Mitokondrial solunum zinciri kompleksleri kültürlü insan hücrelerinde mavi yerli Polyacrylamide Jel Elektroforez ve Immunoblotting kullanarak Analizi

Özet

Bu iletişim kuralı tarafından mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez mitokondrial solunum zinciri kompleksleri analizini gösterir. Burada kültürlü insan hücrelerine uygulanan yöntem açıklanmıştır.

Özet

Mitokondrial solunum Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kompleksleri mitokondri içinde tarafından gerçekleştirilir. İç ve çevresel faktörler OXPHOS kompleksleri kararlılığını ve derleme huzursuz. Bu iletişim kuralı mitokondrial solunum zinciri kompleksleri analizini kültürlü insan hücreleri uygulamaya mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) tarafından açıklanır. Önce mitokondri digitonin kullanarak hücrelerden ayıklanır sonra loril maltoside kullanarak, bozulmamış OXPHOS kompleksleri mitokondrial membranlar izole edilmiştir. OXPHOS kompleksleri sonra degrade jel elektroforez olumsuz dolu boya, Coomassie mavi, protein toplama engeller ve elektroforetik protein kompleksleri katot doğru hareketliliğini sağlar huzurunda tarafından çözümlenir. Son olarak, OXPHOS kompleksleri standart immunoblotting tarafından tespit edilir. Böylece, BN-sayfa temel SDS-sayfa yalnızca bireysel OXPHOS karmaşık alt birimleri çalışma izin aksine tüm OXPHOS kompleksleri Meclisi değerlendirmek için kullanılan bir uygun ve ucuz tekniğidir.

Giriş

Mitokondri çok fonksiyonlu organelleri enerji üretiminde, sinyal, apoptozis, yaşlanma, vb^1,2,3hücresel metabolizma düzenlenmesi önemli bir rol vardır. Mitokondri enerji üretiminde solunum ATP sentezi ile çiftler Oksidatif fosforilasyon işlevini kullanır. İnsan hücrelerinde beş kompleksleri mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon sistem (OXPHOS) oluşur. Konut projeleri ı-IV tarafından karmaşık V ATP üretmek için kullanılan mitokondriyal intermembrane uzayda bir elektrokimyasal proton degrade oluşturun. Her OXPHOS karmaşık multimeric olduğunu ve karmaşık II dışında nükleer ve mitokondrial genler tarafından kodlanmış altbirimden oluşur. Mutasyonlar veya çevresel stres neden OXPHOS kompleksleri çekirdek bileşenlerinin herhangi bir kusurun derleme ve Oksidatif fosforilasyon sisteminin işlevselliğini şekilde huzursuz. Buna ek olarak, işlev OXPHOS kompleksleri uygun montaj montaj faktörler^4,5,6, çok sayıda gerektirir.

Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) olduğu gibi protein kompleksleri analizini sağlayan bir temel teknik ve Meclisi OXPHOS kompleksleri, çalışma için kullanılabilir. İlk olarak, mitokondri hücrelerden digitonin tarafından hangi hücrelerin plazma zarı permeabilizes hafif bir deterjan olduğunu izole edilmiştir. Sonra loril maltoside kullanarak, OXPHOS kompleksleri mitokondrial membranlar salınır. Degrade jel elektroforez kullanarak, OXPHOS kompleksleri onların kitle göre ayrılır. Örnek arabellek ve mavi katot tampon mavi G-250 (değil R-250) eklendi Coomassie deterjan değişken dernekler ayrışıp ancak bireysel solunum zinciri kompleksleri sağlam⁸korur. Elektroforez sırasında boya içeren mavi katot arabellek katot arabellek PVDF membran⁸OXPHOS kompleksleri ve verimli aktarımı sağlar boya olmadan değiştirilir. OXPHOS kompleksleri görselleştirmek için PVDF membran sırayla beş OXPHOS kompleksleri seçili alt birimleri için karşılık gelen antikorlar ile inkübe.

