Yöntem makalesi

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 Mart 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörovasküler birimi (NVU) mikrovasküler endotel hücrelerinin kan - beyin bariyerini (BBB), bir endotel membran ile katıştırılmış perisitlerden, şekillendirme oluşmaktadır ve glia limitans parenkima membran ve astrositik oluşur son-besleme merkezi sinir sistemi (MSS) yüzdeki abluminal yönünü kucaklayan. CNS sürdürmenin yanı sıra homeostazı NVU bağışıklık hücre MSS kaçakçılığı kontrol eder. MSS immunosurveillance sırasında aktive lenfositler az sayıda BBB disfonksiyon ya da klinik hastalığı neden olmadan endotel bariyer geçebilir. Buna ek olarak, multipl skleroz veya hayvan onun modeli gibi neuroinflammation sırasında deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) çok sayıda bağışıklık hücreleri BBB ve daha sonra sonunda CNS parankimi ulaşan glia limitans geçebilir Klinik hastalık için önde gelen. Bağışıklık hücre göç CNS parankimi içine böylece ayrı moleküler mekanizmaları istihdam NVU endotel ve gliyal bariyer arasında sıralı bir geçiş içeren bir işlemdir. Endotel bariyer arasında geçiş takip, T hücreleri kendi yerel etkinleştirme başlatmak sonraki mekanizmaları jelatinin, Fokal harekete geçirmek için önde gelen Perivasküler antijen sunan hücreler üzerinde onların soydaş antijen karşılaşmak hangi gliyal bariyer çapraz ve CNS parankimi girmek T hücreleri sağlayacaktır. Böylece, hem, BBB geçirgenliği ve MMP aktivite sırasında EAE MSS bağışıklık hücre birikimi için mekansal ilişki içinde değerlendirilmesi NVU endotel ve gliyal engelleri bütünlüğünü kaybı belirtmenizi sağlar. Biz burada EAE C57BL/6 fareler tarafından Aktif bağışıklama ikna etmek ve daha sonra analiz BBB geçirgenliği içinde vivo eksojen floresan tarayıcıları kullanarak gösterir. Biz daha fazla göstermek nasıl görselleştirmek ve yerinde zymogaphy BBB Bodrum membranlar ve CD45 + işgal bağışıklık hücreleri immünfloresan stainings birleştiğinde tarafından gelatinase aktivite EAE beynindeki yerelleştirilmesine.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm vücut ve zihinsel fonksiyonları omurgalılarda merkezi sinir sistemi (MSS) koordinatları ve CNS homeostazı nöronlar uygun bir iletişim için esastır. CNS homeostazı MSS kan akışı değişen çevre korur nörovasküler birimi (NVU), tarafından garanti kapsamındadır. NVU biyokimyasal olarak benzersiz ve kan - beyin bariyerini (BBB) perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) bileşenleri ile sürekli crosstalk kurmak, CNS mikrovasküler endotel hücreleri, iki kurulması oluşur farklı Bodrum membranlar1. Endotel membran o ensheathes BBB endotel hücreleri ve abluminal yönü perisitlerden yüksek sayıda limanlar ve laminin α4 ve ek olarak diğer ECM proteinler2laminin α5 oluşmaktadır. Buna ek olarak, parenkimal membran laminin α1 ve laminin α2 oluşur ve astrositik sonu-ayak tarafından kucakladı. Astrocyte sonu-ayakları ile birlikte parenkima membran serebrospinal sıvı dolu Perivasküler veya subaraknoid boşluk3CNS nöronal ağdan segregates glia limitans oluşturur. NVU eşsiz mimarisi nedeniyle bağışıklık hücre MSS ticareti bir işlemdir bağışıklık hücreleri ile gerektirir gibi periferik dokulara ilk endotel BBB ve daha sonra glia limitans için ihlal olduğunu ayrıdır CNS parankimi ulaşmak.

