm tamamen Çözünmezse, DMSO hacmi artırmak, ancak çok fazla DMSO su acı yapabilir. 200 mL 'Lik bir çözelti için CNO su çözeltisi veya 200 μL 'den fazla DMSO 'da% 0,1 DMSO değerini aşmayın. CNO hisse senedi çözümü iki haftaya kadar-20 °C ' de depolanabilir.
  2. 1 − 5 mg/200 mL 'Lik son konsantrasyon için her 200 mL su için 10 − 50 μL, 10 mg/100 μL CNO stok çözeltisi ekleyin. CNO su karışımı her gün taze hazırlayın.
    Not: Bazı gruplar, fareler içmekten kaçınıyorsanız, su içinde% 1 ' e kadar sakalı maskenin içine sokmaktadır. Devre incelenmiştir aktivasyon ölçüde dayalı farklı bir yanıt gösterdi. Genel olarak, 1 mg CNO/200 mL çoğu devreleri uyarmak için yeterlidir17.
  3. 4 gün bir süre içinde adım 1,13 stereotaktik enjeksiyonu kurtarma iki hafta sonra fareler için yönetirken bir folyo kaplı veya hafif korunan konteyner CNO çözüm yerleştirin.
    Not: CNO hafif duyarlıdır; Tüm süreç boyunca ışığa maruz kalmayı azaltır.
  4. Taze CNO çözeltisi hazırlarken her gün tüketilen CNO su çözümünü ölçün ve kaydedin. Ortalama olarak, bir yetişkin fare yaklaşık tüketecektir 4 CNO su karışımı mL. Ayrıca, kayıt fare ağırlığı günlük içme sağlamak için.
  5. Her deneme için uygun denetimlerin kullanıldığını emin olun. Hem CNO hem de DREADD denetimini içerir. Deneysel bir kurulum örneği şunlardır: (1) araç + otonom anotatik araç (AAV) ile viral muhabir Hayır DREADD, (2) CNO + AAV viral muhabiri No DREADD ile, ve (3) CNO + AAV DREADD.
    Not: Tüm gruplar çözümde DMSO içerir. Hayvanlar, farelerde yetişkin nöral kök hücrelerinde olumsuz etkilere sahip olduğu gösterilmediği için% 0,1 ' den az DMSO alırken DMSO kontrolleri dahil edilmez. İçme suyunda DMSO kullanımı ile ilgili endişeleri varsa, ek bir DMSO ve tuzlu kontrol ekleyin.

3. thymidine analog etiketleme

  1. Doku toplama gününde, CNO yönettikten 4 gün sonra, bir dizi timidin analog, 5-etynyl-2'-deoxyuridine (edu) intraperitoneal enjeksiyonları yaparak hücreleri etiketleyerek proliferasyon.
    Not:     bu protokol edu kullanır. Ancak, verimli BrdU, IDU ve Cidu8de dahil olmak üzere Proliferasyona hücre nüfusu etiketleyebilirsiniz birkaç timidin analogları vardır.
    1. Edu tartın ve veteriner Grade 0,9% sodyum klorür enjeksiyon çözeltisi içinde çözülür 4 mg/mL vorjürleme ve 15 dakika boyunca bir rotor yerleştirerek.
      Not: Thymidine analogları toksik ve hafif duyarlıdır. Alüminyum folyo kullanarak ışık pozlama çözümü işleme ve kapak malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) izleyin.
    2. Edu 'da intraperitoneal 40 mg/kg veya 0,1 ml/10 g vücut ağırlığının 4 mg/ml edu çözeltisi 4 kez her 2 saat içinde yönetin.
      Not: Yukarıda doz 50 mg/kg doygunluk düzeylerine yakın ulaşmak ve etiketli Proliferasyona hücrelerin miktarını önemli ölçüde artırmaz18. Yanlış etiketleme sonuçları eğriltme beri tüm fareler edu enjeksiyonları aynı miktarda almak çok önemlidir.

