Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış

5.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59253

⸱

13 Nisan 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Bu makalede

Özet

Burada yüksek üretilen iş algılama ve fucosylated insan sütü oligosakkaritler (HMOs), tüm hücreli Biyoalgılayıcı kullanarak miktar açıklayın. Biz de burada, bu platform HMO üretim suşları, analizini doğru uyarlaması gürültü oranı sinyal geliştirmeye odaklanan göstermek.

Özet

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) bebek sağlığı üzerinde bol yararları sorun oluşturan kompleks karbonhidrat bileşenleri insan anne sütü vardır. Ancak, onların Biyoteknolojik sentez duruma getirilmesi nispeten düşük akış verimi, algılama ve miktar yaşam ve bağlantıları sınırlıdır. Glycan analiz geleneksel teknikleri ile geçerek örnekleri otomasyon olmadan günde yüzlerce sırasına Kromatografik/kütle-spektrometrik yöntemleri içerir. Biz burada, yüksek işlem hacmi, bağlantı özel algılama ve miktar fucosylated HMO yapıları, 2'-fucosyllactose ve 3-fucosyllactose, biz Contegra yoluyla elde için genetik olarak kodlanmış bir bakteriyel Biyoalgılayıcı göstermek fucosidases ifadesidir. Laktoz süt veya Biyoteknolojik süreçler varlığı için yanlış pozitif neden olabilir gibi aynı zamanda farklı stratejiler kullanarak laktoz sinyal azalma göstermektedir. Bu teknik en yüksek üretimi nedeniyle, birçok reaksiyon koşulları veya biyoreaktör parametrelerini paralel HMO üretim optimizasyonu için izin saatlik bir konuda denetlesinler.

Giriş

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) genellikle 3-8 şeker monomerleri oluşan oligosakkaritler, laktoz kaynaklı vardır. Onlar bir Laktoz (Gal-β1, 4-Glc) sona azaltmak ve daha fazla glycosidic bağlantılarıyla uzamıştır (β-1,3 - veya β-1,6-) (Glc) glikoz, galaktoz (Gal) veya N-peptidoglikan (GlcNAc). Buna ek olarak, fucose (Fuc, α-1, 2 veya α 1,3-) veya sialik asit (SIA veya NeuAc, α-2, 3 veya α 2,6-) artıkları kez1eklendi.

Geçerli analiz oligosakkaritler ve diğer karbonhidratlar Kromatografik/kütle spektrometrik (MS) teknolojisi2,3,4,5, için ihtiyaç ile üretilen iş ve kapsam içinde sınırlıdır 6 , hangi-ebilmek almak kabaca 7, pahalı donanımları, özel sütun ve saptırma ajanlar ve uzmanlık Bu ekipman8operasyonunda bahsetmiyorum örnek başına bir saat. Oligosakkarit bağlantıları gerektiren Gelişmiş MS9,10 ya da Nükleer manyetik rezonans (NMR) teknikleri11belirlemek, özellikle zordur. Bu oligosakkaritler sentezi hızlı optimizasyonu böylece bu yavaş analitik adım işlem hacmi ile sınırlıdır.

Bu çalışmada, biz fucosylated trisaccharide tespiti bağlantı özgü göstermek laktoz tabanlı HMOs 2'-insan sütte en bol HMO olan fucosyllactose (2'-FL) odaklanan, genetik olarak kodlanmış kullanarak Escherichia coli tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı bir sınırı olan 4 mg/l, algılama Bu Biyoalgılayıcı önemli bir özelliği isomeric trisaccharides arasında ayırt etmek için onun yetenek var. Tasarım prensibi varlığı hangi sırayla bir floresan sinyali üretir lac operon tarafından algılanır laktoz HMOs, üzerinden kurtarmak belirli fucosidases E. coli olarak ifade temel alır. Biz bunu bir bağlantı özgü fucosidase ve diğer bir floresan muhabir protein barındıran bir iki-plazmid sistemi kurarak başarmak. Bu Biyoalgılayıcı platform yüksek üretilen iş tarama Akış Sitometresi veya mikro-plaka okuyucu için uygundur. Biz de 2'-FL bir mühendislik zorlanma12tarafından üretilen miktarının içinde Biyoalgılayıcı kullanımını göstermektedir. Verilen bu mühendislik yapımcı zorlanma laktoz üzerinde yetiştirilen bu çalışma içinde biz da üç stratejileri Biyoalgılayıcı yanlış olumlu sinyal sonuçlanabilir laktoz seçici kaldırılması üzerinde mevcut.

Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış biyosensörler algılamak ve HMOs bile zor bir bağlantı özgü şekilde ölçmek için bize izin Kromatografik, MS veya NMR teknikleri. Onun yüksek işlem hacmi ve kullanım kolaylığı nedeniyle, bu yöntem yaygın uygulamalar metabolik Mühendisliği ve HMOs sentezi olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hücre kültür ve indüksiyon koşulları

Not: aşağıdaki deneyler üç suşlar kullanılır: E. coli BL21 (DE3) boş bir vektör, E. coli BL21 ile (DE3) plazmid pAfcA14 ve pET28:green floresan protein (GFP) ve E. coli BL21 ile (DE3) Plasmid'ler ile pAfcB14 ve pET28:GFP. Tüm suşların Luria-Bertani suyu (LB) veya en az medya uygun antibiyotikler ile yetiştirilen. 1000 x sefaloridin (50 mg/mL) ve carbenicillin (100 mg/mL) hisse senedi çözümleri deiyonize (DI) su hazırlamak.

  1. Medyası hazırlama
    1. LB medya LB toz stokunun 25 g 1 litre DI su ekleyerek hazırlayın. Otoklav sterilize etmek 20 dk için 121 ° C'de çözüm. Steril LB ortam sıcaklığı her 1 mL LB medya için antibiyotik stokunun 1 µL eklenmesi önce 60 ° C'den tamamlanana kadar bekleyin.
    2. LB tabak hazırlamak önce sterilizasyon LB basına 15 g agar ekleyin. Steril LB agar sıcaklık antibiyotik eklenmesi önce 60 ° C'den tamamlanana kadar bekleyin.
    3. 1.1.3 biosensing hücreler için medya veya ikili antibiyotik, sefaloridin ve carbenicillin ile plakalar hazırlayın.
  2. Karbonhidrat indükleyicileri
    1. Karbonhidrat indükleyicileri 20 g/L laktoz molar eşdeğerleri, hisse senedi çözümler hazırlamak: 29 g/L 2'-FL ve 3-FL
      Not: Her 200 µL hücre 2'-FL veya 3-FL 20 µL gerektirecektir
    2. Hücreleri 200 µL 2.0 g/M son 2'-FL/3-FL Incubate 37 ° C'de sürekli sallayarak ile laktoz veya 2.9 g/L son konsantrasyonu konsantrasyonu ile neden ve bir gecede büyümek kültürler izin.
  3. Hücre kültürü
    1. Bir gün önce deney tohum LB orta sefaloridin ve taze bir bakteriyel colony, steril tekniği kullanarak üzerinden carbenicillin ile takıma 5 mL.
    2. Tüm kültürler ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya ve kültürleri bir gecede büyümek.
    3. Gecede kültür 50 µL 5 mL taze LB/M9 medya sefaloridin ve carbenicillin de içine aktarın. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile kuluçkaya ve kültür 600 optik yoğunluk ulaşmıştır kadar büyümek nm (OD600) 0.5-0.7. Bu orta günlük aşamada hücreleri bağlı olmak.

2. Floresans ve algılama sınırlarının ölçümü

  1. Akış Sitometresi hücreleri hazırlanması
    1. Gecede kültür 1,5 mL tüpler ve 1 dk. için 12.500 x g , santrifüj aktarın.
    2. Süpernatant atmak ve Pelet 500 µL 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl DI su, pH 7.2) bir tek hücre süspansiyon hazırlamak ve tek hücre aktarmak için yeniden askıya yılında süspansiyon 5 mL Akış Sitometresi tüpler için.
    3. Hücreleri üzerinde bir Akış Sitometresi örnekleri çalışan kadar 4 ° C'de karanlıkta bırakın. En iyi sonuçlar için en kısa zamanda hücreleri analiz.
    4. GFP heyecanlandırmak için 488 nm lazer seçin. Floresein isothiocyanate (FITC) floresan düzeyleri (20,000-40,000 olaylar, ön ve yan dağılım için toplanan hücre ve enkaz önlemek geçişli) 525/50 nm bant filtre ile toplamak.
  2. Biyoalgılayıcı ayarlama
    1. Bir kalibrasyon eğrisi yapmak, 8-10 dilutions Standart 2'-FL aralığı 0 – 2.500 mg yapmak/L.
    2. (PAfcA ve pET28:GFP içeren) 2'-FL biosensing hücreler kültür ve onları daha önce 1.3 bölümünde açıklandığı gibi standart dilutions ile teşvik. Her seyreltme için üç biyolojik çoğaltır yerine getirir.

3. algılama ve miktar 2'-FL bir yapımcı yük içinde

  1. Ekimi yapımcı baskı
    1. En az medya yapmak için 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, sodyum sitrat ve 1 M tiamin ayrı çözümler hazırlamak-HCl. Sterilize 0,22 µm filtre kullanarak çözümler. M9 medya suyu tozu 1 litre DI su ile karıştırın. Otoklav 121 ° C'de 15 dakika süreyle M9 çözüm çözüm 50 ° c kadar serin MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, sodyum sitrat ve tiamin son konsantrasyonları 2 mM, 0.1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L ve 7,5 µg/L, sırasıyla ekleyin.
    2. 2'-zorlanma, örneğin, JM109 gwBC-F2, 5 ml LB medya üreten ve gecede 37 ° C'de Baumgartner vd.12' açıklandığı gibi büyümesine izin FL kültürünü başlatın.
    3. Alt kültür adım 1.3.3 250 mL 3.1.1. adımda hazırlanan en az medya daha önce açıklandığı gibi % 1. Gliserol 10 g/L son bir konsantrasyon ekleyin ve 37 ° C'de kültür kuluçkaya
    4. Kültür 0.5-0.7 OD600 ulaştığında, 0,5 mM ve laktoz 2 g/L. son bir konsantrasyon için son bir konsantrasyon izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) eklemek
    5. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile kuluçkaya ve kültürler için 24 h büyümeye izin.
  2. 2'-FL çıkarımı
    1. Gecede kültür steril 50 mL tüpler ve 15 dakika 900 x g , santrifüj aktarın.
    2. 3.2.2 süpernatant atın ve Pelet DI su yeniden askıya alma. Yıkama adım kalan laktoz kaldırmak ve sonunda 5 mL DI su yeniden askıya almak için üç kez tekrarlayın.
    3. Hücre süspansiyon koşullar için 30 s darbeleri % 30 güçte bir sonicator kullanın. Buzda hücreler her zaman tutmak.
    4. Lysed hücreler için 2.000 x gde 25 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak, steril geçmek (örneğin, 0,22 µm) filtre ve analiz kadar 4 ° C'de saklayın.
  3. Miktar ile Biyoalgılayıcı
    1. 2'-FL biosensing hücre ve orta log fazı, bir kültürü aşılamak, hücre lysate eşdeğer tahmini 2'-FL kalibrasyon eğrisi 2.2 bölümünde açıklandığı gibi yapmak için kullanılan konsantrasyonları ile ikna etmek. Kalibrasyon çözümlenmesi için örnek olarak aynı ortamında gerçekleştirmek (örneğin, lysate hücre) dilutions 2'-FL denetimine ekleyerek (yani, Sigara-yapımcı) filtre uygulanan hücre Biyoalgılayıcı hücreleri inducing daha önce lysate.
    2. Örnekleri üzerinde bir Akış Sitometresi çalıştırın. Bir doz-yanıt eğrisi Floresans çıkış oligosakkarit konsantrasyon karşı komplo tarafından oluşturmak. Standartları yanıt hücreye lysate karşılaştırın.

4. seçici laktoz kaldırılması

Not: Biosensing hücreleri için laktoz duyarlıdır ve HMOs üzerinde laktoz seçmeli olarak algılamaya Biyoalgılayıcı için arzu edilir. Bir strateji çamaşır hücre 3.2 bölümünde anlatıldığı gibi yer alıyor. Üç diğer stratejileri aşağıda açıklanmıştır.