Multipl skleroz (MS) bağışıklık hücreleri dolaşan çok sayıda MSS girin ve neuroinflammation, demiyelinizasyon ve BBB bütünlüğü4odak kaybına neden MSS, ortak bir neuroinflammatory hastalıktır. BBB bütünlüğü kaybı bir erken MS, gadolinyum kontrast olarak görüntülenmeyecektir manyetik rezonans görüntüleme (MRG)5MSS lezyonlarının artırılması varlığı tarafından belirtildiği şekilde özelliğidir. Lökosit ekstravazasyonu içine MSS postkapiller venüller düzeyinde gerçekleşir; Ancak, keşfedilmeyi kesin mekanizmaları bağışıklık hücre diapedesis BBB membran ve daha sonra gliyal bariyer arasında yer kalır. Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) MS için hayvan bir model olarak hizmet vermektedir ve önemli ölçüde bizim mevcut bilgi hakkında MS patogenezinde katkıda bulunmuştur. Örneğin, EAE modelini kullanarak bu ilk bir yakalama dahil olmak üzere multistep bir işlemde lökosit ekstravazasyonu oluşur ve adım haddeleme tarafından selectins ve müsin benzeri moleküllerin glikoprotein ligand (PSGL) -1, P-selektin gibi aracılı keşfedilmiştir integrin bağımlı firma tutuklama ve T hücrelerinin diapedesis6için izin veren iki taraf için de BBB endotel hücreleri üzerinde tarama tarafından izlenen.

T hücreler endotel BBB ve endotel membran geçti sonra onların soydaş antijen makrofajlar veya stratejik leptomeningeal veya Perivasküler boşluklara lokalize dendritik hücreler karşılaşmaya ihtiyaçları var. Bu etkileşim pro-inflamatuar aracılar odak üretim sonraki mekanizmaları via glia limitans7,8,9bağışıklık hücreleri CNS doku işgali için gereken tetiği neden olmaktadır. Matriks metalloproteinazların (MMP) -2 ve MMP-9 odak harekete geçirmek Kemokin harekete geçirmek değiştirir ve bağışıklık için bir önkoşuldur bozulması astrocyte sonu-ayakları, hücre dışı matriks reseptörlerinin indükler glia limitans arasında geçiş hücre CNS parankimi ve klinik belirtiler EAE10,11başlangıcı ikna etmek için.

BBB ile bağışıklık hücre infiltre CNS tespiti birleştiren CNS doku bölümlerde kaçağı ve gelatinase etkinliği bağlamında neuroinflammation, endotel ve gliyal bariyer işlevsel bütünlüğü hakkında değerli bilgiler sağlar. Örneğin, biz son zamanlarda araştırdık endotelyal sıkı kavşak molekül bileske adezyon molekülü (reçel) kurucu kaybı-B bağışıklık hücre MSS EAE bağlamında kaçakçılığı. Sağlıklı vahşi tipli C57BL/6 fareler için karşılaştırıldığında, sağlıklı reçel B eksikliği littermates BBB bütünlüğü hiçbir bozulma endojen gibi eksojen izleyiciler12kullanarak içinde vivo geçirgenliği değerlendirme tarafından gösterildiği gibi gösterdi. EAE bağlamında, reçel-B-eksik C57BL/6 fareler iyileştirmiştir hastalık belirtileri, hangi inflamatuar hücre bindirme leptomeningeal ve Perivasküler alanlarda12ile ilişkili olduğunu gösterdi. Bu fenomen incelemek için biz in situ zymography, gelatinase faaliyetlerin tanımlaması reçel B eksikliği farelerde gelatinase aktivite eksikliği bağışıklık hücreleri aşmak mümkün sınırlı sayıda için sorumlu olabilir eğer test etmek için izin uygulanır glia limitans12.