4. doku hazırlama ve Işleme

  1. Son edu enjeksiyonu sonrasında iki saat, nefes almak kadar bir izofluran Oda kullanarak fareyi anestezize önemli ölçüde azalır ve tamamen yatıştırıcı sağlamak için ayak tutam.
  2. İğneler kullanarak yüzeye fareyi güvenli ve kalp açığa küçük bir kesi yapmak. Sol aort 25 G iğne yerleştirin ve karaciğer dokusu temizlenene kadar 1 − 4 ml/dak debisi ile fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile transcardial perfüzyon için sağ ventrikül kesiniz.
  3. Perfüzyon çözümünü% 4 paraformaldehit (PFA) olarak değiştirin ve beyin dokusunu düzeltmek için 15 − 20 mL civarında perfkullanım yapın.
    Not: Perfüzyon süreci hakkında daha ayrıntılı talimatlar Gage ve al.19' da bulunabilir. Hayvan titreçleri düzgün yapılırken gözlenir.
  4. Büyük makas bir çift kullanarak başını çıkarın ve sonra kafatasından beyin özgürleþmek için dikkatli kesikler bir dizi gerçekleştirin. Beyin dokusunu 4 °C ' de% 4 PFA 'da saklayın.
  5. 4 °C ' de 24 saat boyunca PBS 'de% 10 ' lık sukroz çözeltisi içinde% 4 PFA çözeltisi ve yerine beyin dokusunu çıkarın. Sonra dokusunu% 30 sakaroz PBS çözeltisi için başka bir 24 saat 4 °c ' de sekmeden önce aktarın.
    Not: Mikrotome bölümleme için hazır olduğunda beyin dokusu sakaroz içinde batacak. Beyin dokusu% 30 sucrose uzun vadede depolanabilir.
  6. 40 μm bölümlerdeki mikrotome kullanarak bölüm beyin dokusu. Dentat gyrus başlangıcından başlayarak bölümler toplamak, hakkında-1,20 mm bregma, ve plaka ilk bölümü ile tamamlandıktan sonra en anterior ve son bölüm en posterior olmak. Doğru DG ve başlangıç doku toplama koordinatları belirlemek için bir fare beyin Atlası danışın.
  7. Serially her bölümü 6 satırlık bir 48 iyi plaka antifriz çözeltisi (Tablo 1) ile dolu depolar.
Antifriz çözeltisiEtilen-glikol 150 ml + sakaroz 150 g + doldurmak için 500 ml 0,1 M PB için 500 ml çözüm
Sitrat tampon9 mL sitrik asit stok + 41 mL Tri-sodyum sitrat tampon + 450 mL ddH2O
Sitrik asit stokları[0,1 M] Sitrik asit 21 g/1 L ddH2O
Tri-sodyum sitrat stok[0,1 M] Tri-sodyum sitrat 29,4 g/1 L ddH2O
Tris tampon tuz-Triton (TBS-Triton)0,05% 100-x Triton TBS 'de
Geçirgen tampon0,5% 100-x Triton TBS 'de
Arabellek engelleme0,33 ml TBS-Triton ' t a mL eşek serumu
Edu reaksiyon çözümüBir CuSO4· 5h2o çözüm ekleyerek 1 mg Cuso4· 5h2o içinde 4 ml çözeltisi [0,1 M] Tris pH 8,5. Sonra 1:40 bir 600 μM Alexa488-azid solüsyonu ve 10 mg/ml L-na+ askorbat 'ye Cuso4· 5h2O çözeltisi dokusuna uygulamadan önce ekleyin.

Tablo 1: immünhistokimya için kullanılan çözümler.