Burada bazı değişiklikler ile açıklanan yöntemi herhangi bir kültürlü hücrelere uygulanabilir. Buna ek olarak, bu yöntem OXPHOS kompleksleri doku örnekleri⁹' dan izole mitokondri içinde çözümlenmesi için kullanılabilir. BN-sayfa başına her örnek için en az 5-10 µg mitokondri, gerektirir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, 500.000 hücreleri HEK293, SH-SY5Y gibi kültürlü veya 143B hücreleri yaklaşık 10 µg mitokondri yol açabilir. Ancak, hücre BN analiz için yeterli miktarda belirli hücre türüne göre değişir.

Mitokondriyal OXPHOS proteinler çalışmaya en yaygın yöntem SDS-sayfa ve western Blot değildir. Ancak, SDS-sayfa yalnızca bireysel OXPHOS alt birimleri eğitim sağlar ve BN-sayfa aksine, tüm OXPHOS kompleksleri Meclisi değerlendirmek için kullanılamaz. Protein kompleksleri yerel şartları olumsuz dolu boya olmaksızın açık yerli-sayfa ayıran ve önemli ölçüde daha düşük bir çözünürlük BN-sayfasına göre vardır. Ancak, açık yerli-sayfa BN-sayfa hafif bu nedenle protein kompleksleri altında BN-sayfa koşullar¹⁰ayrışmış OXPHOS supercomplexes gibi değişken supramolecular derlemeler koruyabilirsiniz. Bu protokol için degrade jel kompleksleri ayırmak için kullanılır; nispeten pahalı degrade makinesi kullanılabilir¹¹değilse ancak, alternatif olarak, degrade ayrılık kullanılabilir.

Önemli burada açıklanan yöntemi kompleksleri işlevselliğini değil değerlendirilir iken OXPHOS kompleksleri, Meclisi analiz sağlar. Yüksek çözünürlüklü bir BN-sayfa jel faaliyet tahlil¹¹ yanı sıra spektrofotometrik enzimatik aktivite assay mitokondrial kompleksleri¹² takip OXPHOS kompleksleri fonksiyonel analizi için etkili teknikler vardır. Ancak, bu yöntemlerin her ikisi de OXPHOS kompleksleri Meclisi tahlil değil.

Böylece, BN-sayfa bireysel OXPHOS kompleksleri Meclisi araştırmak için en iyi yöntemdir. Örneğin, Leber kalıtsal optik nöropati (LHON), laktik asidoz ve inme gibi bölümleri (MELAS), mitokondrial ensefalopati gibi bazı mitokondrial bozukluklar OXPHOS bir veya daha fazla bileşen değişmiş derleme ile ilişkili Sistem⁵. BN-sayfa yöntem tanımlamak burada kullanarak, mitokondriyal hastalıklar moleküler mekanizmaları okudu olabilir.

Protokol

spaNOTE: Bu protokolü Hilander vd.¹³ ile ilişkili bir yayın üzerinde dayanır.

1. hazırlanması arabellekleri ve çözümleri

Not: Tüm arabellekleri ve çözümleri iletişim kuralında kullanılan Tablo 1' de özetlenmiştir. Arabellekleri belirli miktarda hazırlamak ve 10 örnekleri çalıştırmak yeterlidir. Tüm arabellekleri 4 ° C'de bir yıl süreyle saklanır.

1. 3 x 1.5 M aminocaproic asit, 150 mM Bis-tris distile su (dH₂O) içeren jel arabellek 20 mL hazırlayın. PH 7,0 için ayarlayın.
2. 2 M aminocaproic asit dH₂O. 10 mL hazırlamak
3. 1 mL mitokondrial arabelleği aşağıdakileri birleştirerek hazırlamak: 3 x jel arabellek, 2 M aminocaproic asit 0.5 mL ve 500 mm EDTA 4 µL 0.5 mL.
4. 15 mM Bis-tris ve tricine dH₂O. ayarlama pH 7. 0, 50 mM içeren katot arabelleği 1000 mL hazırlayın.
   1. 200 mL mavi katot arabelleği katot arabellek için 200 mL Coomassie mavi G-250 0,04 g ekleyerek hazırlayın.
5. 1000 mL 50 mM Bis-tris dH₂O. ayarlama pH 7. 0'deki içeren anot arabelleği hazırlayın.
6. 750 mM aminocaproic asit ve % 5 Coomassie mavi içeren örnek arabelleği 2.5 mL hazırlamak dH₂O. G-250

2. mitokondriyal lysates hazırlanması

1. Hücreleri koleksiyonu önceki gün plaka. HEK293 veya 143B hücreler için kullanım Dulbecco'nın % 10 fetal Sığır serum, 1 L-glutamine, 100 mg/mL penisilin ve % 100 mg/mL streptomisin ile kartal Orta (DMEM) değiştiren. Bir hücre kültür kuluçka 37 derece ° c % 5 CO₂ oksijen atmosferde hücrelerin büyümesine. Koleksiyon günde en az 500.000 hücreler her örnek için olduğundan emin olun.
2. Yavaşça hücreler buz gibi PBS ile yıkayın. Plaka hücrelerden ayırma kaçının. Hücreleri scrape ve onları vasıl 800 x g 4 ° C'de 10 dakika için cips
3. Hücre Pelet buz gibi PBS ile iki kez yıkama ve adım 2.2 olduğu gibi santrifüj kapasitesi. Protein konsantrasyonu ticari bir seti kullanarak Bradford yöntemiyle ölçmek. Hücreleri 800 x g 4 ° C'de 10 dakika için de cips
   Not: Hücre toplama sonra 4 ° C'de tüm adımlarını gerçekleştirin ve değil girdap yapmak.
4. PBS 20 mL proteaz inhibitörü ile PBS için 20 mL 100 x proteaz inhibitörü 200 µL ekleyerek hazırlayın. Buz üstünde tutun. PBS hücrelerde proteaz inhibitörü olarak 5 mg/mL son protein konsantrasyonu ile resuspend.
   1. Senaryo Özeti 5 mg/mL resuspend için gerekli proteaz inhibitörü ile PBS hacmi hesaplamak için her örnek protein tutarı hesaplamak. Bu hesaplama için adım 2.3 ve PBS hücreleri adım 2.3 yıkama sonrası resuspend için kullanılan birim cinsinden protein konsantrasyonu kullanın.
5. PBS içinde 3,3 mM digitonin proteaz inhibitörü ile 1 mL hazırlayın. 3.3 mM digitonin 1.65 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. Mix iyi ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
   1. PBS içinde 3,3 mM digitonin proteaz inhibitörü ile 1 mL hazırlamak için hiçbir çökelti buza hemen görünür ve serin kadar PBS 1 ml 100 ° C'de digitonin 4 mg geçiyoruz. 100 x proteaz inhibitörü 10 µL 1 mL digitonin çözeltisi ekleyin.
      Not: sadece digitonin taze bir çözüm kullanın.
      Dikkat: Digitonin zehirlidir! Bir yüz maskesi, eldiven ve önlük kullanın.
6. PBS İndinavir inhibitörü (2.4 adımda hazırlanan) 1,5 mL son hacim için ekleyin. 10.000 x g, santrifüj 10 min için + 4 ° c Süpernatant kaldırın. Bu adımda, mitokondri pelleted.
7. Mitokondrial Pelet mitokondrial arabellekte resuspend. Mitokondrial arabelleği PBS birimin adım 2.4 birimdir.
8. Proteaz inhibitörü (2.4 adımda hazırlanan) içeren PBS taze % 10 loril maltoside hazırlayın. 1 mL 10 örnekler için yeterlidir. % 10 loril maltoside için % 1'lik konsantrasyon son ekleyin. (Bu adım-ebilmek var olmak birkaç saat kadar daha uzun) 15dk için buz üzerinde kuluçkaya.
9. 20.000 x g , santrifüj 20 dk + 4 ° c Süpernatant yeni bir tüp içine toplamak. Protein konsantrasyonu bir seti kullanarak Bradford yöntemle ölçmek. Örnek arabellek, loril maltoside 2.8 adımda kullanılan birimin bir birimi ekleyin. Örnekleri-80 ° C'de 6 aya kadar muhafaza edilebilir.

3. BN-sayfa için degrade jel hazırlanması

1. Degrade jel BN-sayfa için oda sıcaklığında dökün. Degrade makinesi bir heyecan tabağa yerleştirin ve esnek boru peristaltik pompa ile bağlayın. İğne ile tüp için ayarla bir infüzyon iliştirin. Manyetik karıştırıcı degrade makinesi proksimal odanın içine yerleştirin. 10 dk için maksimum pompa hızda boru dH₂O ile yıkayın.
2. Boş tüp ve degrade makinesi. Bir damlalıklı degrade maker'ın odaları arasında kanal herhangi bir artık dH₂O kaldırmak için kullanın. Kanal ve boru vana ile kapatın.
3. Döküm çerçeve ve kelepçeler kullanılarak iki cam tabak altındaki bir delik vardır, tutucu, montajı ve kürsüye yerleştirin. Bu daha fazla veya daha az su dengesi ile düz bir yüzey üzerinde olduğundan emin olun. Yer iğne tüp cam plakanın arasında bağlı.
4. %6 ve %15 jel çözümleri (Tablo 2) hazırlayın. Buz üstünde tutun. Amonyum Persülfat (APS) ve tetramethylenediamine (TEMED) (başlıyorlar polimerizasyon) eklemek son. Yavaşça hava önüne geçmek için Mix kabarcıklar.
5. Degrade-jel-Mikser boru Odası % 6 jel ile proksimal sonuna ve % 15 jel distal ucu yük. Jel hacmi cam plakanın arasında ayıran jel hacmi eşit olması gerekir. Böylece, 2.6 mL % 6 jel ve 2.1 mL % 15 jel degrade jel Mixer bir 8.3 cm x 7,3 büyüklüğünde cm jel için kullanın.
6. Manyetik karıştırıcı geçin ve boru ve degrade maker'ın odaları arasında bir kanal açın. Hemen 5 mL/dk. peristaltik pompa geçiş cam plakanın doldurun ve kabarcıklar jel girmek için izin vermez. Tüp yok jel iğneyi çıkarın.
7. Yavaşça dH₂O. tutmak için en az 1 h polimerizasyon için oda sıcaklığında jel ile jel kaplama.
8. Hemen jel dökme sonra yıkama tüp degrade chambers dH₂ile O doldurma ve maksimum hızda peristaltik pompa kullanarak. İki ve daha fazla jelleri hazırlanırken, her zaman temiz belgili tanımlık sistem arasında.
9. 3 x jel arabellek 3 mL karıştırarak 1 x jel arabellek hazırlamak ve dH₂O. Kaldır dH₂O 6 mL jel filtre kağıdı ile yüzeyinden yavaşça ekleyin. Jel 1 x jel tampon ile yüzey yıkamak. 1 x jel arabellek filtre kağıdı ile yavaşça çıkarın.
   1. Jel filtre kağıdına lifleri kaçının. Bunu sağlamak için kağıt küçük parçalara makasla kes ama kağıt gözyaşı değil.
10. Tarak cam plaka arasındaki yeri, ama bu tamamen tarak altında yığın jel dökmek edebilmek için sokmak değil. Jel (Tablo 2) istifleme %4 hazırlayın. APS ve TEMED eklemek son polimerizasyon kolayca Başlarken. Yavaşça kaçınarak hava kabarcıkları karıştırın.
11. Tarak koltuğunuza uzanın ve kabarcıklar tarak altında kaçınarak yığın jel kaplama. Let yığın jel polimerize için en az 30 dk tarak kaldırın ve wells ile 1 x jel arabelleği bir damlalıklı kullanarak yıkayın.
    1. Polimerizasyon sonra jel 4 ° C'de birkaç gün saklanabilir. Jel depolamak için dH₂O ve plastik ile batırılmış kağıt jel şal jel kurutma önlemek için film.

4. mavi yerli Jel Elektroforez

Not: OXPHOS bozulma önlemek için kompleksleri Elektroforez 4 ° C'de çalıştırın Önceden soğutulmuş arabelleklerini kullan.

1. Mavi katot arabelleği ile jel kaset kuyu dibine kadar yük. Kaset dön doldurulmamış örnekleri yükleme kolaydır. Mavi katot arabellek Wells'le yıkama ve sonra kuyu mavi katot arabelleği damlalıklı kullanarak doldurun.
2. Örnekleri (5-30 µg protein) kuyu yükleyin. Yavaşça jel kaset üst mavi katot tampon ve anot arabellek ile tank ile doldurun.
3. 15dk için jel 40 V sabit bir gerilim çalıştırın. 80 V voltajı yükseltin (veya 6 sabit bir geçerli olanı kullan mA), 10 aşmamak anne. Jel Boya 2/3 jel uzunlukta ulaşıncaya kadar çalıştırın.
4. Mavi katot arabellek katot arabellek ile değiştirin ve boya açık tükendi kadar Elektroforez devam edin. Toplamda, Elektroforez yaklaşık 3 saat sürer.
5. Cam plakanın almak ve yarı kuru Blot tarafından polivinilidin florid (PVDF) membran proteinleri aktarın. Bir 30 dk için 1,0 için sınırlı bir akım ve 25 V sabit voltaj kullanın.
   1. Alternatif olarak, ıslak kurutma OXPHOS kompleksleri PVDF membran için aktarmak için kullanın.
6. Standart immunoblotting protokolüne göre membran ve antikor kuluçka engelleme ile devam edin. OXPHOS kompleksleri altbirimden karşı birincil antikor sırayla kullanın.
   Not: Örneğin, anti-NDUFA9 antikor (1:2000) için karmaşık kullanın. ben anti-SDHA antikor (1:2000) karmaşık II, anti-UQCRC2 antikor (1: 1000) karmaşık III, anti-COX1 antikor (1:2000) karmaşık IV ve anti-ATP5A antikor (1:2000) karmaşık V için için için için. Antikorlar listesi Tablo reçetesisunulur.

Sonuçlar

BN-sayfasını kullanarak, mitokondriyal OXPHOS kompleksleri derleme hataları soruşturma olmaktır. Şekil 1a solunum zinciri kompleksleri Meclisi hücrelerdeki özellikle mtDNA kodlanmış OXPHOS alt birimleri çeviri engeller kloramfenikol ile tedavi insan Nöroblastom (SH-SY5Y) gösterir. Kloramfenikol tükenmiş mitochondrially kodlanmış alt birimleri bulunan OXPHOS kompleksleri (karmaşık ı, III, IV; Şekil Sadece nükleer genler tarafından kodlanır, karmaşık II compensatorily upregulated iken 1A). Karmaşık V immunoblotted burada değildi.

Birden çok donma-çözülme döngüsü OXPHOS kompleksleri yok. Şekil 1B OXPHOS kompleksleri bozulması donma-çözülme döngüsü tarafından gösterilmiştir. Birden çok donma-çözülme çevrimleri uğramıştır mitokondrial solunum kompleksleri örnek 3 daha düşük bir bant yoğunluk var ve yalnızca bir kez dondurulmuş olduğunu aynı örnekleri ile karşılaştırıldığında kaydırılacağı. Şekil 1B uncropped western blot görüntüsünü ek Şekil 1' de gösterilmiştir.

Jel kalitesini keskin ve net bantları için önemlidir. Şekil 1 C de polimerize değil bir jel üzerinden bir immunoblot gösterir. Membran sıyırma OXPHOS kompleksleri algılanması da etkileyebilir. Şekil 1 Dkarmaşık ben önce striptiz sonra tespit edildi ya da. Sinyal-gürültü oranı sıyırma sonra çok daha düşüktür.

