Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Özet

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Özet

HiPSC türetilmiş hücre kullanımı insan nörodejeneratif hastalıkları eğitim için değerli bir yaklaşım temsil eder. Burada, Alfa-synuclein gen (SNCA) locus triplication içine Parkinson hastalığı (PD) ile bir hastadan elde edilen hiPSCs farklılaşma için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklamak-ilgili dopaminerjik nöron popülasyonları. Kanıt biriken SNCA yüksek düzeyde PD. yeni tedavi yaklaşımları PD için özellikle de SNCA ifade, Yönetmeliği hedeflemesi kurmak için karşılanmamış ihtiyaç tanımayı geliştirme için sorumlu olduğunu göstermiştir biz Son zamanlarda epigenetically SNCA intron 1 Düzenleyici bölgesi düzeylerinde metilasyonu zenginleştirici tarafından SNCA transkripsiyon modüle bir CRISPR/dCas9-DNA metilasyon-tabanlı sistem geliştiriyoruz. Bir ölü oluşan sistem, teslim etmek (devre dışı) yorum-in Cas9 (dCas9) erimiş DNA metiltransferaz enzim 3A katalitik etki alanı ile (DNMT3A), lentiviral bir vektör kullanılır. Bu sistem ile SNCA locus triplication hücrelere uygulanmış ve SNCA intron 1 hedeflenen DNA metilasyonu ile yaklaşık % 30 SNCA-mRNA ve protein düzeyleri azaltır. SNCA düzeyleri ince ayar downregülasyon hücresel fenotipleri hastalığı ile ilgili kurtarır. Geçerli protokol, amacımız hiPSCs nöral progenitör hücre (NPCs) ve kuruluş ve pyrosequencing deneyleri SNCA metilasyonu profilinde değerlendirilmesi için doğrulama differentiating için adım adım bir yordam tarif etmek intron 1. Daha ayrıntılı olarak bu deneylerde kullanılan lentivirus-CRISPR/dCas9 sistemi seviyelendirmek için bu iletişim kuralını üretmek için arındırmak ve lentiviral vektörler konsantre ve kullanarak epigenome ve genom düzenleme uygulamaları için uygunluk vurgulamak için açıklar hiPSCs ve NPCs. Kolayca uyarlanabilir ve yüksek titresi lentiviruses tüp bebek ve içinde vivo uygulamaları için üretmek için kullanılan iletişim kuralı.

Giriş

Birden çok platform epigenome düzenleme son zamanlarda herhangi bir DNA dizileri gene expression^1,2kontrol bölgeleri hedeflemek için geliştirilmiştir. Oluşturulan epigenome düzenleme araçları (i) transkripsiyon düzenleyen, (II) alter ardından Histon değişiklikler, (III) DNA metilasyonu değiştirmek ve (iv) düzenleyici öğe etkileşimleri modüle için tasarlanmıştır. Devre dışı bırakılan bir (ölü) Cas9 için transkripsiyon/Kromatin değiştiriciler tutturmak yaklaşım (dCas9) yükseltilmiş üzerinden daha önce çinko gibi epigenome düzenleme Gelişmiş platformlar parmak proteinleri (ZFPs) ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi effectors (hikayeler), güçlü transkripsiyon efektör etki alanı barındıran (ED) tasarlanmış DNA'ya bağlanıcı etki alanına (DBD)³erimiş. Etkinleştirme veya baskı gibi istenen fenotip sonucunu endojen loci (şekil 1) demirlemiş efektör molekül tarafından tanımlanır. Programlanabilir transkripsiyon aktivatörleri oluşturmak için dCas9/gRNA modülleri VP16^4,5,-⁶ (şekil 1A), Pol II ve genel transkripsiyon makine acemi bir viral harekete geçirmek etki alanına bağlıdır. Bu sistem modifikasyonu bile daha sağlam bir etkinleştirme oranı^5,6sağlayan VP64, bir tetramer VP16 alanlarının yer verdi. Sistem başarıyla rehberleri ve onların düzenleyici elemanlarının hedefleyerek kodlama ve kodlamayan bölgeler etkinleştirmek için istihdam edilmiştir. VP64 molekülleri doğrudan hedef bölge Kromatin yapısında değişiklik yapmayın olsa bile, önemlisi, H3/H4 asetilasyon ve H3-K4 di da dahil olmak üzere etkin (euchromatin) işaretleri birikimi içinde sonuçları bağlama Kromatin değiştiriciler acemi / Tri-metilasyonu^5,6. VP64 ek olarak, insan NF-κB kompleks p65 alt birim için dCas9/gRNA modül⁷gergin. İlginçtir, bu effectors bölgelere akıntıya karşı transkripsiyon başlangıç siteleri (TSSs) ve rehberleri içinde hayvan zinciri bir güçlü gen indüksiyon sonuçlanır. Yine de, VP64 ve p65 effectors da activatory etkileri uygulamayın aşağı TSSs ve distal arttırıcılar^7,8bulunan bölgelere bağlı iken. Daha sağlam bir transkripsiyon yanıt temin için birden çok dCas9-VP64 veya dCas9-p65 füzyon bir tek hedef locus^9,10' a işe gerekir. Bu nedenle, birden çok efektör etki alanı SunTag gibi bir tek dCas9-gRNA kompleksi tarafından işe yeni nesil harekete geçirmek son gelişmeler bir daha güçlü harekete geçirmek yetenek dCas9-VP64 füzyon karşılıkları¹¹ ' e karşılaştırarak sonuçlandı ^{, 12}. geliştirilmiş bir transkripsiyon etkinleştirme VP64, p65 ve Rta (VPR), C-terminus dCas9¹³ (şekil 1A) için gama-herpesviruses, bir transactivation etki alanı füzyon yoluyla elde etti. Benzer CRISPR/dCas9 sistemleri hedef özel baskı (şekil 1B) için geliştirilmiştir.