5. immünhistokimya

  1. Temel yüzen protokol
    Not: Eğer boyama nestin, Bölüm 5,1 atlayın ve Bölüm 5,2 geçin. Temel yüzen protokol, Tbr2 veya doublecortin (DCX) için sadece timidin analog edu boyama olmadan içindir.
    1. Bir 48 iyi plakasında seri sırada antifriz çözeltisi Tris-tamponlu tuz (TBS) için bölümleri aktarın.
    2. TBS-Triton ' t a iki kez (0,05% TBS-Triton, Tablo 1) 5 dakika boyunca, her seferinde çözeltinin titreyerek veya yavaş hızlarda rocker üzerinde yıkayın.
    3. Yavaş hızlarda sallayarak, 20 − 30 dakika boyunca geçirgen tampon (0,5% TBS-Triton, Tablo 1) kullanarak bölümleri geçirgen.
    4. 10 mL TBS-Triton ' a 0,33 μL eşek serumu ekleyerek engelleme arabelleğini yapın. 3 gün içinde taze ve kullanım yapın.
    5. Aspirate geçirgen tampon ve blokaj tamponlarında 30 dakika ila 1 saat oda sıcaklığında (RT) inküyasyon yapın.
    6. Arabellek engelleme ve her iyi eklemek birincil antikor çözüm olun. 500 μL/well tüm doku bölümlerinin tamamen batacak şekilde yeterlidir. Bir rocker veya Shaker üzerinde RT bir gecede inkübe.
    7. Birincil antikor izlerini kaldırmak için her biri 10 dakika boyunca TBS-Triton 3x 'de aspirate solüsyonu ve durulama bölümleri.
    8. Bir rocker üzerinde RT 2 h için tampon çözeltisi engelleme hazırlanan primer antikorlar karşı fluorophore konjuyum ikincil antikor içinde inküye.
    9. 5 dk, TBS-Triton her biri için 3x yıkama bölümleri ve sonra 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözeltisi (300 μM çözüm 1:100) PBS içinde 15 dakika seyreltilmiş bölümler inküyeler.
    10. PBS 'de 3x yıkama bölümleri ve pozitif olarak şarj edilmiş bir slaytta anterior 'den posterior seri sırasını koruyarak montaj bölümleri. Nem gözle görülür şekilde kayboluncaya kadar, genellikle 2 − 5 dakika, montaj medyasıyla coverkaymadan önce doku kurumasına izin verin.
  2. Antijen alımı
    Not: Bu bölüm sadece nestin için gereklidir. Eğer boyama nestin, bu bölümü, trimidin analog boyama (Bölüm 5,3) önce gerçekleştirin. Edu ile Tbr2 veya DCX boyama için atlayın.
    1. PBS 'de doku bölümlerini yerleştirin ve pozitif olarak şarj edilmiş bir slayt üzerinde 5 − 8 adet monte edin, seri sırasını anterior posterior olarak korur. RT 'de doku bölümlerinin kuru olmasını sağlar ve yaklaşık 2 − 5 dakika sürer. doku gözle görülür bir şekilde nemden yoksun olmalıdır.
    2. Genellikle 1.000 μL pipet ucu kutusu olan bir kapsayıcıda sitrat tamponu (Tablo 1) hazırlayın.
    3. Çözüm kaynatılıncaya kadar 5 dakika boyunca bir mikrodalga fırında (1.000 W) ısı sitrat tampon. Çözüm ısıtıldığında, 20 kaydırlı cam slayt tutucusuna monte edilmiş bölümler yerleştirin. 5 dakika sonra, slayt tutucusunu dikkatli bir şekilde pipet kutusuna yerleştirin.
    4. Mikrodalga fırın gücünü% 50 ' e ayarlayın ve 7 dakika boyunca pişirin. 7 dakika boyunca bir Zamanlayıcı başlatın ve mikrodalga izleyin. Bu 7 dakika boyunca, çözüm kaynatmaya başlar ve kaynatma durur sonra mikrodalga devam mikrodalga durdurun.
      Not: Bu adımın amacı, su sıcaklığını 7 dakika boyunca kaynama sıcaklığının hemen altında tutman. mikrodalganın pişirme süresi bitse bile zamanlayıcı biterse dur. Daha detaylı talimatlar Hussaini ve al.20' de bulunabilir.
    5. Sitrat tampon ve doku slaytları ile sıcak kutu dışarı çıkarın ve soğuması için bir buz kova yerleştirin. Buz veya diğer malzemelerin çözüme girmesini önlemek için kapak. Yaklaşık 30 dakika bekleyin veya çözüm dokunmak serin kadar.
    6. Timidin Analog kullanarak, timidin analog boyama adım 5.3.2 devam edin.
  3. Thymidine analog boyama
    Not: Edu ve Tbr2 veya edu ve DCX boyama Eğer buradan başlayın.
    1. PBS 'de doku bölümlerini yerleştirin ve pozitif olarak şarj edilmiş bir slayt üzerinde 5 − 8 adet monte edin, seri sırasını anterior posterior ve aynı yönde korur. Doku bölümlerini tamamen slaytlara uymasını ve sonra bir hidrofobik kalem veya PAP kalem kullanarak bir kenarlık çizmek için kuru izin verin.
    2. 20 − 30 dakika boyunca geçirgen tampon (0,5% TBS-Triton) ile bölümleri geçirgen. Sonra 5 dakika boyunca TBS-Triton kullanarak 2x bölümleri yıkayın.
      Not: Geçirgen, hücre içi antikor penetrasyonunu yardımcı olur. Geçirgen süresi, doku kalınlığı ve antikor verimliliğine bağlı olarak ayarlanabilir. Alternatif olarak, bir deterjan konsantrasyonu artırabilir geçirgen gücü artırmak için. Ancak, bakım uzun süreli geçirgen zaman ile doku kırılganlık artar beri çok uzun için geçirgen değil alınmalıdır.
    3. Edu reaksiyon çözümünü Tablo 1' e göre hazırlayın. Alexa488-Azide son konsantrasyonu 1 mL edu reaksiyon solüsyonundaki 15 μM ' dir.
    4. Edu reaksiyon çözeltisi bölümlerinde 30 dakika ile 1 saat arasında inküle ve sonra 5 dakika boyunca TBS-Triton ' t a 3x yıkayın. Bu adımdan sonra ışıkta korumak için alüminyum folyo içinde kapak slaytlar. Bu aşamada edu reaksiyonu floresan mikroskop kullanarak çalışırsa kontrol edin. Edu etiketli hücreler bir epifluorescence mikroskobu altında floresan olacaktır.
  4. Bağlı doku bölümü Protokolü
    1. Blok doku bölümleri ikinci antikor gibi aynı hayvanlarda yükseltilmiş engelleme tampon kullanarak adım 5.3.4 bir slayda monte edilmiş, örneğin, eşek serumu, 30 dakika için 1 h ve daha sonra 5 dk için TBS-Triton 2x yıkayın her.
    2. 1:200 at tampon çözeltisi engelleme birincil antikorlar karıştırarak engelleme adımı sırasında primer antikor (yani, tavuk Anti-nestin) çözüm hazırlayın. 250 her slayt için μL, dokusunun çözelti içinde tamamen batdığından emin olmak için yeterlidir.
    3. Yıkımlar engellendikten sonra RT 'de bir gecede primer antikor çözeltisi içinde doku bölümlerini kulyın. Kullanılan birincil antikor bağlı olarak bu adımı değiştirin.
      Not: Antikor yüksek arka plan veya spesifik olmayan bağlama varsa, RT yerine 4 °C ' de inkübe sonuçları artırabilir. Kötü doku penetrasyonuyla antikorlar, gerekirse 2 gün boyunca inkübe edilebilir.
    4. Aşırı primer antikor kaldırmak için 5 dakika boyunca TBS-Triton ' t a doku bölümlerini 3x inküye. Daha sonra fluorophore konjuyum ikincil antikorlar (yani, Alexa 647 Anti-tavuk 1:200) içinde doku bölümlerini inkük RT 2 h için tampon çözüm engelleme hazırlanmış.
    5. Aşırı ikincil antikor kaldırmak ve 1:100 yılında PBS 'de 300 μM DAPı solüsyonu RT 'de 15 dakika uygulamak için TBS-Triton ' d e 3 adet doku bölümlerini 5 dakika boyunca inküt.
    6. Aşırı DAPı 'yi kaldırmak ve bir pamuk çubukla veya hassas bir görev silme kullanarak PAP kalem dairesini dokudan çıkarmak için 5 dakika boyunca PBS 'de 3 adet doku bölümlerini inküd et. Bölümler kuru ve sonra montaj medya ve kapak slip uygulamak izin verin. Görüntüleme slaytları önce medya kuru montaj edelim.

