Yöntem makalesi
Sıvı numunelerden ekzozomların ve hücre dışı veziküllerin etiketsiz immobilizasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntülenmesi için adım adım bir prosedür tanımlanmıştır. AFM görüntüleri çözeltideki veziküllerin boyutunu tahmin etmek ve diğer biyofiziksel özellikleri karakterize etmek için kullanılır.
Ekzozomlar ve diğer ekstrasellüler (EVs) lipid membran vezikül, membran proteinleri ve diğer moleküller tarafından yüzey dekorasyonu ve rna içeren bir ana hücreden miras farklı luminal içeriği oluşan moleküler kompleksleri, proteinler ve DNA'lar. Vezikülboyutuna ve yüzey süslemelerinden oluşan koronal tabakasının büyüklüğüne bağlı olarak EV'lerin hidrodinamik boyutlarının karakterizasyonu rutin hale gelmiştir. Exozomlar için, EVs en küçük, hidrodinamik ve vezikülboyutları arasındaki göreli fark önemlidir. Vezikül boyutlarının kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme siperasyonu, altın standart bir teknik olan, cihazın maliyeti, numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi ve sık sık görüntülerde gözlenen parçacıkların az sayıda. Yaygın olarak kullanılabilir ve erişilebilir bir alternatif atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu geometri, boyut ve ekstrahücre içi veziküllerin diğer biyofiziksel özellikleri hakkında çok yönlü veri üretebilir. Geliştirilen protokol, bu analitik aracı kullanırken kullanıcılara rehberlik eder ve AFM tarafından EVs analizi için iş akışını özetler, bu da sulu veya kurutulmuş formdaki görüntüleme E'leri için numune hazırlamasını içerir, elektrostatik immobilizasyon bir substrat, veri toplama, analizi ve yorumlanması üzerine veziküller. Temsili sonuçlar, modifiye mika yüzeyindeki EV fiksasyonunun öngörülebilir, özelleştirilebilir olduğunu ve kullanıcının çok sayıda vezikül için boyutlandırma sonuçları elde etmesini sağladığını göstermektedir. AFM verilerine dayalı vezikül boyutlandırmasının kriyo-TEM görüntüleme ile uyumlu olduğu bulunmuştur.
Ekstrasellüler veziküller (EVs) kan, idrar, tükürük, süt ve amniyotik sıvı da dahil olmak üzere tüm vücut sıvıları mevcuttur. Ekzozomlar, endozomal biyogenez, endozomal yolun belirteçleri ve tüm EV'ler arasında en küçük boyut ile diğer EV'lerden farklılaşan bir bölge sınıfı oluştururlar. Ekzozomların büyüklüğü genellikle çalışmalar arasında önemli bir değişkenlik ile bildirilmiştir. Boyutlandırma sonuçlarının yönteme bağımlı olduğu, ev boyutlarını tahmin etmek için farklı analitik tekniklerle kullanılan fiziksel ilkeler arasındaki farkı yansıttığı bulunmuştur1,2. Örneğin, nanopartikül izleme analizi (NTA) ― en....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. EVs bir biyosıvı dan izolasyon
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
EVs yüzey fiksasyonu görüntüleme dizisinde kritik bir adımdır. Negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların elektrostatik yüzey immobilizasyonu mikanın substratı pozitif yüzey yüküne sahip olacak şekilde değiştirildikten sonra sağlam bir şekilde ortaya çıkar. NiCl2 ile pozitif yüzey değişiklikleri sağlamak için tedavi olmadan, substrat üzerinde EVs immobilizasyon etkisiz olduğu bulunmuştur. Şekil 10A'dakiyükseklik görüntüsü, PBS'nin mL başına 2,59 x 1010.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
EVs'nin biyolojik bir sıvıdan immobilizasyonu, yüzey taraması ve görüntü analizi, sıvı daki EV'lerin AFM karakterizasyonu için geliştirilen protokolün temel adımlarıdır. Görüntülenmiş yüzey alanı ve substrat üzerinde immobilize veziküllerin yüzey konsantrasyonu ile AFM görüntüleme ölçekler için uygun veziküllerin sayısı. EVs ve ekzozomlar18negatif zeta potansiyeli göz önüne alındığında, biz AFM substrat sıvı numunelerden EVs elektrostatik fiksasyon savunucusu. Immobilizasyon, yüzey pozitif yüklü o.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Yazarlar Ulusal Bilim Vakfı (ödül numarası IGERT-0903715), Utah Üniversitesi (Kimya Mühendisliği Tohum Hibe ve Lisansüstü Araştırma Bursu Ödülü Bölümü) ve Skolkovo Bilim Enstitüsü mali destek kabul ve Teknoloji (Skoltech Bursu).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AFM/STM Kontrol Cihazı | Bruker | Çok Modlu Nanoskop V | Bu AFM kontrolörü, sıvı ve havadaki biyolojik numunelerin görüntülenmesini destekler. |
| AFM/STM metal numune diskleri (10 mm) | TedPella | 16207 | Mika diskin çift taraflı bant veya başka bir yöntemle tutturulduğu metal numune diski. |
| AFM/STM Mika diskler (10 mm) | TedPella | 50 | En yüksek kalite sınıfı V1 mika, 0,21 mm (0,0085 inç) kalınlık. Serpiştirilmiş, 10'lu paketler halinde. AFM/STM disklere monte edilebilir. Havada görüntüleme için dört çapta AFM |
| probu | Bruker | TESP-V2 | Havada tarama için kılavuz çekme modu ve temassız mod için yüksek kaliteli kazınmış silikon problar. |
| Bruker | MLCT'de | yumuşak numune görüntüleme için AFM probu | Sıvı çalışma için çok uygun olan silisyum nitrür uçlu yumuşak silisyum nitrür konsollar. Kuvvet sabitlerindeki aralık, kullanıcıların temas modunda ve ayrıca yüksek yüke karşı mesafe spektroskopisinde son derece yumuşak numuneleri görüntülemesini sağlar. |
| Çift taraflı bant | Spectrum | 360-77705 | Mika diski metal numune diskine sabitlemek için kullanılır. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC, doku kültürü ortamından eksozom izolasyonu için tasarlanmış tescilli bir polimer bazlı kittir. |
| Sıvı Bruker'de görüntüleme için cam prob AFM tutucu | MTFML-V2 | Bu cam prob tutucu, MultiMode AFM ile sıvı taraması için tasarlanmıştır. Tutucu, tepe kuvveti dokunma modunda, temas modunda, kılavuz çekme modunda ve kuvvet modülasyonunda kullanılabilir. Prob, daha büyük genlik modülasyonu için ayrı bir piezo osilatör tarafından akustik olarak tahrik edilir. Tutucu, sıvı eklemek ve çıkarmak için iki bağlantı noktası, gerekli bağlantı parçaları ve aksesuar kiti ile birlikte verilir. | |
| Gwyddion | Çek Metroloji Enstitüsü. | Sürüm 2.52 | Taramalı prob mikroskobu teknikleriyle elde edilen veri alanlarının görselleştirilmesi ve analizi için Açık Kaynak yazılım. |
| Tüy bırakmayan kurutma kağıdı | GE Healthcare Whatman | Sınıf GB003 Kurutma Kağıdı | Mika'nın alt tabakasının modifikasyonundan sonra NiCl2 çıkarmak için bu kurutma kağıdını kullanın. |
| Tüy bırakmayan temiz oda mendilleri | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Yüzey temizliği için bu polyester mendilleri kullanın. |
| Nikel(II) klorür (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | DI suda 10 mM NiCl2 yapmak için kullanılan toz |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste