Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

13.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59254

⸱

11 Eylül 2019

 , 
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Bu makalede

Özet

Sıvı numunelerden ekzozomların ve hücre dışı veziküllerin etiketsiz immobilizasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntülenmesi için adım adım bir prosedür tanımlanmıştır. AFM görüntüleri çözeltideki veziküllerin boyutunu tahmin etmek ve diğer biyofiziksel özellikleri karakterize etmek için kullanılır.

Özet

Ekzozomlar ve diğer ekstrasellüler (EVs) lipid membran vezikül, membran proteinleri ve diğer moleküller tarafından yüzey dekorasyonu ve rna içeren bir ana hücreden miras farklı luminal içeriği oluşan moleküler kompleksleri, proteinler ve DNA'lar. Vezikülboyutuna ve yüzey süslemelerinden oluşan koronal tabakasının büyüklüğüne bağlı olarak EV'lerin hidrodinamik boyutlarının karakterizasyonu rutin hale gelmiştir. Exozomlar için, EVs en küçük, hidrodinamik ve vezikülboyutları arasındaki göreli fark önemlidir. Vezikül boyutlarının kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme siperasyonu, altın standart bir teknik olan, cihazın maliyeti, numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi ve sık sık görüntülerde gözlenen parçacıkların az sayıda. Yaygın olarak kullanılabilir ve erişilebilir bir alternatif atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu geometri, boyut ve ekstrahücre içi veziküllerin diğer biyofiziksel özellikleri hakkında çok yönlü veri üretebilir. Geliştirilen protokol, bu analitik aracı kullanırken kullanıcılara rehberlik eder ve AFM tarafından EVs analizi için iş akışını özetler, bu da sulu veya kurutulmuş formdaki görüntüleme E'leri için numune hazırlamasını içerir, elektrostatik immobilizasyon bir substrat, veri toplama, analizi ve yorumlanması üzerine veziküller. Temsili sonuçlar, modifiye mika yüzeyindeki EV fiksasyonunun öngörülebilir, özelleştirilebilir olduğunu ve kullanıcının çok sayıda vezikül için boyutlandırma sonuçları elde etmesini sağladığını göstermektedir. AFM verilerine dayalı vezikül boyutlandırmasının kriyo-TEM görüntüleme ile uyumlu olduğu bulunmuştur.

Giriş

Ekstrasellüler veziküller (EVs) kan, idrar, tükürük, süt ve amniyotik sıvı da dahil olmak üzere tüm vücut sıvıları mevcuttur. Ekzozomlar, endozomal biyogenez, endozomal yolun belirteçleri ve tüm EV'ler arasında en küçük boyut ile diğer EV'lerden farklılaşan bir bölge sınıfı oluştururlar. Ekzozomların büyüklüğü genellikle çalışmalar arasında önemli bir değişkenlik ile bildirilmiştir. Boyutlandırma sonuçlarının yönteme bağımlı olduğu, ev boyutlarını tahmin etmek için farklı analitik tekniklerle kullanılan fiziksel ilkeler arasındaki farkı yansıttığı bulunmuştur1,2. Örneğin, nanopartikül izleme analizi (NTA) ― en yaygın olarak kullanılan boyut karakterizasyon tekniği ― evs'lerin boyutunu, çözeltideki EV'lerin Brownian hareketliliğine karşı direnci karakterize eden hidrodinamik çapları olarak tahmin eder. Bir vezikül daha büyük bir hidrodinamik çapı sıvı düşük hareketlilik anlamına gelir. Veziküllerin etrafındaki koronal tabaka, membran yüzeyine demirlemiş veya adsorbe edilmiş yüzey proteinlerinden ve diğer moleküllerden oluşan, hareketliliği önemli ölçüde engeller ve EVs'lerin hidrodinamik boyutunu artırır. Göreceli olarak, bu artış özellikle ekzozomlar için büyüktür 3, Şekil 1'degösterildiği gibi .

Kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme, sulu hallerinde vezikül boyutları ve morfolojisini karakterize etmede belirleyici bir tekniktir. Ancak, enstrümantasyon yüksek maliyet ve doğru sulu EVs görüntü alternatif tekniklerin keşfi motive kullanmak için gerekli özel uzmanlık. Edinilmiş kriyo-TEM görüntülerinde gözlenen veya karakterize edilen nispeten az sayıda EV bu tekniğin bir diğer önemli dezavantajıdır.

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yüzeydeki parçacıkların görüntüsünü canlandırmak için substrat boyunca bir sonda tarayarak sulu veya kurutulmuş EVs4,5,6 üç boyutlu topografya görselleştirir. EVs'i AFM ile karakterize etmek için protokolün temel adımları bu çalışmada özetlenmiştir. Sıvı vezikülleri görüntülemeden önce, bir substrat üzerinde ya işlevsel bir yüzeye tethering tarafından immobilize edilmelidir, bir filtre içinde bindirme, ya da elektrostatik çekim7. Pozitif yüklü bir substrat üzerindeki elektrostatik fiksasyon, negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların immobilizasyonu için özellikle uygun bir seçenektir. Ancak, yüzeydeki hücre dışı vezikülleri hareketsiz hale getiren aynı elektrostatik kuvvetler de şekillerini bozar, bu da post-görüntüleme veri analizini gerekli kılar. Bu noktayı, yüzeyde hareketsiz hale getirilen ekzozomların çarpık şekli ne kadar çarpık şekli ne kadar aparat lara dayanarak çözümdeki küresel veziküllerin boyutunu tahmin eden algoritmayı tanımlayarak ayrıntılı olarak ele alıyoruz.

Geliştirilen protokolde, veziküllerin sağlam elektrostatik immobilizasyonu için prosedür sunulur ve sulu veya kurutulmuş durumlarda atomik kuvvet görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli adımları takip eder. Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonunu etkileyen faktörler tanımlanır. Çözeltide farklı yoğunlukta EV'lere sahip numuneler için elektrostatik immobilizasyonun nasıl gerçekleştirilenekadar gerçekleştirildiği konusunda kılavuz verilir. Yeterince çok sayıda hareketsiz veziküle dayalı farklı biyofiziksel özelliklerin ampirik olasılık dağılımlarının tahmin edilmesine izin veren deneysel koşulların seçimi tartışılmıştır. AFM verilerinin post-görüntüleme analiziörnekleri verilmiştir. Özellikle, immobilize EVs AFM karakterizasyonu dayalı çözüm veziküllerin boyutunu belirlemek için bir algoritma açıklanmıştır. Temsili sonuçlar, AFM tarafından kriyo-TEM görüntüleme sonuçları ile vezikül boyutlandırmasının tutarlılığını göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. EVs bir biyosıvı dan izolasyon

  1. Diferansiyel ultrasantrifüj8,yağış veya boyut dışlama kromatografisi9gibi yerleşik yöntemlerden biri ile EVs izole .
  2. Beklenen yüzey ve luminal biyobelirteçlerin varlığını ve preparatın çapraz kontaminasyonunu gösteren biyobelirteçlerin eksikliğini doğrulayın. Elektron mikroskobu ile izole edilmiş parçacıkların lipid çift katmanlı morfolojisini doğrulayın.
    NOT: Ekzozomları izole ederken, nanopartikül izleme analizi (NTA) veya dinamik ışık saçılımı ile ölçülen hidrodinamik boyut dağılımı beklenen aralıkta olmalıdır. EV ve ekzozom yalıtımı ayrıntıları bu protokolün kapsamı dışındadır. Seçilen yöntem deneysel sorulara ve çalışmanın amacına bağlıdır10. Aşağıdaki adımlar, ticari olarak mevcut bir yağış kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak MCF-7 meme kanseri hücrelerinin büyüme ortamı ndan yağış ile ekzozomları zenginleştirmek için prosedürün somut bir örnek sağlar.
  3. Hücre kültürü genişlemeden önce, sıvı azot MCF-7 meme kanseri hücreleri saklayın. Hücreleri alt kültüre eritin.
  4. Aseptik uygulamaları takiben, 150 mm plakaüzerinde hücre kaplaması yapın. Eagle'ın minimum esansiyel orta, 0.01 mg/mL insan rekombinant insülinve %10 ekzozomsuz fetal sığır serumundan oluşan büyüme ortamını kullanın.
  5. Kültürü %95 hava ve %5 CO2 ile derecelendirin ve 37 °C'dekuluçkaya yatırın.
  6. Hücreler yerleştikten sonra (kaplamadan yaklaşık 24 saat sonra), ortamı değiştirin. Plakayı 1:10 oranında bölün ve her biri 20 mL ortam içeren on plakayı kültüre alın.
  7. Bu plakaların 9'undan (180 mL) ~70−%80'inde hücreler büyüme aşamasındayken biraraya gelen hasat ve havuz ortamı.
  8. Ortamı 60 mL ve 120 mL'ye bölün, 30 mL/tüpe bölünve 3000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
  9. Her tüpten süpernatant'ı yeni bir steril 50 mL tüpe aktarın ve ekzozom izolasyonunu gerçekleştirin.
  10. Yayınlanan protokollere göre ekzozomları yağışla izole edin (örneğin, referans11)veya ticari bir izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanılıyorsaüreticinintalimatlarına uyun. İkinci durumda ilk adım olarak, 15 dk için 3.000 x g santrifüj hücre orta.
  11. Çökeltme çözeltisini (1:5 hacim oranı) supernatant'a ekleyin, karıştırın ve bir gecede soğutun.
  12. Oda sıcaklığında 30 dk için 1.500 x g santrifüj. Santrifüjden sonra supernatant atın.
  13. Kalan ekzozom peletini 1.500 x g'da5 dk daha döndürün. Pelet rahatsız etmeden, aspirasyon ile kalan yağış çözeltisi çıkarın.
  14. Peleti 100−500 μL'lik 1x fosfat tamponlu salin (PBS) tamponuna yeniden askıya alın ve aşağı akım analizi için gerektiği gibi birden fazla aliquot'a bölün.
  15. AFM görüntüleme için izole ekzozomların yüzeye hemen immobilizasyonuna geçin. Gerekirse, dondurma-çözülme döngüsü sırasında numunenin zarar görmesini önlemek için önlemler alırken daha sonra kullanım için -80 °C'de aliquots dondurun.

2. Hücre dışı veziküllerin yüzey fiksasyonu

  1. AFM/taramalı tünel mikroskobu (STM) manyetik paslanmaz çelik numune diskine mika diski sıkıca takmak için güçlü çift taraflı bant, epoksi veya alternatif bir yapıştırıcı kullanın.
  2. Mika diskini keskin bir jilet veya yardımcı bıçak kullanarak veya üst yüzeye yapışkan bant takarak ve daha sonra bir malzeme tabakasını çıkarmak için kırparak ayırın.
    NOT: Her iki yöntem de daha önce ortama maruz kalmış ince bir mika tabakasını çıkararak bakire bir yüzey ortaya çıkarmalıdır. İşlemden sonra mikanın AFM/STM metal numune diskine bağlanması sağlam kalmalıdır.
  3. Oda sıcaklığında, mikanın üst yüzeyini 10 00 000 l 100 mM NiCl2 çözeltisi ile tedavi edin, bu da yüzey yükünü negatiften pozitife değiştirin.
  4. Tüy bırakmayan silme veya lekeleme kağıdı ile Blot NiCl2 çözeltisi. Mika yüzeyini deiyonize (DI) suyla 3 kat yıkayın ve kuru bir azot akışı ile kurulayın.
    NOT: Modifiye edilmiş yüzeyi AFM ile tarayabilmek ve kirletici maddelerden arındırılmış olduğunu doğrulamak iyi bir uygulamadır.
  5. AFM numune diskini bağlı yüzeymodifiye mikaile bir petri kabına yerleştirin.
  6. Çözeltinin mL başına 4,0 x 109 ile 4,0 x10 10 10 partikülarasında bir konsantrasyon elde etmek için 1x PBS ile 1.14 adımdan ekzozom numunesini seyreltin. NTA kullanarak seyreltilmiş parçacık konsantrasyonu doğrulayın.
  7. Seyreltilmiş ekzozom çözeltisinin 100 μL'sini pipetten boşaltarak mika yüzeyinde sessile bir damla oluşturun.
  8. Petri kabının kapağını yerleştirin ve numune buharlaşmasını azaltmak için bir parafin filmi ile kapatın. Numuneyi 4 °C'de 12−18 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Hareketsiz ekzozomların yüzey yoğunluğu, kuluçka süresi ve sıvıdaki EV konsantrasyonu ile artacaktır. Numunede daha düşük konsantrasyonlarda ekzozomlar varsa daha uzun kuluçka süresi gerekebilir.
  9. Kuluçkadan sonra, yüzeyi bozmadan numunenin %80−90'ını aspire edin. Bu noktada, ekzozomlar mika substrat üzerinde elektrostatik olarak hareketsiz hale gelecektir.
  10. Sulu EV'leri görüntülemeden önce yüzeyi 1x PBS ile durula. 3x'i tekrarlayın. Durulama işlemi boyunca numunenin sulu tutulmasına özen tin.
  11. Mika yüzeyini 1x PBS ile yıkadıktan sonra numuneyi kapsayacak şekilde %80−sıvının %90'ını ve pipet ~40 μL taze 1x PBS'yi çıkarın.
  12. Kurutulmuş EVs görüntülerken, DI su ile substrat durulayın. 3x'i tekrarlayın.
    NOT: DI suyu ile durulama tuz kristalleri oluşumunu ve yüzeyde solutes birikimini önleyecektir substrat kurur gibi.
  13. Kurutulmuş EVs görüntüleme önce, yüzeye dokunmadan mümkün olduğunca çok sıvı aspire ve kuru azot akışı ile geri kalanı kuru.