6. resim koleksiyonu

  1. Slayt etiketlerini kaplayan ve DG 'nin aynı tarafında, 1 μm Step boyutunda 40X yağ büyütme optik lens veya 1 μm ' de 20X 2x zoom ile bir Konfokal mikroskop (malzeme tablosu) kullanarak kontrol gruplarından kör Deneysel gruplar.
    Not: 40X yağ büyütme çözünürlüğü artıracaktır ama 20X 2x zoom daha uzun sürebilir.
  2. 40 x objektif objektif ayarlayın ve sonra Konfokal yazılım (malzeme tablosu) sol üst köşesindeki bul sekmesine tıklayın ve görüş alanının ortasında istenen DG bölümünü ayarlayın.
  3. DG bulun, sol üst köşedeki edinme sekmesine geçin ve aşağıdaki kutuları kontrol edin: Z-Stack, Tile-Scanve Position.
  4. Kanal ayarlarını 600 − 750 kazanç,% 1 −% 15 Lazer yoğunluğu ve 1 − 10 Ofset arasında ayarlayın. Herhangi bir kanal için% 20 lazer yoğunluğunu aşmayın. Kazanç ve yoğunluk ayarlarken piksellerin fazla doymamış olduğundan emin olun.
    Not: Bu aralıkları kullanılan ekipman verimliliği ve boyama verimliliği bağlı olarak değişir.
  5. Fayans tarama penceresinde 3 dikey olarak 7 yatay kutucuklar ayarlayın ve şu anda kullanılmakta olanlar ile aynı ayarları kullanarak tarama genel bakış görüntüye basın. Örneğin, 7 yatay 3 dikey ve 20X objektif 2x zoom ile kullanın.
  6. Genel Bakış taramadan sonra DG tamamen beklenen görüntü içinde olduğundan emin olun. Değilse, bu bir elde edilecektir temsili bir görüntü olduğundan, genel bakış görüntüsü tamamen olana kadar DG görünümünü ayarlayın.
  7. İnce odak düğmesini kullanarak farklı Z yığınları aracılığıyla gezinerek görüntüleme derinliğini ayarlayın. Tüm DG başlangıç ve bitiş noktaları içinde olduğundan emin olun. 1 μm bir adım boyutu varsayarsak, her görüntü yaklaşık 40 basamak olmalıdır.
  8. Tarama hızını çift yönlü taramayla 9 ' a ayarlayın ve edinme modu penceresinde ortalamasını yok. Ardından konum penceresine konum ekleyin.
    Not: Aynı anda birkaç DGs görüntü için 6.3 − 6.8 adımlarını yineleyin. Tarama hızını artırmak görüntü kalitesini düşürür, ancak genel görüntüleme süresini azaltır. Görüntü kalitesi çok düşükse, tarama hızını azaltın veya ortalamayı artırın.
  9. Hazır olduğunda deneme düğmesini Başlat 'ı tıklatın. Arka eksen anterior boyunca fare başına DG 5 bölümleri tarayın. Örneğin, sol DG bölüm biri için görüntülenmiş ise, ikinci bölüm için sonraki en arka sol DG görüntü.
  10. Konfokal yazılımında işlem sekmesinin altındaki dikiş özelliğini kullanarak dentat girus tam bir görüntü oluşturmak için ayrı görüntüleri birlikte Stitch. Alternatif olarak, tam bir dentat gyrus oluşturmak için birlikte görüntüleri dikiş için FIJI (ımagej) kullanın.
  11. Dikişli görüntüleri miktar için kaydedin.