Şekil 1. başarılı ve alt-optimal deneyler üzerinden BN-sayfa immunoblots. (A) OXPHOS tükenmesi kompleksleri inhibitörü mitokondrial çeviri tarafından. İnsan Nöroblastom hücreleri (SH-SY5Y) 48 saat boyunca kloramfenikol (CAP) ile tedavi edildi. CTRL, kontrol hücreleri kloramfenikol tedavi olmadan. Alt paneli immunoblot miktar gösterir. Denetimin değeri 1 (kesikli çizgi gösterilir) olarak kabul edilir. Veri ± SD, demek gibi sunulmaktadır n = 3, * P < 0,0001 denetimini kullanarak karşılaştırıldığında unpaired bir öğrenci t-testleri. (B) bozulma OXPHOS kompleksleri tarafından birden çok donma-çözülme çevrimleri. Örnek 1-3 insan osteosarkom hücreleri (143B) aynı koşullarda hazırlanmıştır. Örnekleri sayısı 1 ve 2 donmuş ve örnek sayısı 3 dört donma-çözülme çevrimleri uygulandı ise yalnızca bir kez, erimiş. HEK293 hücreleri izole OXPHOS kompleksleri (C) BN-sayfa immunoblots. Bantları bulaşması jel düşük kaliteli tarafından nedeniyle oluşur. (D) OXPHOS kompleksleri algılamayı sıyırma etkisi. Algılama kompleks ben hücrelerdeki insan Nöroblastom (SH-SY5Y) önce ve sonra aynı membran soyma. OXPHOS kompleksleri anti-NDUFA9 antikor kullanarak algılandı (karmaşık ben), anti-SDHA antikor (karmaşık II), anti-UQCRC2 antikor (karmaşık III) ve anti-COX1 antikor (karmaşık IV). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Arabellek veya çözüm	Kompozisyon	Tarifi
3 x jel arabellek	1,5 M aminocaproic asit	aminocaproic asit 3,94 g
	150 mM Bis-tris	Bis-tris 0,63 g
	dH2O	DH2O 20 mL için eklemek
	pH 7,0	7.0 pH ayarlama
Katot arabellek	15 mM Bis-tris	Bis-tris 3.14 g
	50 mM tricine	tricine 8.96 g
	dH2O	DH2O 1000 mL için eklemek
	pH 7,0	7.0 pH ayarlama
Mavi katot arabellek	%0,02 coomassie mavi G	Serva mavi g 0,04 g
	15 mM Bis-tris	Katot arabellek 200 mL
	50 mM tricine
	dH2O
	pH 7,0
Anot arabellek	50 mM Bis-tris	20.93 g
	dH2O	DH2O 2000 mL için eklemek
	pH 7,0	7.0 pH ayarlama
Mitokondrial arabellek	1.75 M aminocaproic asit	3 x jel arabellek 0.5 mL
	75 mM Bis-tris	2 M aminocaproic asit 0.5 mL
	2 mM EDTA	500 mm EDTA 4 µL
	dH2O	-
	pH 7,0	-
Örnek arabellek	750 mM aminocaproic asit	2 M aminocaproic asitin 0,94 mL
	%5 comassie mavi G	Serva mavi g 0,125 g
	dH2O	DH2O 2.5 mL için eklemek
2M aminocaproic asit	2 M aminocaproic asit	aminocaproic asit 2.62 g
	dH2O	DH2O 10 mL için eklemek

Tablo 1. Arabellekleri ve BN-sayfa için kullanılan çözümler.

Mavi yerli jelleri	% 6 jel ayıran	% 15 jel ayıran	Yığın %4 jel
3 x jel arabellek	3.3 mL	3.3 mL	1,64 mL
% 40 akrilamid/Bis 37.5:1	1,5 mL	3.75 mL	0.5 mL
dH2O	5.14 mL	0,93 mL	2,77 mL
Gliserol	0	2 mL	0
% 10 amonyum Persülfat *	60 ΜL	10 ΜL	60 ΜL
TEMED	4 ΜL	2 ΜL	6 ΜL
Toplam hacim	10 mL	10 mL	5 mL
* Her zaman taze % 10 amonyum Persülfat dH2içinde O olun

Tablo 2. BN-sayfa için yemek tarifleri jel.