  1. Ticari saf β-galaktozidaz ile tedavi
    1. Liyofilize β-galaktozidaz 1000 (FCC laktaz) adet/ml, 1 mm MgCl2 dağıtılması veya ticari β-galaktozidaz çözüm kullanın.
    2. Gerekli enzim optimum konsantrasyonu belirlemek için bir inoculum 2'-FL biosensing hücrelerinin büyümesine ve 2 g/L laktoz ve 2.9 g / L 2' ile teşvik-orta log fazı Utirmek.
    3. 100 µL kültürleri, β-galaktozidaz, en fazla 12 adet, değişken miktarda eklemek ve 37 ° C'de sürekli sallayarak ile bir gecede büyümek kültürler.
    4. Floresans 2.1 bölümünde açıklandığı gibi ölçmek ve en az enzim konsantrasyon belirlenerek sinyal istenilen zayıflama sağlanması için gerekli enzim optimum birimleri hesaplamak.
    5. 24 h için yetiştirilen 2'-FL üreten hücrelere β-galaktozidaz optimum birimleri ekleyin ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya 3.3 bölümünde açıklandığı gibi 2'-FL titresi belirlemek için iletişim kuralı ile devam edin.
  2. LacZ + zorlanma ile ön arıtma
    1. Bir 25 mL kültür 2'-FL üreten baskı ve orta log fazı indüklenen bir kez başlatmak, 24 h 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
    2. Bir E. coli BL21 aşılamak LB, kültürde (DE3) orta log fazı 37 ° C'de büyümeye ve kültür (2:1) 50 mL 24 h kültür ekleyin.
    3. 37 ° C'de 3 h. devam et için 3,3 bölümünde açıklandığı gibi 2'-FL titresi belirlemek için iletişim kuralı ile kuluçkaya.
  3. Etanol ile laktoz Yağış
    Not: Bu bölümde Matsuki vd.12' den uyarlanmıştır.
    1. Bir 25 mL kültür 2'-FL üreten baskı ve orta log fazı indüklenen bir kez başlatmak, 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. % 100 etanol kültürüne, iki cilt Iyice çalkalayınız ve 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya ekleyin.
    3. Süspansiyon 900 x g 15 dk. toplamak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve gecede 4 ° C, hangi laktoz precipitates kuluçkaya.
    4. Çöktürülmüş laktoz filtre kağıdı (11 µm) ile çözüme geçirerek kaldırın. Hücre 2'-hangi ile aşağıdaki bölüm 3.3 sayısal FL, içeren lysate filtrate toplamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı 2'-oligosakkarit Biyoteknolojik üretimi ile birlikte kullanılan FL için özel tasarlanmış. Bu terminal şekerler laktoz üreten değiştirmenin belirli enzimatik bölünme üzerinde dayanır ve böylece proportion için ifade bir Laktoz indüklenebilir organizatörü altında bir muhabir floresan proteinin önde gelen lac operon aktivasyonu 2'-FL miktarı Onun bağlantı özgüllük, 3-fucosyllactose (3-FL), bir izomer göstermek için de test edildi. Genetik devre ik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz insan sütü oligosakkaritler yüksek üretilen iş stratejisi fucosylated bağlantı özgü tespiti için mevcut. Bu genetik olarak E. coli , indüksiyon belirli glukanlardir ile floresan bir sinyal ile yanıt mühendislik tarafından tüm cep telefonu biyosensörler yapı tarafından gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı da nasıl Biyoalgılayıcı algılamak ve metabolik olarak tasarlanmış bir bakteriyel yük HMOs ölçmek için kullanılabilir Tarih ayrıntıları.

Bizim iletişim kuralı ek olarak kendi bağl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Iowa State Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir. Fe kısmen NSF Trinect Bursu ve Manley Hoppe profesörlük tarafından finanse edildi. T.J.M. kısmen Karen ve Denny Vaughn öğretim bursu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Floresans ve LC-MS çalışmaları ile Iowa State Üniversitesi Akış Sitometresi tesis ve incelemelerinden Keck Metabolomics araştırma laboratuvarı yardım için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2'-Fukosillaktoz Karbosynth 41263-94-9
3-Fukosillaktoz Karbosynth 41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500
Kalsiyum Klorür, DihidratFisher ScientificC79-500
Karbenisilin ve nbsp;Fisher ScientificBP26481
Dekstroz (D-Glikoz), SusuzFisher ScientificD16-1
Akış SitometresiBDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100 Serisi HPLC sistemi
HPLC KolonuLunaC18 ters faz kolonu
KanamisinFisher Scientific
LB Et Suyu, Değirmenci Fisher Scientific12-795-027
LaktozFisher Scientific64044-51-5
M9, Minimimal Tuzlar, 5xSigma-AldrichM6030
Magnezyum Sülfat, SusuzFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesKütle Seçici Tuzak SL dedektörü
Sodyum klorürSigma-Aldrich7647-14-5
Sodyum fosfat dibazikSigma-Aldrich7558-79-4
Sodyum fosfat monobazikSigma-Aldrich13472-35-0
11815024

Kaynaklar

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939(2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fukozillenmiş HMO'larBiyosensör TespitiAkış SitometrisiYüksek Kapasiteli TaramaLaktoz GirişimiBeta GalaktosidazGenetik MühendisliğiE.Coli EkspresyonuOligosakkarit KantifikasyonuBağlantı Özgünlüğü
Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.