Endojen gen baskı mühendislik önleyici füzyon ile çeşitli mekanizmalar (şekil 1B) elde edilebilir. CRISPR/dCas9 sistemleri, önleyici DBD (bile olmadan bir efektör etki alanı/sn), bağlantılı verimli bir organizatörü veya akış yukarı/aşağı-TSS bölgeleri^3,-^{6 gergin iken gen ekspresyonu sessizlik gösterilmiştir ,14}. Transkripsiyon üzerindeki etkileri transkripsiyon faktörü bağlama ve RNA polimeraz işleme steric girişim tarafından neden oldu. Yine de, daha kapsamlı yaklaşımlar gerekli, steric engel yalnız gen baskı kez sağlam susturmak için yeterli değil gibi. Susturucular yeni nesil son geliştirme tabanlı transkripsiyon önleyici etki alanları (TRDs), Histon değiştiriciler taşıyan CRISPR/dCas9 sistemler üzerinde (H3-K9 di-/ tri-metilasyonu, H3-K27 di-/ tri-metilasyonu; H3-K36 di-/ tri-metilasyonu, H3/H4 deasetilasyonu) ve etkileri^{4,5,15,16, susturmak daha sağlam izin epigenetik araçlar inşaat için liderliğindeki (KSY) DNA metilasyonu 17,18,19,20}. Bu epigenetik değiştiricileri için DNA alımı genellikle bir daha güçlü silencing sonucu^21,22oluşturmak daha fazla kapalı ve yoğun Kromatin oluşumu için neden olabilir kanıtlanmıştır. DBDs ile kullanılan en yaygın silencing etki alanını Krüppel ilişkili kutusu (KRAB)^4,5' tir. Faktör alımı Kromatin değişikliklerle karşılık göstermiştir; Bununla birlikte, bu değişiklikler mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır^16,17,18olmak vardır. Son zamanlarda, bu KRAB DNA için yerelleştirme Histon metiltransferaz SETDB1 ve Histon deasetilasyonu (HDAC) NuRD kompleksleri, bu etkileşimler oluşumuna aracılık olasılığını ima kurul yükseltebilirsiniz gösterilmiştir Kromatin yoğunlaşma ve transkripsiyon susturmak^3,13. Alternatif bir yaklaşım efektör etki alanları DBDs için özel bir epigenetik silencing protein oluşturmak için erimiş. Bu sistem doğrudan baskıcı DNA işaretleri veya Histon değişiklikler tromboksan.