Takıma giren Şekil 1. uncropped western blot görüntüsünü Şekil 1B. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Protokolü'nün en önemli parçalarından biri olduğu gibi OXPHOS kompleksleri numune hazırlama sırasında depolama korumak ve Elektroforez jel etmektir. Bu nedenle, mitokondri 4 ° C'de yalıtılması gerekir ve örnekleri donma-çözülme çevrimleri geçmesi değil. OXPHOS kompleksleri sadece bir donma-çözülme döngüsü tüm prosedürü sırasında tolere edebilir. Birden çok donma-çözülme döngüsü OXPHOS kompleksleri (Şekil 1B) yok. Kontrol ve deney örnekleri karşılaştırılacak olan paralel olarak yanıltıcı sonuçlar verebilir saklama koşulları tüm farklılıkları önlemek için hazırlanmalıdır. Tüm örnekleri ile paralel iletişim kuralının tüm adımları gerçekleştirmek mümkün değilse, biz yıkanmış hücre granül-80 ° c (adım 1.4 bu protokolü) donma ve daha sonra tüm örnekleri için protokol geri kalanını birlikte en az jel elec kadar gerçekleştirmek için tavsiye trophoresis. Elektroforez cihazları (tank, kaset) temizlik için özel dikkat. SDS-sayfa için aynı aparat kullanılıyorsa, çok iyi BN-sayfa önce yıkayın. Herhangi bir kalıntı SDS OXPHOS kompleksleri ayrılma Elektroforez sırasında neden olabilir.

Yüksek kaliteli degrade jelleri protokolün kritik bir parçası vardır. Prekast jelleri mavi yerel sayfa için ticari olarak kullanılabilir; Ancak, onları kullanmadan önce ticari tırnaklar için jeller kullanılan arabellekleri örnek arabelleklerinden farklı bir kompozisyon olabilir tavsiye edilmez. Burada kullanılan jel (6-%15) degrade bireysel OXPHOS kompleksleri ayrılması için en iyi yöntemdir. Üst düzey OXPHOS, olarak da bilinen solunum zinciri supercomplexes¹⁴, supramolecular yapıları algılamak için bazı optimizasyon gerekli¹¹yaşında.

OXPHOS görselleştirme için kompleksleri özel antikorlar sırayla, özelliklerine göre kullanın. Örneğin, önce en zayıf sinyal ve en güçlü sinyali ile antikor son verir antikor kullanın. Bu önemli çünkü sıyırma algılama (Şekil 1 d) zayıflatır. BN-sayfa sonra ikinci boyutu SDS-sayfa¹⁵jel tabi tutulur Eğer solunum zinciri kompleksleri bileşimi soruşturma olmaktır.

Burada açıklanan protokol bireysel OXPHOS kompleksleri karşı antikor sırayla kullanarak önerir. Bununla birlikte, piyasada bulunan OXPHOS antikor kokteyl aynı anda tüm beş OXPHOS kompleksleri algılamak için kullanılabilir. Yine de, eksik olarak monte OXPHOS kompleksleri algılamak ve kimliklerini tanımlamak edebilmek için bireysel OXPHOS kompleksleri karşı antikor ardışık olarak kullanılmalıdır. Bu adım zaman alır; Ancak, yeni deneysel koşullar ve modelleri sınamak için temel olabilir.