3. AFM görüntüleme

  1. Kurutulmuş EVs görüntü için, dokunarak ve temassız görüntüleme modlarında havada tarama için tasarlanmış bir cantilever seçin ve sonda tutucu üzerine monte.
    NOT: Mevcut AFM enstrümantasyonuile uyumlu bir prob seçerken Malzeme Tablosu'nda listelenen bir örnek kantilinin özellikleri (123 μm uzunluk, 40 μm genişlik, 7 nm uç yarıçapı ve 37 N/m yay sabiti) kılavuz olarak kullanılabilir.
    1. AFM sahnesine 2.13. Manyetik paslanmaz çelik numune diski, numuneyi sahnede hareketsiz hale getirecektir. Hazırlık ve sahne termal olarak dengelemek için zaman bekleyin.
    2. Mika'nın yüzeyinin yeterince geniş bir alanını tmak için dokunma modunu kullanın. Örneğin, 5 x 5 μm'lik bir alan seçin, 512 satırda ~1 Hz'lik bir taramaya alın. Topografya ve numunenin yüzey özellikleri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağladıkları için hem yükseklik hem de faz görüntüleri edinin.
      NOT: Görüntülenmiş alan ve görüntüyü oluşturmak için seçilen satır sayısı ile tarama süresi artacaktır ancak saniyede taranmış satır sayısı olarak tanımlanan tarama hızı azalır. Hızlı tetkik hızları görüntü kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, rastering hızı yargı edinim süresi ve görüntü kalitesi arasındaki dengeyi dengelemelidir.
  2. Sulu vezikülleri görüntülemek için yumuşak, sulu numuneleri taramak için uygun bir kantil i seçin ve kantili sıvılarda tarama için tasarlanmış bir sonda tutucuya monte edin.
    NOT: Mevcut AFM enstrümantasyonuile uyumlu bir prob seçerken, Malzeme Tablosu'nda listelenen probun özellikleri (175 μm nominal uzunlukta üçgen kantil, 22 μm genişlik, 20 nm uç yarıçapı, 0,07 N/m yay sabiti ve 4 ila 8 kHz aralığında sürücü frekansı ile görüntüleme için optimize) bir kılavuz olarak kullanılabilir.
    1. Tarama sırasında sıvıya hava kabarcıkları girme olasılığını azaltmak için kantilin ucunu 1x PBS ile ısla.
    2. AFM sahnesine 2.11.adımdan gelen hazırlığı yerleştirin. Manyetik paslanmaz çelik numune diski, yüzeyinde immobilize eVs içeren ekli mika hareketsiz hale getirecektir.
    3. Hazırlık ve AFM aşamasının termal olarak dengelemesine zaman verin.
    4. Dokunma modunda sulu mika yüzeyini görüntüleyin. Hem yükseklik hem de faz görüntülerini edinin.
      NOT: Görüntüleme kalitesi enstrümantasyon, seçili prob ve tetkik parametrelerinden etkilenir. Tarama koşulları optimize edilirken, aşağıdaki seçenekler başlangıç noktası olarak kullanılabilir: 5 x 5 μm alan ~0.8-1.0 Hz tarama hızı ve 4 ila 8 kHz arasında sürücü frekansı ile 512 satırda taranmış.

4. Görüntü analizi

NOT: Elde edilen yükseklik görüntülerine aşağıdaki veri işleme ve analiz adımları uygulanır. Benzer bir yordam faz verilerini çözümlemek için uyarlanabilir. Aşağıdaki açıklama Gwyddion12,gnu Genel Kamu Lisansı altında kullanılabilir ücretsiz ve açık kaynak yazılım için özeldir. Benzer özellikler alternatif yazılım araçlarında mevcuttur.