Durumu göz önüne alındığında farklı genetik olarak eksik, örneğin, değişiklikleri BBB işlevinde neden olabilir farklı BBB sıkı kavşak molekül modelleri için BBB bütünlüğü araştırıyor metodolojileri önemlidir fare değiştirilmiş. Buna ek olarak, yeni geliştirilen ilaçlar NVU engelleri üzerinde etkisi olabilir. Burada biz EAE C57BL/6 farelerde miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) ile Aktif bağışıklama tarafından ikna etmek nasıl göstereceğim-peptid aa35-55 tam Freund'ın adjuvan olarak. Biz o zaman bağışıklık hücre infiltrasyonu NVU endotel ve gliyal engelleri arasında yerelleştirilmesine ve içinde vivo endotel ve gliyal bariyer bütünlüğünü eksojen izleyiciler ve gelatinase etkinlik, yerinde tespiti tarafından sırasıyla çalışma açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm çalışmalar muhafaza-in hayvan İsviçre mevzuatına göre kurallar altında yapılmıştır ve Bern, İsviçre kantonu veteriner ofisi tarafından kabul edildi (izni numaraları: BE 31/17 ve olmak 77/18).

1. belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullarında C57BL/6 farelerin konut

  1. 12/12 h koyu ile bireysel havalandırılmış kafeslerde House fareler döngüsü. Gıda sağlamak ve reklam libidum su. Farelerin Mikrobiyolojik kalite denetleyecek, deneysel kohort FELASA öneriler13takip kirli yatak nöbetçiler tarafından üç aylık sağlık kontrolü uygulandı.
  2. Kulak yumruk tek tek mark 8-12 hafta yaşlı kadın C57BL/6 fareler için kullanın.

2. C57BL/6 farelerin bağışıklama

  1. Çözümler14hazırlanması:
    1. Tam Freund'ın adjuvan (CFA için), Mycobacterium tüberküloz (H37RA) bir duman başlık altında mix eksik Freund'ın adjuvan 30 mL taze pestled ısı 120 mg ile inaktive olur. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
    2. MOGaa35-55-peptid hisse senedi çözüm için MOGaa35-55-peptid steril PBS (4 mg/mL) içinde dağıtılması ve-80 ° C'de depolayın
    3. MOG emülsiyon hazırlayın:
      1. CFA MOG-peptid hisse senedi çözümde 2 mL microtube ile 1:2 oranında seyreltin.
      2. Film mühürleme ile microtube mühür ve tüp yapıştırıcı bant ile tamamen kaplayan bir girdap karıştırıcı düzeltmek. Girdap emülsiyon 4 ° C'de 4 h için
    4. Bunlar arasında emülsiyon ile şırıngalar hazırlayın:
      1. Microtube al ve hızlı bir şekilde küçük masa santrifüj kullanarak emülsiyon spin. Emülsiyon 18G x 1½'' (1.2 mm x 40 mm) enjeksiyon iğne kullanarak bir şırınga toplamak.
      2. Fareler sayısına göre şırınga (100 µL/fare) emülsiyon sesi ayarlamak ve 18 G iğne 27G x ¾'' (0.4 mm x 19 mm) enjeksiyon iğnesiyle değiştirin. Film mühürleme ile şırınga bağlı enjeksiyon iğne kapatın.
    5. Boğmaca toksin (PTx) stok çözüm için liyofilize PTx steril PBS 500 µL içinde 50 µg dağıtılması (100 ng/µL). Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
    6. PTx çalışma çözüm için PTx hisse senedi çözüm (300 ng/100 µL) fare (mayi enjeksiyon kullanımı için 30G x ½'' (0.3 mm x 13 mm) iğne) başına 3 µL steril PBS 97 µL karıştırın.
  2. EAE indüksiyon
    1. C57BL/6 fareler bir Buharlaştırıcı sistemi kullanarak isofluorane ile anestezi. Anestezi farelerde ikna etmek için % 4.5 isofluorane oksijen küçük kuluçka odasında fare sağlamlılık %2.1 isofluorane ile fare aktarmadan önce maruz. Yastık Isıtma ile donatılmış bir anestezi birimi fare hipotermi engellemek için kullanın.
    2. Bir elinde imzalat fare düzeltmek ve ilk MOG35-55/CFA-emülsiyon 30 µL subkutan arka bacak yanları enjekte (Şekil 1:1 + 2; 60 µL toplamda; sol kanattan 30 µL ve sağ kanatta 30 µL) olarak inguinal lenf düğümleri yakınlığı kapatın.
    3. Karnı fareyi getirin ve MOGaa35-55/CFA-emülsiyon 20 µL sol ve sağ fonksiyon yağ dokusu kuyruk kök içine enjekte (Şekil 1:3 + 4; 40 µL toplamda; kuyruk kök 20 µL sol tarafta kuyruk kök 20 µL ve sağ tarafta) ve MOGaa35-55/CFA-emülsiyon int küçük damlacık o fareyi boyun (şekil 1: 5).
    4. PTx çözümün 100 µL intraperitoneally fareyi enjekte. Fare başkanı bağırsak içine enjeksiyon kaçınarak vücut Merkezi aşağıda tutun.
    5. Bakım diyet değiştirin (extrudate önemli besin: ham protein % 18.5 ham yağ % 4.5 ham lif % 4.5; Ham kül % 6,5; nişasta % 35; metabolik enerji: 13.1 MJ/kg) diyet ıslahı için (extrudate önemli besin: ham protein %23,5; ham yağ % 5.5; ham lif % 3; Ham kül % 5.7; nişasta % 36; metabolik enerji: 14.3 MJ/kg) öncesi ve sırasında beklenen klinik hastalık fareler daha yüksek enerji içeriği yemekle sağlamak.
    6. Ve fare ile ısınma bir yastık ev onun kafes için transfer yüz maskesi çıkarın. Tam olarak uyanık ve hareketli fare 10 dakika sonra olduğundan emin olun.
    7. PTx enjeksiyon (2.2.4) 48 h ilk tedaviden sonra tekrar.