Mitokondrial yalıtımı için kullanılan digitonin konsantrasyonu belirli hücre türü için optimize edilmelidir. Bir deterjan hücre zarları digitonin permeabilizes. Digitonin en iyi konsantrasyon verimli bir şekilde mitokondrial membranlar dokunmadan hücrelerinin plazma zarı permeabilizes. Çok yüksek konsantrasyon mitokondrial membranlar zarar ve toplam mitokondrial verim azaltır süre digitonin çok düşük konsantrasyon mitokondrial özler yüksek kirlilik neden olur. En uygun digitonin/protein oranı (g/g) 0,3 1 olarak değişir. Western blot Analizi granül ve supernatants çıkarılan proteinlerin en iyi konsantrasyon digitonin¹⁶test etmek için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı immunoblot üzerindeki yükleme protein içermez; Bu nedenle, ayıklanan kompleksleri protein konsantrasyonu dikkatle en az eşit yükleme sağlamak için triplicates içinde ölçülmelidir. Buna ek olarak, örnekleri BN-sayfa içinde çoğaltır içinde çalıştırabilirsiniz. Seçici OXPHOS kompleksleri Meclisi Engelli ise, etkilenmemiş kompleksleri denetimleri yükleme olarak hizmet verebilir.

BN sayfasındaki protein kompleksleri moleküler kütlesi tahmini¹⁸meydan okuyor. Geçerli Protokolü moleküler ağırlık işaretçiyi içermez; Bu nedenle, OXPHOS kompleksleri Meclisi tahmin etmek için etkilenmemiş kompleksleri içeren kontrol örnekleri her zaman Analize dahil edilmelidir. BN-sayfa kontrol örnekleri genellikle tedavi edilmemiş veya vahşi türü hücrelerdir.

Burada sunulan Yöntem mitokondrial solunum zinciri kompleksleri tespiti için optimize edilmiştir; Ancak, aynı zamanda Oligomerizasyonda mitokondrial proteinler¹⁹değerlendirme için uygulanabilir. Buna ek olarak, OXPHOS kompleksleri derleme oranı kloramfenikol ve kloramfenikol¹⁰çıkarıldıktan sonra onların kurtarma takip ederek ilk tüketen mitokondrial kodlanmış alt birimi içeren kompleksleri tarafından okudu olabilir. Böylece, BN-sayfa kararlı durum düzeyleri ve OXPHOS Meclisi insan mitokondrial bozukluklar^9,11Moleküler diagnostik dahil olmak üzere farklı uygulamaların değerlendirmek için kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mm hücre plakaları	Thermo Fisher Scientific	130182
%40 Akrilamid/Bis 37.5:1	Bio-Rad	161-0148
Aminokaproik asit	Sigma	A2504
Amonyum persülfat	Sigma	A3678
Anti-ATP5A	Abcam	14748	Kompleks V alt birimi
Anti-MTCOI	Abcam	14705	Kompleks VI alt birimi
Anti-NDUFA9	Abcam	14713	Kompleks I alt birimi
Anti-SDHA	Abcam	14715	Kompleks II alt birimi
Anti-UQCRC2	Abcam	14745	Kompleks III alt birimi
Bis-tris	Sigma	B7535
Bradford protein test kiti	BioRad	5000006
Hücre sıyırıcılar	Fisher	11597692
Coomassie blue G250 (Serva Blue G)	Serva	35050
Digitonin	Sigma	D141
DMEM	Lonza	12-614F/12
EDTA	Yaşam Teknolojileri	15575-038
FBS	Yaşam Teknolojileri	10270106
Fetal sığır serumu	Yaşam	Gliserol 10270106
	Teknolojiler (Sigma	G5516
Gradyan yapıcı	Bio-Rad	1654120
Lauryl maltoside (n-Dodesil ve beta;-D-maltosit)	Sigma	D4641
L-glutamin	Yaşam Teknolojileri	25030024
L-glutamin	Gibco	25030
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Sigma	T9281
PBS	Yaşam Teknolojileri	BE17-516F
Penisilin / Streptomisin	Lonza	17-602E
Penisilin / streptomisin	Gibco	15140
Güç kaynağı	GE Healthcare	EPS 301
Proteaz inhibitörleri	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
Tripsin-EDTA	Gibco	15400054
Dikey elektroforez cihazı	BioRad	1658004