DNMT3A enzim kaşif Balonlu keşif sentetik CRISPR/dCas9 sistemlerinin kullanımı son zamanlarda, transkripsiyon deaktivasyon için repurposed. DNMT3A endojen gen rehberleri ve diğer düzenleyici bölgeleri (şekil 1B)^18,20heterochromatin oluşumu boyunca transkripsiyon baskı giderek artan DNA metilasyonu tromboksan. McDonald et al.¹⁸ ve Vojta vd.²⁰ DNA metilasyonu epigenome-gen susturmak veya baskı, plazmid teslim dCas9-DNMT3A fusion sistemi kuvvetli artırabilir gösteren için kullanılabilir rapor için ilk yazarlar vardı sitozin metilasyonu TSS^18,20civarında. McDonald ve iş arkadaşlarınızın istihdam stratejisinin önemli bir azalma (yaklaşık % 40) neden olabilir gösterdi bir Tümör baskılayıcı gen CDKN2A mRNA¹⁸düzeyleri. Benzer şekilde, BACH veya IL6ST genlerin bazlar organizatörü bölge hedefleme gen ifade²⁰iki kat azalma ile ilişkili artan CpG metilasyonu gösterir. Laboratuarımızın son zamanlarda SNCA overexpression (Şekil 2)²³patolojik sonuçlar inceltiyorum için DNA metilasyonu kullanımı repurposed. Daha önce hypomethylated PD ve demans Lewy organları (DLB) beyin^{24,25olduğu bildirilen gibi strateji DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölgede seçici geliştirme dayanır, 26}. Bu hypomethylation SNCA overexpression, böylece terapötik müdahale^24,27,28için cazip bir hedef sunan bağlı. Biz son zamanlarda SNCA intron 1 hiPSC kaynaklı dopaminerjik NPCs bölgede bir PD hasta SNCA triplication²³ile elde edilen DNA metilasyonu düşük düzeyde gösterdi. Bu deneysel model NPCs sağlam kültüründe yayılır veya daha fazla olgun nöronların hücresel fenotipleri oksidatif dahil olmak üzere, arabuluculuk genetik faktörlerin tanımlamak etkili bir tarama etkinleştirme ayrıştırılan avantajdır stres ve Apoptozis²⁹. Ayrıca, bu modeli sistem belirti başlangıçlı hastalarda önce gelişim olayları özetlemek bilim adamları sağlar. Buna ek olarak, hiPSC elde edilen NPCs gen ekspresyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler yollar test etmek için harika bir araç temsil eder. Önemlisi, state-of--art CRISPR/Cas9-epigenome teknoloji ile birlikte hiPSC elde edilen NPCs büyük ölçüde ilaçların"yeni nesil" pek çok nörodejeneratif hastalıklar için geliştirme kolaylaştırabilir.

Biz son zamanlarda bir dCas9-DNMT3A füzyon proteini ve gRNA için özel olarak hedef CpG metilasyonu SNCA intron 1 (şekil 2A) içinde taşıyan lentivirus tabanlı bir sistemin SNCA ifade patolojik düzeyde azaltmak için geliştirilen²³. Bu iletişim kuralı lentiviral vektör (LV) tasarım ve üretim ayrıntılı olarak açıklanmıştır. CRISPR/dCas9 bileşenleri çeşitli nedenlerden ötürü teslim etmek için etkili bir yol LVs temsil, yani hantal DNA yürütmek için (i) kendi kapasitesi ekler, hücre bölünmesi ve nondividing hücreleri^{30 da dahil olmak üzere, geniş bir transducing (II) bir yüksek verimlilik} ve (iii) yeteneklerini en az sitotoksik ve immünojenik yanıt-e doğru uyarmak için. Son zamanlarda, LV sistem SNCA locus triplication ile bir hastadan hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron için uygulanan ve LVs tedavi potansiyelini'dır epigenome düzenleme gösterdi metilasyonu²³ ( araçları Şekil 2B). Gerçekten de, bir LV-gRNA/dCas9-DNMT3A sistemi DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölge, önemli bir artış neden olur. Bu artış SNCA mRNA ve protein²³düzeyde azalma ile karşılık gelir. Ayrıca, SNCA downregülasyon PD ile ilgili fenotipleri SNCA triplication/hiPSC-türetilmiş dopaminerjik nöron (örneğin, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı)²³yılında kurtarır. Önemlisi, biz gösterdi SNCA ifade LV-gRNA-dCas9-DMNT3A sistem tarafından azalma hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron taşıyan bir PD hastadan için karakteristik olan fenotipleri geri yeteneğine SNCA triplication, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı²³gibi. Bu iletişim kuralı 1) üretim Protokolü ve konsantrasyon viral hazırlıklar yüksek tittered oluşturmak için en iyi duruma getirilmiş bir LV platformu belirlemenizi ve 2) hiPSCs farklılaşma olgun dopaminerjik olmak için desenli NPCs içine açıklamak için hedeftir nöronlar^31,32 ve SNCA intron 1 hedeflenen bölgeye metilasyon düzeyi karakterizasyonu.

