DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen
Bu makalede
Özet
Özet
HiPSC türetilmiş hücre kullanımı insan nörodejeneratif hastalıkları eğitim için değerli bir yaklaşım temsil eder. Burada, Alfa-synuclein gen (SNCA) locus triplication içine Parkinson hastalığı (PD) ile bir hastadan elde edilen hiPSCs farklılaşma için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklamak-ilgili dopaminerjik nöron popülasyonları. Kanıt biriken SNCA yüksek düzeyde PD. yeni tedavi yaklaşımları PD için özellikle de SNCA ifade, Yönetmeliği hedeflemesi kurmak için karşılanmamış ihtiyaç tanımayı geliştirme için sorumlu olduğunu göstermiştir biz Son zamanlarda epigenetically SNCA intron 1 Düzenleyici bölgesi düzeylerinde metilasyonu zenginleştirici tarafından SNCA transkripsiyon modüle bir CRISPR/dCas9-DNA metilasyon-tabanlı sistem geliştiriyoruz. Bir ölü oluşan sistem, teslim etmek (devre dışı) yorum-in Cas9 (dCas9) erimiş DNA metiltransferaz enzim 3A katalitik etki alanı ile (DNMT3A), lentiviral bir vektör kullanılır. Bu sistem ile SNCA locus triplication hücrelere uygulanmış ve SNCA intron 1 hedeflenen DNA metilasyonu ile yaklaşık % 30 SNCA-mRNA ve protein düzeyleri azaltır. SNCA düzeyleri ince ayar downregülasyon hücresel fenotipleri hastalığı ile ilgili kurtarır. Geçerli protokol, amacımız hiPSCs nöral progenitör hücre (NPCs) ve kuruluş ve pyrosequencing deneyleri SNCA metilasyonu profilinde değerlendirilmesi için doğrulama differentiating için adım adım bir yordam tarif etmek intron 1. Daha ayrıntılı olarak bu deneylerde kullanılan lentivirus-CRISPR/dCas9 sistemi seviyelendirmek için bu iletişim kuralını üretmek için arındırmak ve lentiviral vektörler konsantre ve kullanarak epigenome ve genom düzenleme uygulamaları için uygunluk vurgulamak için açıklar hiPSCs ve NPCs. Kolayca uyarlanabilir ve yüksek titresi lentiviruses tüp bebek ve içinde vivo uygulamaları için üretmek için kullanılan iletişim kuralı.
Giriş
Birden çok platform epigenome düzenleme son zamanlarda herhangi bir DNA dizileri gene expression1,2kontrol bölgeleri hedeflemek için geliştirilmiştir. Oluşturulan epigenome düzenleme araçları (i) transkripsiyon düzenleyen, (II) alter ardından Histon değişiklikler, (III) DNA metilasyonu değiştirmek ve (iv) düzenleyici öğe etkileşimleri modüle için tasarlanmıştır. Devre dışı bırakılan bir (ölü) Cas9 için transkripsiyon/Kromatin değiştiriciler tutturmak yaklaşım (dCas9) yükseltilmiş üzerinden daha önce çinko gibi epigenome düzenleme Gelişmiş platformlar parmak proteinleri (ZFPs) ve transkripsiyon harekete geçirme....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. sistem tasarımı ve virüs üretim
- Plazmid tasarım ve İnşaat
Not: Bir all-in-one LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektörü inşaatı bir üretim kullanarak gerçekleştirilen- ve ifadesi en iyi şekilde ifade kaset Ortinski vd30tarafından yayınlandı. Vektör kaset transkripsiyon faktörü Sp1 ve state-of--art silme Çevrilmeyen içinde tanıma sitenin tekrarı taşır (U3') bölge bir 3' uzunluğundaki terminal tekrar (LTR) (şekil 2A)30,36. Vektör omurga CRISPR/Cas930,35ifade etme v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Üretim titreleri saf GFP Özgününü karşılaştırıldığında LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektörlerin doğrulama
P24gag ELISA LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro fiziksel titreleri saf GFP/Puro meslektaşları ile arasında karşılaştırmak için gerçekleştirilen. Temsilcisi sonuçları şekil 5A', sunulan, burada özetlenen, iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan Vektörler, fiziksel verimi karşılaştı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
LVs epigenome düzenleme, özellikle genetik hastalıklar bağlamında için Seçim aracı olarak ortaya çıkmaya başladık, (i) karşılamak için esas olarak yeteneklerini nedeniyle büyük DNA payloads ve (ii) bölme geniş bir yelpazesi verimli bir şekilde transduce ve nondividing hücreleri. LVs büyük ambalaj etkinliğinin ambalaj büyük boyutlu CRISPR/dCas9 sistemleri içeren uygulamalar için özellikle yararlıdır. Bu açıdan bakıldığında, LVs platformu-in-seçim tüm-içinde-bir CRISPR/Cas9 sistemleri teslim etmek için temsil eder. Nitekim.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Duke Üniversitesi, bu çalışma için ilgili geçici bir patent başvurusunda.