3. puanlama EAE farelerin

  1. Kafes içinde bir göz atarak her sabah EAE fareler sağlık durumunu denetleyin.
  2. EAE fareler her öğleden sonra puan.
  3. Kuyruk yukarı doğru bir parmak ile hareket ettirerek tonusunuz olup EAE deney dışarı kafes ve onay dahil her bireysel fare al. Sağlıklı bir fare kuyruğunu devam edecektir (kuyruğu bir tonusunuz var). Klinik EAE başlamışsa, kuyruk tonusunuz daha düşük, kademeli bir düşüş kuyruk tarafından görünür olacaktır. Sonunda fare kuyruğunu hiç kaldırmak mümkün olmayacaktır.
  4. EAE deneme temiz bankta dahil her bireysel fare yerleştirin ve gözlemlemek ve yürüyüş davranış belge. Hastalık şiddeti değerlendirilmesi için kriterleri puanlama için Tablo 115 bakın (EAE puan).
  5. Değerlendirmek ve denemeye dahil her farenin ağırlığını belge.
  6. Yeterli gıda ve su alımını bir klinik EAE görüntüleme fareler tarafından emin olmak için 1 skor bir plastik tabak üstünde belgili tanımlık dip-in belgili tanımlık kafes içinde nemli gıda tedarik ve günlük yenileyin.

4. In vivo geçirgenliği tahlil

  1. Hazırlıklar çözümleri:
    1. Dextran hisse senedi çözümleri için 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 yanı sıra 3 kDa Dextran Texas kırmızı 500 µL % 0,9 Sodyum Klorür çözüm (20 mg/mL) geçiyoruz.
    2. Dextran çalışma çözüm için sadece 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 enjeksiyon damlalıklı 55 µL önce çözüm (20 mg/mL) film sızdırmazlık bir parça üzerine stok ve 3 kDa dextran Texas kırmızı hisse senedi çözüm (20 mg/mL) 55 µL ekleyin. Mix ve 100 µL tek kullanımlık iyi şırınga (son konsantrasyonu 2 mg/100 µL) toplamak.
    3. PFA ekstra saf toz, PBS 100 mL ve temiz cam kabı ve tam 56 ° bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırma altında C kadar ısı 1N NaOH 200 µL 10 g % 10 formaldehit (PFA) hisse senedi çözüm için birleştirin; 30 dk 56 ° C'de ise tamamen eriyene kadar tutun; oda sıcaklığına kadar sakin olun; pH 7.4 için ayarla; ve bir kağıt filtre ile filtre. Mağaza - 20 ° c Hisse senedi çözüm daha da PBS kullanarak seyreltilmiş.
  2. Kısa bir süre sağlıklı C57BL/6 fare veya C57BL/6 fare ile (fare yaklaşık 1 dk sedatize) isoflurane EAE acı anestezi. Otomatik bir sistem olduğu gibi (fare-% 4.5 isoflurane oksijen bir indüksiyon odasında maruz ve sağlamlılık % 2.1 isoflurane ile transfer) adım 2.2.1 kullanın.
  3. İmzalat fare masada, lateral pozisyonda sonra intravenöz yer (örneğin retro-orbitally) fare uyanmadan önce floresan izleyiciler 100 µL fare enjekte.
  4. Hemen sağlamlılık kaldırmak ve fare sonra kısa anestezi tam olarak uyanık ve hareketli olduğundan emin olun. 15 dakikadır dolaşımda izleyici izin.
  5. Adım 5.1 ile devam edin.