Lentiviral platformlar eski büyük genetik ekler^33,34uyum yeteneği olan yani adeno ilişkili vektörel çizimler (AAVs), en popüler vektör platformu üzerinde büyük bir avantaj var. AAVs önemli ölçüde daha yüksek verim-ebilmek var olmak oluşturmak ama düşük paketleme kapasitesine sahip (< 4,8 kb), All-In-one CRISPR/Cas9 sistemleri sunmak için bunların kullanımı ödün. Böylece, görünüşe göre LVs platformu-in-seçimi CRISPR/dCas9 araçların teslimi ilgili uygulamalarda olurdu. Bu nedenle, burada özetlenen Protokolü hücre ve organların epigenome düzenleme bileşenleri etkin bir şekilde teslim etmek isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olacak. Daha fazla iletişim kuralı vektörel çizimler vektör ifade kaset^30,35içindeki öğeler CIS içinde bir değişiklik ile üretim ve ifade yeteneklerini artırmak için strateji özetliyor. Strateji dayanır romanından sistem geliştirdi ve bizim laboratuarımızda okudu ve 10¹⁰ viral adet (VU) /mL^30,35aralığında viral parçacıkların üretmek için onun yetenek vurgulamaktadır.

Protokol

1. sistem tasarımı ve virüs üretim

1. Plazmid tasarım ve İnşaat
   Not: Bir all-in-one LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektörü inşaatı bir üretim kullanarak gerçekleştirilen- ve ifadesi en iyi şekilde ifade kaset Ortinski vd³⁰tarafından yayınlandı. Vektör kaset transkripsiyon faktörü Sp1 ve state-of--art silme Çevrilmeyen içinde tanıma sitenin tekrarı taşır (U3') bölge bir 3' uzunluğundaki terminal tekrar (LTR) (şekil 2A)^30,36. Vektör omurga CRISPR/Cas9^30,35ifade etme ve teslim içinde etkili olduğu tespit edilmiştir.
   1. SpCas9 devre dışı bırak (ölü) sürümünü edinmek (dCas9) üzerinden site yönettiği mutagenesis (veri gösterilmez). Katalitik etki alanı HNH ve RuvC D10A ve H840A mutasyonların enzim, sırasıyla, AgeI-BamHI parçaları (şekil 3) alışverişi tarafından pBK301²⁹ aktif Cas9 ile yataklık klon değiştirin.
   2. DNMT3A katalitik etki alanı pdCas9-DNMT3A-eGFP türetmek ( Tablo malzemelerigörmek) DNMT3A yükseltecek tarafından BamHI-429/R 5 '- GAGCGGATCCCCCTCCCG - 3' BamHI-429/L 5' - CTCTCCACTGCCGGATCCGG - 3' (şekil 3) bölümü. DNMT3A içeren bölge yükseltmek için aşağıdaki koşullar kullanın: (1) 95 ° C 60 s, (2) 95 ° C 10 s, (3) 60 ° C 20 s, (4) 68 ° C 60 s. tekrar koşulları 2-4 30 x için. Son uzantısı 68 ° C 3 dakikadır kullanın ve 4 ° C. tutun
   3. DCas9 taşıyan değiştirilmiş pBK301 vektör BamHI siteye BamHI restriksiyon enzimi tarafından sindirilmiş DNMT3A parçası klon. Doğrudan Sanger tarafından klonlama doğrulayın sıralama. Neden plazmid dCas9-DNMT3A-p2a-puromisindir transgene limanlar unutmayın. Plazmid gRNA iskele insan U6 organizatörü (şekil 3) üzerinden ifade eder.
   4. Puromisindir muhabir gen yeşil flüoresan protein (dCas9-DNMT3A-p2a-GFP oluşturmak için GFP) ile değiştirin. FseI ile dCas9-DNMT3A-p2a-Puro plazmid sindirmek. Bir jel arıtma yöntemi kullanarak vektör parçası arındırmak. PBK201a sindirerek tarafından INSERT hazırlamak (pLenti-GFP) ile FseI. FseI parçası vektör kopyalayın. Neden plazmid pBK539 dCas9-DNMT3A-p2a-GFP transgene (şekil 3) liman.
2. HEK-293T hücre kültürü çalışmalarının ve hücreler transfection için kaplama
   Not: İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK-293T) hücreler kültürlü tam yüksek-glikoz Dulbecco kartal orta değiştiren'ın (DMEM; % 10 inek buzağı serum, 1 x antibiyotik antimycotic, 1 x sodyum pyruvate, 1 x önemli olmayan amino asit, 2 mM L-glutamin) % 5 ile 37 ° C'de CO ₂. protokol tekrarlanabilirlik için bu farklı bir çok/toplu işlemine geçiş yaparken buzağı serum test etmek için tavsiye edilir. Altı 15 cm kadar tabak lentiviral üretim için ihtiyaç vardır.
4. 1. 
      