  1. Veri İşlemi, SPM modları, İpucu gidin ve Model İpucu (Şekil 2)seçin. Örneği tarayıp Tamam'ıtıklatın.
  2. Yüzey rekonstrüksiyonu gerçekleştirerek uç erozyonu yapılarını düzeltin. Görüntüyü açın. Menüden Veri İşlemi, SPM modları, İpucu,ardından Yüzey Yeniden Yapılandırmasını seçin ve Tamam 'ı(Şekil 3)tıklatın.
  3. Görüntüleme düzlemini, alt tabakadaki eğimi taraya verisinden çıkararak laboratuvar XY düzlemine uyacak şekilde hizala. Bu görevi gerçekleştirmek için Veri İşlemi, Düzey'i seçin ve Düzlem Düzeyi 'ni seçin (Şekil 4).
  4. Veri İşlemi, Verileri Düzelt'i seçerek görüntünün satırlarını hizalayın ve ardından Satırları Hizala'yıseçin. Çeşitli hizalama seçenekleri mevcuttur (Şekil 5). Örneğin, Ortanca, her tbmm satırının ortalama yüksekliğini bulan ve verilerden çıkaran bir algoritmadır.
  5. Veri İşlemi,Verileri Düzelt ve yara izi olarak bilinen yaygın tarama hatalarını ortadan kaldıran Scars (Şekil 6)seçeneğini belirleyin.
  6. Mika yüzeyini sıfır yükseklikte hizala, Z = 0, Veri İşlemi'nden erişilebilen Seviye açılır menüsünde Düztaban Tabanı'nı seçerek(Şekil 7).
  7. Tanecikler açılır menüsünde Eşik tarafından İşaretle kullanarak taranmış yüzeydeki EV'leritanımlayın (Şekil 8A). Bu algoritma, yüzeyimsiz ekzozomları, sıfır yüzey yüzeyi yüzeyinden kullanıcı tarafından seçilen eşiğin üzerindeki yüksekliğe göre çıkıntılı parçacıklar olarak tanımlar. 1 ile 3 nm arasındaki aralıkta, arka plan parazitinin çoğunu ortadan kaldıracak bir eşik seçin. Daha küçük eşikler daha temiz arka plan ile kullanılır.
    NOT: Şekil 8A'daki eşik 1.767 nm'dir. Bu eşik ile MCF-7 ekzozom tanımlamasonucu Şekil 8B'degösterilmiştir. Gwyddion otomatik eşik (Otsu yöntemi), kenar algılama ve havza algoritması da dahil olmak üzere görüntüdeki vezikülleri otomatik olarak tanımlamak için algoritma olarak eşik çeşitli alternatifler sunuyor.
    NOT: Parçacık aglomeraları, AFM görüntüde mevcutsa, maskelenebilir ve analizdışı edilebilir.
  8. Tanecikler menüsünden erişilebilen kullanılabilir Dağılımalgoritmalarını kullanarak tanımlanan EVs'lerin geometrik ve boyutsal karakterizasyonunu gerçekleştirin.
    NOT: Gwyddion, scalar değerli, areal, volumetrik ve immobilize edilmiş EVs'nin diğer özelliklerinin sulu veya susuz bir durumda dağılımını değerlendirmek için araçlar sağlar. Skaler değerler özelliğinin bir örneği Şekil 9'da gösterilmiştir ve bu da tanımlanan her ekzomun ayak izi içindeki maksimum yüksekliklerin dağılımını verir.
  9. Diğer hesaplama araçları ve özel bilgisayar programları tarafından özel analiz için Gwyddion'dan AFM verilerini dışa aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

EVs yüzey fiksasyonu görüntüleme dizisinde kritik bir adımdır. Negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların elektrostatik yüzey immobilizasyonu mikanın substratı pozitif yüzey yüküne sahip olacak şekilde değiştirildikten sonra sağlam bir şekilde ortaya çıkar. NiCl2 ile pozitif yüzey değişiklikleri sağlamak için tedavi olmadan, substrat üzerinde EVs immobilizasyon etkisiz olduğu bulunmuştur. Şekil 10A'dakiyükseklik görüntüsü, PBS'nin mL başına 2,59 x 1010...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