5. farelerin perfüzyon

  1. İçinde vivo geçirgenliği değerlendirmesi için:
    1. Yordam 15dk derin isoflurane anestezi inducing tarafından floresan izleyici enjeksiyon sonra başlar. Farelerde derin anestezi ikna etmek için oksijen isoflurane %2.3 kullanın. Anestezi derinliği yargılamaya pençe çekilme refleks kullanın (ayak parmakları arasında cilt çimdik; fleksiyon eksikliği yeterli derinlik gösterir) ve refleksleri forelimb ve farelerde EAE için tabi hindlimb sonda.
    2. Sırtında fare düzeltmek ve etanol ile göbek sprey. Makas kullanarak Toraks açın ve diyafram çıkarın. Makas kullanarak kalbi Sağ atrium açın ve fare ile kalbin sol ventrikül tarafından 10 mL % 4'lük takip PBS 10 mL ile sıvı PFA PBS içinde.
      Dikkat: PFA teneffüs önlemek için fareyi bir duman başlıklı sıvı.
    3. 6 bölüme geçin.
  2. Situ zymography için:
    1. Derin isoflurane anestezi % 2,3 isoflurane oksijen EAE acı bir Mouse kullanarak teşvik ve olduğu gibi adım 5.1.1 anestezi derinliği kontrol edin.
    2. Ardından, fare sırtını düzeltin ve etanol ile göbek sprey. Makas kullanarak Toraks açın ve diyafram çıkarın. Makas kullanarak kalbi Sağ atrium açın ve kalbin sol ventrikül ile 20 mL PBS üzerinden fare sıvı.
    3. 6 bölüme geçin.

6. diseksiyon ve beyin dondurulması

  1. Soğutma banyo Hazırlanışı:
    1. Düz bir dewar kapsayıcı ezilmiş kuru buz ile doldurun ve sıvı yaklaşık 1 cm kuru buz torbası yukarıda ulaşıncaya kadar 2-methylbutane (Isopentane) ekleyin. Gevşek bir kapak ile-örneğin, bir buz kovası kapak kapak.
  2. Perfused fare kafasını keskin makas ile küçük ve cilt ve kulakları makas daha küçük bir kümesi kullanarak kaldırın.
  3. Dikkatle Scullcap deliği magnum sol ve sağ tarafındaki için upfold kafatası beyin üzerinde izin önüne doğru gelen keserek parçalara. O zaman, olduğu gibi beyin kafatası tabanından dışarı düz metal bir spatula kullanarak optik sinirler kesilmesinin çýkýntýdan.
  4. Beyin alüminyum folyo yerleştirin ve üç adet (ön beyin, orta beyin ve beyincik + beyin sapı) beyinde iki koronal kesim koyarak kesti.
  5. Bir cryomold (25 x 20 x 5 mm) ilk çeyrek için optimum sıcaklık kesme (O.C.T.) matris ile doldurun, her beyin parça aşağı doğru cryomold bakan ön tarafı ile beyin dilimleri yerleştirin ve doku tamamen O.C.T. matris ile kapak.
  6. 2-Methylbutane banyo içine yatay yönde doku ile cryomold yerleştirin ve doku aşağıdan yukarı 1 dakika içinde tüm doku blok banyo içine daldırma kaçınarak donuyor olduğunu emin olun.
  7. -80 ° C depolama için dondurulmuş doku aktarmak ve Bölüm 7 ile devam edin.