5. 
   
   3. 
      
   7. 
      
6. 
   
7. 5. 
      
      
      
      
      
      
8. 
   
   5. 
      
      
      
      
      
      
      

1. 
   
2. 
   
   21. 
       
       
   23. 
       
   27. 
       
   35. 
       

Sonuçlar

Üretim titreleri saf GFP Özgününü karşılaştırıldığında LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektörlerin doğrulama

P24^gag ELISA LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro fiziksel titreleri saf GFP/Puro meslektaşları ile arasında karşılaştırmak için gerçekleştirilen. Temsilcisi sonuçları şekil 5A', sunulan, burada özetlenen, iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan Vektörler, fiziksel verimi karşılaştı...

Tartışma

LVs epigenome düzenleme, özellikle genetik hastalıklar bağlamında için Seçim aracı olarak ortaya çıkmaya başladık, (i) karşılamak için esas olarak yeteneklerini nedeniyle büyük DNA payloads ve (ii) bölme geniş bir yelpazesi verimli bir şekilde transduce ve nondividing hücreleri. LVs büyük ambalaj etkinliğinin ambalaj büyük boyutlu CRISPR/dCas9 sistemleri içeren uygulamalar için özellikle yararlıdır. Bu açıdan bakıldığında, LVs platformu-in-seçim tüm-içinde-bir CRISPR/Cas9 sistemleri teslim etmek için temsil eder. Nitekim...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ekipman
Optima XPN-80 Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	A99839
0.22 &; M filtre ünitesi, 1 L	Corning	430513
0,45-μ m filtre ünitesi, 500 mL	Corning	430773
100 mm TC ile İşlem Görmüş Kültür Kabı	Corning	430167
15 mL konik santrifüj tüpleri	Corning	430791
150 mm TC ile İşlem Görmüş Hücre Kültürü kapları, 20 mm Izgaralı	Corning 353025
50 mL konik santrifüj tüpleri	Corning	430291
6 oyuklu plakalar	Corning	3516
Aggrewell 800	Kök Hücre Teknolojileri	34811
Allegra 25R masa üstü santrifüj	Beckman Coulter	369434
BD FACS	Becton Dickinson	338960
Konik tabanlı ultrasantrifüj tüpleri	Seton Scientific	5067
Konik boru adaptörleri	Seton Scientific	PN 4230
Eppendorf Hücre Görüntüleme Slaytları	Eppendorf	30742060
Yüksek bağlayıcı 96 oyuklu plakalar	Corning	3366
Ters floresan mikroskobu	Leica	DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kiti (50)	Qiagen	27104
Tersinir Süzgeç	Kök Hücre Teknolojileri	27215
SW32Ti rotor	Beckman Coulter	369650
VWR® Tek Kullanımlık Serolojik Pipetler, Cam, Pirojenik Olmayan	VWR	93000-694
VWR® Vakum Filtrasyon Sistemleri	VWR	89220-694
xMark™ Mikroplaka Absorbans plaka okuyucu	Bio-Rad	1681150
İsim	Company	Katalog Numarası<	strong>Yorumlar
Hücre kültürü reaktifleri
İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK 293T) hücreleri	ATCC	CRL-3216
Accutase	StemCell Teknolojileri	7920
Yapışma Önleyici Durulama	Solüsyonu Kök Hücre Teknolojileri	7010
Anti-FOXA2 Antikoru	Abcam	Ab60721
Anti-Nestin Antikoru	Abcam	Ab18102
Antibiyotik-antimikotik solüsyon, 100x	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini	Thermo Fisher Scientific	12587010