Teşekkürler
Bu eser kısmen Kahn NÖROTEKNOLOJİ geliştirme Ödülü (OC) ve ulusal kurumları, sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar ve kontur (NIH/NINDS) tarafından finanse edildi (R01 NS085011 O.C. için).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman | |||
| Optima XPN-80 Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 &; M filtre ünitesi, 1 L | Corning | 430513 | |
| 0,45-μ m filtre ünitesi, 500 mL | Corning | 430773 | |
| 100 mm TC ile İşlem Görmüş Kültür Kabı | Corning | 430167 | |
| 15 mL konik santrifüj tüpleri | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC ile İşlem Görmüş Hücre Kültürü kapları, 20 mm Izgaralı | Corning 353025 | ||
| 50 mL konik santrifüj tüpleri | Corning | 430291 | |
| 6 oyuklu plakalar | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | Kök Hücre Teknolojileri | 34811 | |
| Allegra 25R masa üstü santrifüj | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Konik tabanlı ultrasantrifüj tüpleri | Seton Scientific | 5067 | |
| Konik boru adaptörleri | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Hücre Görüntüleme Slaytları | Eppendorf | 30742060 | |
| Yüksek bağlayıcı 96 oyuklu plakalar | Corning | 3366 | |
| Ters floresan mikroskobu | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti (50) | Qiagen | 27104 | |
| Tersinir Süzgeç | Kök Hücre Teknolojileri | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Tek Kullanımlık Serolojik Pipetler, Cam, Pirojenik Olmayan | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vakum Filtrasyon Sistemleri | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Mikroplaka Absorbans plaka okuyucu | Bio-Rad | 1681150 | |
| İsim | Company | Katalog Numarası< | strong>Yorumlar |
| Hücre kültürü reaktifleri | |||
| İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK 293T) hücreleri | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Teknolojileri | 7920 | |
| Yapışma Önleyici Durulama | Solüsyonu Kök Hücre Teknolojileri | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antikoru | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antikoru | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiyotik-antimikotik solüsyon, 100x | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Sığır Albümin Fraksiyonu V (%7,5 çözelti) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | Kök Hücre Teknolojileri | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Nitelikli | Matris Corning | 08-774-552 | |
| Kozmik Buzağı Serumu | Hiklonu | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, yüksek glikozlu ortam | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Kan & Doku Kiti | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Kontrol DNA Seti | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Metilasyon Kiti | Zymo Research | D5001 | |
| Jelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamisin | Thermo Fisher Bilimsel | 15750078 | |
| Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi | kök Hücre Teknolojileri | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| İnsan Rekombinant bFGF | Kök Hücre Teknolojileri | 78003 | |
| İnsan Rekombinantı EGF | Kök Hücre Teknolojileri | 78006 | |
| İnsan Rekombinant Shh (C24II) | Kök Hücre Teknolojileri | 78065 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | Kök Hücre Teknolojileri | 85850 | |
| N-2 Takviyesi (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Nörobazal Orta | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kiti | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 ortamı | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | Kök Hücre Teknolojileri | 72232 | |
| Sodyum piruvat | Sigma | Aldrich S8636-100ML | |
| Kök Farkı Nöral İndüksiyon Ortamı | Kök Hücre Teknolojileri | 5835 | |
| STEMdiff Nöral Progenitör Dondurma Ortamı | Kök Hücre Teknolojileri | 5838 | |
| TaqMan Testi FOXA2 | Thermo Fisher Bilimsel | Hs00232764 | |
| TaqMan Testi GAPDH | Thermo Fisher Bilimsel | Hs99999905 | |
| TaqMan Testi Nestin | Thermo Fisher Bilimsel | Hs04187831 | |
| TaqMan Testi OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Testi PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Tripsin-EDTA %0.05 | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | Kök Hücre Teknolojileri | 72302 | |
| Name | Company | Katalog Numarası | Comments |
| p24 ELISA reaktifleri | |||
| Monoklonal anti-p24 antikoru | NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı | 3537 | |
| Keçi anti-tavşan yaban turpu peroksidaz IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Çalışma konsantrasyonu 1:1500 |
| Keçi serumu, Steril, 10 mL | Sigma | G9023 | Çalışma konsantrasyonu 1:1000 |
| HIV-1 standartları | NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı | SP968F | |
| Normal fare serumu, Steril, 500 mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Poliklonal tavşan anti-p24 antikoru | NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı | SP451T | |
| TMB peroksidaz substrat | KPL | 5120-0076 | Çalışma konsantrasyonu 1: 10.000 |
| < güçlü > İsim< / güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Katalog Numarası< / strong> | Yorumlar< / strong> |
| < u > Plazmidler< / u>< / em > | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Katalog Numarası | Comments |
| Restriksiyon enzimleri | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Kaynaklar
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