7. dondurulmuş doku bölümleri hazırlanması

  1. Sıcaklık donmuş dokusundan-80 ° c-20 ° C'de 30 dk için cryostat equilibrate.
  2. Cryomold ve monte cryostat doku tutucu (-15 ° C ile ayarla) doku blok kaldırmak O.C.T. matrisi kullanarak.
  3. Cryostat keskin bir neşter ile kutusunda doku bloğunu kenarlarını kesme ve doku görünene kadar cryostat bıçakla 20 µm bölümleri kaldırarak doku bloğu içine kesme başlatın.
  4. İçinde vivo BBB geçirgenliği analizi için:
    1. 6-10 µm doku bölümler kesip, onları yapışma cam slaytlarda toplamak ve hemen bir kapak bir floresan mikroskop kullanarak kayma ile kaplı bölümleri görüntü.
    2. Görünüm (floresan desenleri sızan kan damarları için gözlenen yaygın karşılaştırıldığında sigara sızan kan damarlarının sınırları keskin dikkat) beyindeki kan damarlarının değerlendirmek. Pozitif kontrol, izleyici kaçağı circumventricular organ veya bir BBB eksikliği choroid plexus stroma doğrulayın.
  5. Situ zymography için:
    1. Bir cryostat kullanma 6 µm doku bölümlerine kes, onları yapışma cam slaytlarda toplamak ve doku bölümleri kapağı silikon jel içeren bir dondurucu kutusunda-20 ° C'de dondurmak.

8. in situ zymography kombine laminin/CD45 ayirt boyama ile

  1. Çözümleri hazırlayın:
    1. Gömme çözüm hazırlayın:
      1. Gliserol (analitik grade) 6 g, Poli (vinil alkol) 2.4 g, ddH2O 6 mL ve 12 mL 0,2 M Tris arabelleği, pH 8, mix ve (manyetik karıştırıcı) 4 h için çözüm RT. heyecan.
      2. Çözüm için 50 mL santrifüj tüpü aktarmak ve RT. 2 h için rahat bırak Daha sonra 10 dk 50 ° c (su banyosu) için çözüm ve santrifüj 2700 x g oda sıcaklığında 20 dakika için kuluçkaya.
      3. Süpernatant al ve aliquots-20 ° C'de dondurmak
    2. Soğuk jelatin çözüm hazırlayın:
      1. 0.1 g ddH2O 10 ml sığır deriden soğuk jelatin geçiyoruz.
      2. En az 1 gün için emmek ve aliquots 4 ° C'de depolayın
    3. Buz gibi metanol (-20 ° C) hazırlayın:
      1. -20 ° c kadar serin ve % 100 metanol coplin kavanoza koy
    4. % 10 sodyum azid hisse senedi çözüm hazırlayın:
      1. DdH2O için 10 mL sodyum azid 1 g ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
    5. % 0.1 sodyum azid çalışma çözüm hazırlayın:
      1. 1 µL % 10 sodyum azid hisse senedi çözüm ile Mix 99 µL of ddH2O.
    6. Birleşik floresein boya su (DQ) jelatin domuz deri ışık 4 ° C'de Korumalı çözüm ve mağaza 100 µL aliquots çalışma sodyum azid 1 ml 1 mg dağıtılması
    7. Etanol ve mağaza-20 ° C'de 76 µL 1,10-pH monohidrat 30 mg dağıtılması
    8. 25 x proteaz inhibitörü çözüm hazırlayın:
      1. EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü 1 tablet ddH2O 2 mL için ekleyin. -20 ° C'de mağaza
    9. Sadece kullanmadan önce reaksiyon çözüm (150 µL/bölüm) hazırlayın:
      1. 1 mg/mL DQ jelatin çözüm 13,300 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.
      2. DdH2O, 15 µL tepki arabellek (Gelatinase/Collagenase tahlil kiti; bkz: Malzemeler tablo) x 10, 20 mg/mL soğuk jelatin 0.3 µL, 1 mg/mL DQ jelatin 1,5 µL ve proteaz inhibitörü çözüm x 25 6 µL Mix 127.2 µL.
    10. Sadece kullanmadan önce phenantroline negatif kontrol tepki çözümü (150 µL/bölüm) hazırlayın:
      1. DdH2O, 10 tepki tampon, 0.3 µL 20 mg/mL soğuk jelatin, 1 mg/mL DQ jelatin 1,5 µL, 6 µL proteaz inhibitörü EDTA ücretsiz x 25 x 15 µL ve 2 M 1,10-phenantroline (MMP inhibitörü) 2 µL Mix 125.2 µL.
    11. Sadece kullanmadan önce soğuk jelatin (floresan olmayan) negatif kontrol tepki çözümü (150 µL/bölüm) hazırlayın:
      1. DdH2O, 10 x reaksiyon arabellek 15 µL, 20 mg/mL soğuk jelatin 0.3 µL ve 25 x proteaz inhibitörü EDTA ücretsiz 6 µL Mix 128.7 µL.
    12. Birincil antikor, örneğin counterstaining için kokteyl, 0.95 µg/mL poliklonal tavşan anti-laminin antikor ve 10 µg/mL poliklonal fare anti-CD45 antikor PBS % 1 BSA içinde ve uygun izotip kontrol birincil antikor kokteyller hazırlayın.
    13. İkincil antikor çözüm, örneğin, 7.5 µg/mL Cy3 keçi Anti-sıçan + 15 µg/mL % 1 BSA PBS içinde AMCA Anti-tavşan hazırlamak (ışıktan korumak).
  2. 6 µm sabit olmayan beyin doku bölümlerden EAE fareler kapağı su doku saklama önlemek ve kalem kovucu bir su ile çizgiler çizerek 2 doku bölümlerde bir slayt üzerinde ayrı bir duman başlıklı silika jel içeren plastik dondurma kutusu içinde çözülme
  3. Reaksiyon Çözümleri (adımları 8.1.9-8.1.11) hazırlamak, 13.400 x g oda sıcaklığında ve öncesi sıcak su banyosu kullanarak 37 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi.
  4. 1 x reaksiyon arabellek kullanarak 37 ° C'de 5 min için doku bölümleri rehydrate. Sonra 1 x reaksiyon arabellek dökün, reaksiyon çözüm doku bölümleri ekleyin ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Slaytlar ddH2O içinde 5 kere yıkayın.
  5. -20 ° C'de buz gibi metanol ile 5 min için bölümleri düzeltmek ve daha sonra PBS oda sıcaklığında bir kez bölümlerle yıkayın.
  6. % 1 BSA içinde PBS için bölümler eklemek ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya (ışıktan korumak). Sonra doku slaytlarda lanetleme tarafından PBS bölümlerden %1 BSA atmak, birincil antikor kokteyl ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya (ışıktan korumak).
  7. Bölümleri iki kez PBS ile yıkayın, ikincil antikor kokteyl ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya (ışıktan korumak).