EVs'nin biyolojik bir sıvıdan immobilizasyonu, yüzey taraması ve görüntü analizi, sıvı daki EV'lerin AFM karakterizasyonu için geliştirilen protokolün temel adımlarıdır. Görüntülenmiş yüzey alanı ve substrat üzerinde immobilize veziküllerin yüzey konsantrasyonu ile AFM görüntüleme ölçekler için uygun veziküllerin sayısı. EVs ve ekzozomlar18negatif zeta potansiyeli göz önüne alındığında, biz AFM substrat sıvı numunelerden EVs elektrostatik fiksasyon savunucusu. Immobilizasyon, yüzey pozitif yüklü o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Ulusal Bilim Vakfı (ödül numarası IGERT-0903715), Utah Üniversitesi (Kimya Mühendisliği Tohum Hibe ve Lisansüstü Araştırma Bursu Ödülü Bölümü) ve Skolkovo Bilim Enstitüsü mali destek kabul ve Teknoloji (Skoltech Bursu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AFM/STM Kontrol Cihazı BrukerÇok Modlu Nanoskop VBu AFM kontrolörü, sıvı ve havadaki biyolojik numunelerin görüntülenmesini destekler.
AFM/STM metal numune diskleri (10 mm)TedPella16207Mika diskin çift taraflı bant veya başka bir yöntemle tutturulduğu metal numune diski.
AFM/STM Mika diskler (10 mm)TedPella50En yüksek kalite sınıfı V1 mika, 0,21 mm (0,0085 inç) kalınlık. Serpiştirilmiş, 10'lu paketler halinde. AFM/STM disklere monte edilebilir. Havada görüntüleme için dört çapta AFM
probuBrukerTESP-V2Havada tarama için kılavuz çekme modu ve temassız mod için yüksek kaliteli kazınmış silikon problar.
BrukerMLCT'deyumuşak numune görüntüleme için AFM probuSıvı çalışma için çok uygun olan silisyum nitrür uçlu yumuşak silisyum nitrür konsollar. Kuvvet sabitlerindeki aralık, kullanıcıların temas modunda ve ayrıca yüksek yüke karşı mesafe spektroskopisinde son derece yumuşak numuneleri görüntülemesini sağlar.
Çift taraflı bantSpectrum360-77705Mika diski metal numune diskine sabitlemek için kullanılır.
ExoQuick-TCSystem BiosciencesEXOTC50A-1ExoQuick-TC, doku kültürü ortamından eksozom izolasyonu için tasarlanmış tescilli bir polimer bazlı kittir.
Sıvı Bruker'de görüntüleme için cam prob AFM tutucu  MTFML-V2Bu cam prob tutucu, MultiMode AFM ile sıvı taraması için tasarlanmıştır. Tutucu, tepe kuvveti dokunma modunda, temas modunda, kılavuz çekme modunda ve kuvvet modülasyonunda kullanılabilir. Prob, daha büyük genlik modülasyonu için ayrı bir piezo osilatör tarafından akustik olarak tahrik edilir. Tutucu, sıvı eklemek ve çıkarmak için iki bağlantı noktası, gerekli bağlantı parçaları ve aksesuar kiti ile birlikte verilir.
GwyddionÇek Metroloji Enstitüsü.Sürüm 2.52Taramalı prob mikroskobu teknikleriyle elde edilen veri alanlarının görselleştirilmesi ve analizi için Açık Kaynak yazılım.
Tüy bırakmayan kurutma kağıdıGE Healthcare Whatman Sınıf GB003 Kurutma KağıdıMika'nın alt tabakasının modifikasyonundan sonra NiCl2 çıkarmak için bu kurutma kağıdını kullanın.  
Tüy bırakmayan temiz oda mendilleriTexwipeAlphaWipe TX1004Yüzey temizliği için bu polyester mendilleri kullanın.
Nikel(II) klorür (NiCl2)Sigma-Aldrich339350DI suda 10 mM NiCl2 yapmak için kullanılan toz
Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (1x)Gibco10010023PBS, pH 7.4
Sıvı

Kaynaklar

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001(2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603(2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ekzozom GörüntülemeVezikül BoyutlandırmaElektrostatik İmmobilizasyonMika Yüzey ModifikasyonuHidrate Numune AnaliziDesikate Numune AnaliziAFM Veri İşlemeCryoTEM Karşılaştırması
Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.