BES	Sigma Aldrich	B9879 - BES
Sığır Albümin Fraksiyonu V (%7,5 çözelti)	Thermo Fisher Scientific	15260037
CHIR99021	Kök Hücre Teknolojileri	72052
Corning Matrigel hESC-Nitelikli	Matris Corning	08-774-552
Kozmik Buzağı Serumu	Hiklonu	SH30087.04
DMEM-F12	Lonza	12-719
DMEM, yüksek glikozlu ortam	Gibco	11965
DNeasy Kan & Doku Kiti	Qiagen	69504
EpiTect PCR Kontrol DNA Seti	Qiagen	596945
EZ DNA Metilasyon Kiti	Zymo Research	D5001
Jelatin	Sigma Aldrich	G1800-100G
Gentamisin	Thermo Fisher Bilimsel	15750078
Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi	kök Hücre Teknolojileri	7174
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
İnsan Rekombinant bFGF	Kök Hücre Teknolojileri	78003
İnsan Rekombinantı  EGF	Kök Hücre Teknolojileri	78006
İnsan Rekombinant Shh (C24II)	Kök Hücre Teknolojileri	78065
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
mTeSR1	Kök Hücre Teknolojileri	85850
N-2 Takviyesi (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Nörobazal Orta	Thermo Fisher Scientific	21103049
Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA)	Hyclone	SH30087.04
PyroMark PCR Kiti	Qiagen	978703
RPMI 1640 ortamı	Thermo Fisher Scientific	11875-085
SB431542	Kök Hücre Teknolojileri	72232
Sodyum piruvat	Sigma	Aldrich S8636-100ML
Kök Farkı  Nöral İndüksiyon Ortamı	Kök Hücre Teknolojileri	5835
STEMdiff Nöral Progenitör Dondurma Ortamı	Kök Hücre Teknolojileri	5838
TaqMan Testi FOXA2	Thermo Fisher Bilimsel	Hs00232764
TaqMan Testi GAPDH	Thermo Fisher Bilimsel	Hs99999905
TaqMan Testi Nestin	Thermo Fisher Bilimsel	Hs04187831
TaqMan Testi OCT4	Thermo Fisher Scientific	Hs04260367
TaqMan Testi PPIA	Thermo Fisher Scientific	Hs99999904
Tripsin-EDTA %0.05	Gibco	25300054
Y27632	Kök Hücre Teknolojileri	72302
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
p24 ELISA reaktifleri
Monoklonal anti-p24 antikoru	NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı	3537
Keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz IgG	Sigma Aldrich	12-348	Çalışma konsantrasyonu 1:1500
Keçi serumu, Steril, 10 mL	Sigma	G9023	Çalışma konsantrasyonu 1:1000
HIV-1 standartları	NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı	SP968F
Normal fare serumu, Steril, 500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Poliklonal tavşan anti-p24 antikoru	NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı	SP451T
TMB peroksidaz substrat	KPL	5120-0076	Çalışma konsantrasyonu 1: 10.000
< güçlü > İsim< / güçlü >	< güçlü > Şirket< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / strong>	Yorumlar< / strong>
< u > Plazmidler< / u>< / em >
pMD2.G	Addgene	12253
pRSV-Rev	Addgene	52961
psPAX2	Addgene	12259
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Restriksiyon enzimleri
BsmBI	New England Biolabs	R0580S
BsrGI	New England Biolabs	R0575S
EcoRV	New England Biolabs	R0195S
KpnI	New England Biolabs	R0142S
PacI	New England Biolabs	R0547S
SphI	New England Biolabs	R0182S