  8. Bölümleri iki kez PBS ile yıkayın, çözüm gömülmesi ile slaytlar mount, bağlı bölümler gece oda sıcaklığında kuru izin (ışıktan korumak). Son olarak, floresan mikroskop kullanma lekeli doku bölümlerine analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EAE klinik seyir C57BL/6 farelerde değerlendirilmesi bir hastalık eğrisi şekil 2A ve şekil 2Bsunulan gibi fare vücut ağırlığı değişimler tasvir sonuçlanmalıdır. MOGaa35-55 ile genellikle aşı C57BL/6 fareler Aktif bağışıklama (şekil 1A) sonra gün 10-12 civarında hastalık belirtileri geliştirmeye başlayın. Genellikle, aşılı fareler emülsiyon enjeksiyon ve boğmaca toksin (şekil 1B) ilk doz ertesi gün vücut...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, teşvik ve kadın C57BL/6 farelerde EAE izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Kadın tercihen seçilir ve orada kadınlar insidansı: Erkekler 3:1 MS. EAE şiddetini değerlendirmek için yaptığımız bir 3-nokta skor sayfası kullanın. EAE önem genellikle motor işlev bozuklukları önem derecesi ile ilgili olarak attı. EAE aşamalarında fare ile gelişmiş, yani 2 üzerinde bir skor sergilenmesi hayvanların gereksiz acı önlemek için feda. Böylece, bu fareler yakın aralıklarla örneğin puanı için önerilir günde iki kez iletişim ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ona orijinal in situ zymography protokolü10 bizimle paylaştı Lydia Sorokin minnetle anıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AMCA anti-tavşan antikoruJackson ImmunoResearch111-156-0454 & deg'de saklayın; C; Işıktan koruyun
Anti-CD45 Antikoru (30F11)Pharmingen07-14014 &°C'de saklayın; C
Anti-Laminin AntikoruDAKOZ00974 derecede saklayın > C
Yetiştirme yemi, örneğin PROVIMI KLIBA SA3336
Bireysel havalandırmalı kafesler, Mavi hat Tip II veya III,örneğin Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraksiyonu VApplichemA13914 &°C'de saklayın; C
Soğuk jelatin, Sigma-AldrichG 9391
Coplin kavanoz + raförneğin Carl Roth GmbH + Co., KGH554.1; H552.1
Cy3 anti-sıçan antikoruJackson ImmunoResearch111-156-1444 &°C'de saklayın; C; ışıktan koruyun
Kapak kızakları 24 x 40 mm # 1örneğin Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10.000 MW),örneğin Moleküler problarD22910-20 ° C'de saklayın; C; ışıktan koruyun
Dextran Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328-20 ° C'de saklayın; C; Işıktan koruyun
EnzChek Jelatinaz / Kollajenaz Test Kiti Thermo Fisher Bilimsel; EnzCheckE12055Mağazası -20 > C; hafif
Dişi C57BL/6J fareleri koruyun (8-12 hafta),örneğin Janvier LabsDişiler, 8-12 hafta
Histoloji slaytları için dondurma kutusu, örneğin Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½ ’ ’ (1,2 mm x 40 mm) enjeksiyon iğnesi, örneğin BD, BD, Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0,4 mm x 19 mm) enjeksiyon iğnesi, örneğin BD, BD, Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) enjeksiyon iğnesi, örneğin BD, BD, Microlance 3304000
Incomplete Freund' s adjuvan (IFA),örneğin Santa Cruz Biyoteknolojisc-24648Mağazası 4 derece; C
Bakım gıdası, örneğin PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 peptid,örneğin -Store; C
mikroskop slaytları (Superfrost Plus)Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis < / em > H37RAörneğin BD2311414 & derece saklayın; C 
NaCl %0,9B. Braun3535789
O.C.T. bileşiği (Tissue-Tek)Sakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ 'B. Braun9151125S
ParaformaldehitMerck30525-89-4
Boğmaca toksini, örneğin List biological laboratories, Inc.180Mağaza 4 & derece; C
poli (vinil alkol) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Proteaz İnhibitörü EDTA içermez (Roche)Sigma-Aldrich46931320014 & derecede saklayın; C
itici kalem, örneğin DAKO Penörneğin DAKOS2002
sızdırmazlık filmi, örneğin Parafilm M, örneğin Sigma-AldrichP7793
Silika jelörneğin Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
Dikiş makasıFST15012-12
şırınga, 1 ml, örneğin PRIMO62.1002
şırınga 10 ml, örneğin CODAN Medical ApS2022-05
buharlaştırıcı sistemi Univentor 400UNO. Bv
, , , , , , :80 °C'de GenScript , , , , , , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kan Beyin Bariyeri Ge irgenli iGelatinaz Aktivitesi G rselle tirmesiFloresan zleyici EnjeksiyonuIn Situ Zimografimm n H cre nfiltrasyonuN rovask ler nite AnaliziC57BL 6 Fare ModeliMSS Parankim G r nt lemeHastal k iddeti Skorlamas

İlgili makaleler