7. görüntü analizi

  1. Her bir dentat girus bölümünün her bir görüntüsünü FIJI kullanarak hem maksimum projeksiyon hem de farklı renklerde birleştirilmiş kanallar ile bileşik bir görüntü olarak kolayca kolokalizasyonu görselleştirmek için açın.
  2. Poligon seçim aracını (soldaki üçüncü kutu) kullanarak maksimum projeksiyon görüntüsünün her bölümü için DG alanını ölçün ve her farenin her bölümü için kayıt yapın. Bu, DG 'nin yoğunluğu hesaplamak için kullandığı alan olacaktır.
  3. Birincil antikor (yani, nestin) ve timidin analog edu colocalizing olan bileşik görüntü DG hücre sayısını kaydetmek, FIJI eklentisi hücre sayacı eklentileri altında bulunan kullanarak | analiz | hücre sayacı | hücre sayacı. Ayrıca, bir radyal işlem ile edu pozitif ve nestin pozitif hücrelerin toplam sayısını kaydedin.
    Not: Nestin durumunda, morfolojiye dikkat etmeniz çok önemlidir. Nöral kök hücrelerini ölçmek, yalnızca radyal bir işlem olan hücrelerin nicelik olduğundan emin olun. Dentat girus bölümlerini ölçerek, özellikle bir odak düzleminin dışındaki hücreleri görselleştirirken, aynı ölçütleri hepsine uygulayın. Hücreler odak düzleminde değilse, onları saymayın. Stereolojik değerlendirme hakkında daha ayrıntılı bilgi için lütfen West ve al.21 ' e bakın.
  4. Daha sonra analiz için tüm veri parçalarını derlemek için bir elektronik tablo yazılımına hücre sayılarını girin.
  5. Her bir bölüm için yerelleştirilmiş hücrelerin toplam sayısını her bir hayvanın her bölümü için toplam hacmine bölerek, lokalize hücrenin yoğunluğunu hesaplayın. Örneğin, bir hayvan içinde DG hacmi toplamı ile bir hayvan nestin +/edu + hücrelerinin toplamını bölerek kök hücre yoğunluğu elde. Her bir bölümün hacmi, her adımın 1 μm olduğunu varsayarak toplam Z-Step artışlarıyla alanı çarpılarak hesaplayın.
    Not: Bu protokolde toplam adımlar 40 ' e yakın olmalıdır, çünkü doku 40 μm olarak kesilmiştir. her hayvanın bir veri noktası olduğundan emin olun, bu yaklaşımın amacı, bir hipoampus bir yarımküdeki toplam kolokalize hücrelerin miktarını tahmin etmektir.
  6. Bir adrese çalışıyor soru için gerekli ek hesaplamalar gerçekleştirin. Bu örnekte, çoğalan hücrelerin genel sayısını, toplam kök hücre popülasyonunu ve kontralateral yosunlu hücrelerini stimüle ettikten sonra proliferasyon kök hücrelerinin yüzdesini hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan deneysel prosedürleri takiben (Şekil 1a,B), Hippocampus içinde nörojenik niş üzerinde kontralateral yosunlu hücre projeksiyonları uyarıcı etkilerini belirlemek başardık. Bir CRE bağımlı GQ kullanarak-bir yosunlu hücre 5-HT2A CRE-Line etiketleme ile eşleştirilir uyarıcı dreadd virüs eşleşen, biz seçmeli olarak kontralateral DG üzerine yosunlu hücrelerden uyarıcı projeksiyonları etkinleştirmek başardık ve bu güçlü yosunlu hücre tespit stimülasyon teşvik kök ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün amacı, bir dizi immünhistokimya tekniklerini kullanarak özel nöral devrelerin nasıl manipüle edildiğini değerlendirmek. Spesifik nöral devrelerle aracılık edilen yetişkin nörojenezinin aktiviteye bağımlı olarak düzenlenmesi, çeşitli nöral devrelerin incelenmesi için büyük bir potansiyele sahip değerli bir tekniktir. Bu tür deneylerin başarısı, doğru viral teslimat, istenilen manipülasyon için uygun viral seçim, bir timidin analog, hayvan yaşı, immünostasyon verimliliği, başarılı uygun teslim dahil olmak üze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

L.J.Q. Ulusal Sağlık Enstitüsü Ruh Sağlığı Ulusal sağlığı Enstitüleri çeşitlilik Supplement R01MH111773 yanı sıra T32 eğitim hibe T32NS007431-20 altında tarafından desteklenmektedir. Bu proje NıH (MH111773, AG058160 ve NS104530) dan js verilen hibe desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 Kuyulu PlakaThermo Fisher Scientific07-200-84
48 Kuyulu PlakaDenville ScientificT1049
5-Etinil-2'-deoksiuridin (Edu)KarbosynthNE08701
Alkol %70 İzopropilThermo Fisher Scientific64-17-5
Alkol Hazırlama PedleriThermo Fisher Scientific13-680-63
Alexa-488 AzideThermo Fisher ScientificA10266
Anti-Tavuk Nestin AvesNES; RRID: AB_2314882
Keçi Karşıtı DCXSanta CruzKedisi # SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Fare Tbr2Thermo Fisher Scientific14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Çözeltisi (povidon-iyot)Amazon
Sitirik Asit Stoku [.1M] Sitrik Asit (21g/L sitrik asit)Sigma-Aldrich251275
Klozapin N-OksitSigma-AldrichC08352-5MG
Konfokal Yazılım (Zen Siyahı)Zeiss MikroskobuZen 2.3 SP1 FP1 (siyah)
Bakır (II) Sülfat PentahidratThermo Fisher ScientificAC197722500
Pamuklu ÇubuklarAmazon
LamelDenville ScientificM1100-02
Hassas Görev Mendili KimwipesKimtech Science7557
Matkap Ucu 0,5 mmİnce Bilim Araçları19007-05
Etilen GlikolThermo Fisher ScientificE178-1
Hamilton İğne 2 inçHmailton Company7803-05
Hamilton Şırınga 5 & L Model 75 RNHmailton ŞirketiRef: 87931
Yüksek Hızlı MatkapForedom1474
İnfüzyon PompasıHarvard Aparatı70-4511
Enjekte Edilebilir Salin ÇözeltisiMountainside Health CareNDC 0409-4888-20
İnsülin ŞırıngasıBD Ultra İnce İnsülin Şırıngaları
İzofluranHenry Schein29405
Küçük Hayvan İçin StereotaxKOPF Aletleri Model942
Leica M80Leica
Leica MikrotomLeicaSM2010 R
LSM 780Zeiss Mikroskopi
Nair (Epilasyon Ürünü)Nair
Paraformaldahyde %4Sigma-Aldrich
Plus Şarjlı SlaytDenville ScientificM1021
Fosfat Tamponlu Çözelti (PBS)Thermo Fisher Scientific10010031
Puralube Veteriner MerhemPuralube
Slayt Rafı 20 slayt ünitesiElektron Mikroskobu Bilimi70312-24
Sürgülü Raf tutucuElektron Mikroskobu Bilimi70312-25
Küçük Hayvan Isıtma YastığıK & H
SükrozSigma-AldrichS0389
Süper PAP Kalem 4 mm uçluPolySciences24230
Cerrahi NeşterMedPride47121
Tris Tamponlu Çözelti (TBS)Sigma-AldrichT5912
Tri-sodyum sitrat Stoku [0.1 M] Tri-sodyum Sitrat (29.4g/L tri-sodyum sitrat)Sigma-AldrichC8532
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
CımbızAmazon
Vet Bond Doku Yapıştırıcısı3M1469SB
158127

Kaynaklar

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
  4. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
  5. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
  6. Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1(2018).
  7. Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
  8. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
  9. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
  10. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  13. Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
  16. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
  17. Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  18. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
  20. Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
  21. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  22. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  23. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
  24. Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Yetişkin NörojeneziNöral Kök HücrelerDREADD TeknolojisiStereotaksik EnjeksiyonKemogenetik StimülasyonTimidin Analoğuİmmünofloresan EtiketlemeKonfokal GörüntülemeAntijen Geri KazanımıMossy Hücreler
Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.